王秉鈞，王先坤，晏波，李紹平

蘭州大學第二醫(yī)院急救中心，甘肅 蘭州，730030

β-欖香烯對人胰腺癌Panc-1細胞凋亡的影響

王秉鈞，王先坤，晏波，李紹平

蘭州大學第二醫(yī)院急救中心，甘肅 蘭州，730030

目的觀察β-欖香烯對人胰腺癌Panc-1細胞凋亡的影響，探討其作用機制。方法β-欖香烯濃度設置為10、20、40、80、160 μg/mL，作用于體外培養(yǎng)的Panc-1細胞24、48、72 h。臺盼藍拒染法檢測Panc-1細胞抑制率；TUNEL法檢測Panc-1細胞凋亡；Hoechst33258熒光染色觀察Panc-1細胞核變化；ELISA檢測Panc-1細胞Caspase-3、8、9活性；Western blot檢測Panc-1細胞Fas、FasL、細胞色素C（Cyt c）、凋亡誘導因子（AIF）蛋白表達。結果與對照組比較，β-欖香烯作用Panc-1細胞24、48、72 h，Panc-1細胞抑制率明顯增加（P＜0.05，P＜0.01），細胞凋亡率明顯增加（P＜0.01，P＜0.001），并呈時間/濃度依賴性；β-欖香烯作用Panc-1細胞72 h，Panc-1細胞核可見明顯碎裂，染色質(zhì)濃縮，呈強藍色熒光，形成凋亡小體；β-欖香烯作用Panc-1細胞48 h，Caspase-3、8、9活性明顯增加（P＜0.05，P＜0.01），F(xiàn)as、FasL、Cyt c及AIF蛋白表達明顯增強（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001）。結論β-欖香烯能夠抑制 Panc-1細胞增殖、誘導細胞凋亡，其可能激活細胞內(nèi)死亡受體途徑及線粒體凋亡途徑發(fā)揮抗腫瘤作用。

β-欖香烯；胰腺癌；Panc-1細胞；細胞凋亡

雖然胰腺癌發(fā)病率僅占所有癌癥的 2.8%，但其侵襲性強、預后差、死亡率高［1］。欖香烯是從姜科植物溫郁金中提取的有效成分。β-欖香烯注射液是由我國自行研發(fā)的抗腫瘤藥物，其抗腫瘤作用主要機制包括誘導腫瘤細胞凋亡、阻滯細胞周期及放化療增敏作用、逆轉腫瘤細胞多藥耐藥、抗腫瘤轉移、提高機體免疫力等［2］。由于β-欖香烯具有抗腫瘤譜廣、作用高效、毒副作用小等特點［3］，臨床上已用于膠質(zhì)瘤、乳腺癌、肝癌、卵巢癌、胃癌、大腸癌等惡性腫瘤的治療。本實驗以胰腺癌Panc-1細胞株為模型，觀察 β-欖香烯對Panc-1細胞凋亡的影響，探討其作用機制。

1　實驗材料

1.1細胞

人胰腺癌Panc-1細胞株，中國科學院上海細胞庫。

1.2藥物

β-欖香烯注射液，大連遠大制藥有限公司，批號140623-2。

1.3試劑

10%胎牛血清，DMEM培養(yǎng)基（GIBCO公司）；四甲基偶氮唑藍（MTT）、二甲基亞砜（DMSO）及臺盼藍染色檢測試劑盒，碧云天生物研究所；Caspase-活性檢測試劑盒，Hoechst33258染色液，武漢博士德生物制品有限公司；抗Fas、FasL、細胞色素C（Cyt c）及凋亡誘導因子（AIF）鼠抗抗體，美國 Santa Cruz公司。

1.4儀器

IX51熒光顯微鏡（日本Olympus 公司），Spectra Mr型全波長酶標儀（美國DYNEX公司），Z-323高速低溫離心機（德國HERMLE公司），EPICS XL流式細胞儀（美國COULTER公司）。

2　實驗方法

2.1細胞培養(yǎng)

Panc-1細胞用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基于37 ℃、5%CO2孵育箱中孵育，常規(guī)方法培養(yǎng)細胞。以對數(shù)生長期細胞用于實驗。

