張宇虹

(河南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 河南　新鄉(xiāng)　453007)

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重金屬鉻(Cr6+)脅迫對(duì)地黃幼苗生長(zhǎng)影響的研究

張宇虹

(河南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 河南新鄉(xiāng)453007)

本研究以懷地黃苗為材料，采用組織培養(yǎng)法，探究了不同Cr6+濃度及脅迫時(shí)間對(duì)其幼苗株高、根莖葉生長(zhǎng)狀況及生物量、死亡率的影響。結(jié)果表明：在給定脅迫時(shí)間下，低濃度的Cr6+(0.5 mmol/L)對(duì)懷地黃幼苗生長(zhǎng)表現(xiàn)出一定的促進(jìn)作用，鮮重、干重、根長(zhǎng)、葉片數(shù)量呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，而高濃度Cr6+對(duì)幼苗生長(zhǎng)表現(xiàn)出明顯的抑制作用。懷地黃幼苗在1 mmol/L Cr6+濃度下仍可以較好地生長(zhǎng)，可見地黃對(duì)重金屬鉻毒害的抵抗能力較強(qiáng)。

鉻(Cr6+)脅迫；懷地黃幼苗；組織培養(yǎng)；生長(zhǎng)

近年來，我國的重金屬污染日趨嚴(yán)重，分布范圍極其廣泛。經(jīng)濟(jì)的飛速發(fā)展使得許多工礦企業(yè)迅速猛增，如金屬冶煉、機(jī)械加工、化工廠、農(nóng)藥廠等。這些高污染工業(yè)基地排出了大量的工業(yè)污水、礦渣、粉塵等，使得重金屬進(jìn)入到土壤、河流和環(huán)境當(dāng)中，重金屬污染日益嚴(yán)重[1]。土壤重金屬污染可影響農(nóng)作物及中草藥產(chǎn)量和質(zhì)量，并可通過食物鏈危害人類的健康。懷地黃是河南焦作(古懷慶府)地方特產(chǎn)，因地下部分的塊根呈現(xiàn)黃白色而得名，其塊根為傳統(tǒng)中藥亦是著名的四大懷藥之一。焦作市是河南省著名的老工業(yè)基地，礦業(yè)、制革工業(yè)、電化學(xué)工業(yè)發(fā)達(dá)，工業(yè)發(fā)展勢(shì)頭迅猛的同時(shí)重金屬污染尤為嚴(yán)重。重金屬鉻作為工業(yè)五毒之一，在焦作市礦區(qū)內(nèi)長(zhǎng)期堆積、風(fēng)化遷移，是焦作地區(qū)土壤重金屬污染的重要來源之一。而制革工業(yè)是一個(gè)污染嚴(yán)重的產(chǎn)業(yè)，鉻因能使皮革柔軟富有彈性而被視為制革工業(yè)中不可缺少的皮革鞣劑。此外六價(jià)鉻還常在電化學(xué)工業(yè)中作為鉻酸使用。

鉻是一種強(qiáng)毒性重金屬，在人體內(nèi)蓄積不能被降解，進(jìn)入人體細(xì)胞后會(huì)對(duì)肝、腎等內(nèi)臟器官和遺傳物質(zhì)造成傷害，使蛋白質(zhì)和酶等失去活性并可能誘發(fā)基因突變，甚至致癌。目前，關(guān)于鉻對(duì)水稻[2-3]、玉米[4-5]、豆類[6-7]等多種植物的出芽及根生長(zhǎng)發(fā)育的影響及其毒害機(jī)理已有報