2.2臺盼藍拒染法檢測Panc-1細胞抑制率

實驗分為藥物組和對照組。當細胞生長至對數(shù)期時，棄去舊培養(yǎng)液，37 ℃預熱的PBS洗3次，0.25%胰酶消化，以新鮮培養(yǎng)液制細胞懸液，調(diào)整細胞密度5×104/孔，接種于96孔培養(yǎng)板，5%CO2、37 ℃細胞孵育箱中培養(yǎng) 24 h。棄去培養(yǎng)液，藥物組給予含 β-欖香烯的新鮮培養(yǎng)液，藥物終濃度為10、20、40、80、160 μg/mL。對照組予等體積新鮮培養(yǎng)液，每個濃度設置6個復孔。分別置孵育箱繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h。收集細胞，臺盼藍染色5 min，細胞計數(shù)板計數(shù)，計算細胞抑制率［（1-藥物組OD值÷對照組OD值）× 100%］。β-欖香烯濃度設置參考文獻［4］。所有實驗均重復3次。

2.3TUNEL法檢測細胞凋亡率

實驗分組、細胞接種及給藥方法同“2.2”項。取對數(shù)生長期Panc-1細胞接種于12孔板中，5%CO2、37 ℃孵育24 h，藥物組β-欖香烯終濃度為10、20、 40、80、160 μg/m，繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h，棄去培養(yǎng)液，PBS沖洗3次，0.25%胰酶消化，得細胞懸液，1500 r/min離心5 min，收集細胞，4%多聚甲醛固定1 h，用含0.1%Triton X-100 PBS重懸細胞，冰浴孵育5 min。按照試劑盒說明書采用流式細胞儀進行檢測。

2.4Hoechst33258熒光染色法觀察細胞核的變化

實驗分組、細胞接種及給藥方法同“2.2”項。取對數(shù)生長期Panc-1細胞接種于6孔板中，5%CO2、37 ℃孵育24 h，藥物組β-欖香烯終濃度為20、40、80 μg/mL的新鮮培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。收集細胞，分散制成細胞懸液。按照Hoechst33258熒光染色說明書進行染色，熒光顯微鏡下觀察細胞核的形態(tài)和熒光的強弱，采集圖像。

2.5ELISA檢測Caspase-3、8、9酶活性

實驗分組、細胞接種及給藥方法同“2.2”項。接種于6孔培養(yǎng)板的Panc-1細胞置于37 ℃、5%CO2條件下孵育24 h，藥物組β-欖香烯的終濃度為20、40、80 μg/mL，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。棄去培養(yǎng)液，4 ℃預冷PBS沖洗3次，加入適量裂解液冰浴30 min。細胞刮子刮下細胞，置預冷離心管中，4 ℃、20 000 r/min離心15 min，取上清液存于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｋ鶞y酶活性以Caspase活性增加的百分比表示（藥物組OD值÷對照組OD值×100%）。嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

2.6Western blot檢測Fas、FasL、細胞色素C及凋亡誘導因子蛋白表達

實驗分組、細胞接種及給藥方法同“2.2”項。細胞加入預冷的適量細胞裂解液（100～150 μL/孔，含蛋白酶抑制劑），冰浴裂解30 min，收集細胞，4 ℃、20 000 r/min離心25 min，取上清液，BCA法測定總蛋白濃度，-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?0%SDS-PAGE凝膠電泳后，轉移至PVDF膜，一抗Fas、FasL、Cyt c 及AIF抗體1∶1000稀釋，4 ℃過夜，二抗（1∶1000稀釋）室溫孵育2 h，ECL法顯色。

3　統(tǒng)計學方法

4　結果

4.1β-欖香烯對Panc-1細胞增殖的影響

不同濃度β-欖香烯作用Panc-1細胞24、48、72 h后，與對照組比較，藥物組Panc-1細胞抑制率明顯增加（P＜0.05，P＜0.01），并呈時間-濃度依賴性，兩者間無交互作用（P＞0.01）。結果見表1。

表1　各組Panc-1細胞不同時點Panc-1細胞抑制率比較（±s，%）

表1　各組Panc-1細胞不同時點Panc-1細胞抑制率比較（±s，%）

注：與對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

組別　n　濃度/（μg/mL）　24 h　48 h　72 h對照組　3　0　0　0　0藥物組　3　10　7.31　18.26　29.25*3　20　11.68*　29.65*　38.81*3　40　25.45*　40.57*　48.68**3　80　33.68**　50.32**　61.01**3　160　39.32**　57.61**　69.26**

4.2β-欖香烯對Panc-1細胞凋亡的影響

不同濃度β-欖香烯作用Panc-1細胞24、48、72 h后，與對照組比較，藥物組細胞凋亡率增加（P＜0.01，P＜0.001），并呈時間-濃度依賴，80、160 μg/mL β-欖香烯誘導作用相同時間細胞凋亡率差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。結果見表2。

表2　各組Panc-1細胞不同時點細胞凋亡率比較（±s，%）

表2　各組Panc-1細胞不同時點細胞凋亡率比較（±s，%）

注：與對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

組別　n 濃度/（μg/mL）　24 h　48 h　72 h對照組 3　0　5.38±1.36　5.94±0.90　6.79±1.32藥物組 3　10　5.35±0.99　10.26±1.25*18.56±1.29*3　20　8.32±1.01　21.18±2.18**33.40±3.24**3　40　15.66±1.13*　32.41±3.46**40.92±3.01**3　80　31.75±3.12*　40.09±3.75**51.28±3.63**3　160　30.29±4.62*　44.36±5.36**52.39±4.65**

4.3β-欖香烯對Panc-1細胞核形態(tài)的影響

經(jīng)Hoechst33258熒光染色后，熒光顯微鏡下可見對照組細胞核形態(tài)完整，呈弱藍色熒光；給予欖香烯作用Panc-1細胞72 h后，細胞核可見明顯碎裂，染色質(zhì)濃縮并致密濃染，呈強藍色熒光，伴有凋亡小體出現(xiàn)。隨著藥物濃度增大，細胞凋亡發(fā)生更加明顯。結果見圖1。

4.4β-欖香烯對Panc-1細胞Caspase-3、8、9活性的影響

Caspase-3、8、9均是細胞凋亡過程中關鍵的Caspase，20、40、80 μg/mL β-欖香烯作用Panc-1細胞48 h后，Caspase-3、8、9活性均顯著增加（P＜0.05，P＜0.01）。結果見表3。

圖1　各組Panc-1細胞核病理形態(tài)（Hoechst33258熒光染色，×200）

表3　各組Panc-1細胞Caspase-3、8、9活性比較（±s）

表3　各組Panc-1細胞Caspase-3、8、9活性比較（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

4.5β-欖香烯對Panc-1細胞Fas、FasL、細胞色素C及凋亡誘導因子蛋白表達的影響

20、40、80 μg/mL β-欖香烯作用Panc-1細胞48 h后，與對照組比較，Panc-1細胞Fas、FasL、Cyt c及AIF蛋白表達明顯增強（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001）。結果見圖2、表4。

圖2　各組Fas、FasL、Cyt c及AIF蛋白表達免疫印跡電泳圖

表4　各組Panc-1細胞Fas、FasL、Cyt c及AIF蛋白表達比較（±s）

表4　各組Panc-1細胞Fas、FasL、Cyt c及AIF蛋白表達比較（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001

對照組　3　0　0.98±0.11　0.67±0.11　1.13±0.25　0.95±0.08藥物組　3　20　1.75±0.23*　1.64±0.65**　1.98±0.65**　1.29±0.41*3　40　3.44±0.45**　4.93±0.73**　2.45±0.74**　2.67±0.91**3　80　5.86±1.18***　7.54±0.82***　4.65±0.64**　4.36±0.70**組別　n　濃度/（μg/mL）　Fas　FasL　Cyt c　AIF

5　討論

由于β-欖香烯廣譜、高效、低毒等特點，目前臨床上應用于多種惡性腫瘤的治療。研究表明，β-欖香烯具有直接抗腫瘤作用，體內(nèi)外均能夠抑制肺癌細胞DNA、RNA的合成，從而抑制腫瘤細胞增殖，此作用具有一定的時間和濃度依賴性［5］。毛氏等［6］研究發(fā)現(xiàn)，β-欖香烯通過下調(diào)人肝癌 HepG2細胞內(nèi)微管蛋白，從而抑制細胞內(nèi)微管的聚合，發(fā)揮增殖抑制作用。本研究發(fā)現(xiàn)，不同濃度的β-欖香烯注射液作用Panc-1細胞24、48、72 h后，均有顯著的增殖抑制作用。

除抗腫瘤作用外，誘導腫瘤細胞凋亡是β-欖香烯重要的抗腫瘤作用機制之一。有研究發(fā)現(xiàn)，β-欖香烯作用于膠質(zhì)瘤U87細胞后，經(jīng)流式細胞儀分析，可將細胞周期阻滯于G1/S期，此外Fas和FasL的mRNA和蛋白表達水平上升，表明 β-欖香烯通過調(diào)節(jié)Fas/FasL信號通路抑制膠質(zhì)瘤細胞增殖并誘導凋亡。通過TUNEL法檢測細胞凋亡實驗發(fā)現(xiàn)，不同濃度β-欖香烯注射液作用24、48、72 h后能顯著誘導Panc-1細胞凋亡；再通過Hoechst33258染色，熒光顯微鏡下觀察到細胞核碎裂濃染，染色質(zhì)濃縮，伴有凋亡小體出現(xiàn)。但是，筆者發(fā)現(xiàn)，80、160 μg/mL β-欖香烯注射液在作用相同時間時誘導的凋亡率之間無明顯差異，可能是β-欖香烯誘導腫瘤細胞凋亡的作用與藥物濃度并不是簡單的線性關系。當藥物達到一定濃度時，腫瘤細胞其他死亡方式如壞死增多，β-欖香烯誘導的程序性死亡即凋亡減少［2］。

有研究發(fā)現(xiàn)，欖香烯能促進人胃癌SCG-7901細胞凋亡，其機制與調(diào)節(jié)ERK/P38/MAPK信號通路表達有關［7］；有研究顯示，β-欖香烯可能通過調(diào)節(jié)Fas/FasL信號通路抑制膠質(zhì)瘤細胞的增殖并誘導凋亡［8-9］。在哺乳動物細胞內(nèi)存在2條經(jīng)典的凋亡途徑：死亡受體途徑和線粒體凋亡途徑。Fas是一種跨膜蛋白，屬于腫瘤壞死因子受體超家族成員，在死亡受體途徑中，F(xiàn)as受體與Fas結合后，F(xiàn)as受體胞漿區(qū)的死亡域發(fā)生多聚化使Fas活化，活化的Fas與Fas相關死亡結構域蛋白（FADD）連接，F(xiàn)ADD另一端與無活性的Caspase-8酶原發(fā)生交聯(lián)，從而激活Caspase-8，活化的Caspase-8可以剪切并活化Caspase-3、9及其他 Caspase，進而引起隨后的級聯(lián)反應，最終導致了細胞凋亡的發(fā)生。

Cyt c是第1種被發(fā)現(xiàn)的線粒體釋放促凋亡蛋白。線粒體凋亡途徑中，Cyt c從線粒體釋放是細胞凋亡的關鍵步驟，這是線粒體外膜通透性增高的結果［10］。釋放到細胞漿的Cyt c與凋亡相關因子1結合并將其激活，使其形成多聚體，并促使Caspase-9與其結合形成凋亡小體，Caspase-9被激活，其進一步激活下游的 Caspase-3，介導細胞凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)，20、40、80 μg/mL β-欖香烯作用Panc-1細胞48 h后，Caspase-3、8、9活性均顯著增加，F(xiàn)as、FasL、Cyt c、AIF蛋白表達明顯增強，這可能是 β-欖香烯誘導Panc-1細胞凋亡從而發(fā)揮抗腫瘤作用的機制之一。

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Effects of β-Elemene on Apoptosis of Human Pancreatic Cancer Panc-1 Cells

WANG Bing-jun，WANG Xian-kun， YAN Bo， LI Shao-ping
（Emergency Center， The Second Hospital of Lanzhou University， Lanzhou 730030， China）

Objective To investigate the effects of β-Elemene on the apoptosis of human pancreatic cancer Panc-1 cells； To discuss its mechanism of action. Methods β-Elemene （10， 20， 40， 80， 160 μg/mL） were incubated to the Panc-1 cells in vitro cultured for 24 h， 48 h and 72h， and trypan blue refusal method was used to detect cell inhibition rate；Apoptosis rate was measured by TUNEL； Hoechst33258 fluorescent staining was used to observe the changes of the nucleus. The activity of Caspase-3， 8 and 9 were detected by ELISA. Western blot was used to detect the expressions of Fas， FasL and Cyt c and AIF. Results The activity of Panc-1 cells was obviously inhibited time/concentration dependent inhibition （P＜0.05， P＜0.01）， and the apoptosis rate increased after incubated with β-Elemene （P＜0.01，P＜0.001） after incubated with β-Elemene for 24 h， 48 h and 72 h； After giving β-Elemene 72 h， Panc-1 cells nucleus were broken obviously， and chromatin condensed and showed strong blue fluorescence， along with of apoptotic bodies； After incubated with β-Elemene for 48 h， Caspase-3， 8 and 9 activity significantly increased （P＜0.05，P＜0.01）； protein expressions of Fas， FasL， Cyt c and AIF were significantly enhanced （P＜0.05， P＜0.01， P＜0.001）. Conclusion β-Elemene can inhibit Panc-1 cell proliferation， induce apoptosis， and the mechanism may be related to activating cell death receptor pathway and mitochondrial apoptosis pathway to play anti-tumor effects.

β-Elemene； pancreatic cancer； Panc-1 cells； cell apoptosis

R285.5

A

1005-5304（2016）10-0078-04

2015-12-07）

（

2015-12-30；編輯：華強）

甘肅省自然科學基金（1506RJZA251）；蘭州市科技計劃項目（2012-1-32）

李紹平，E-mail：lzulsp@163.com

DOl：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.10.018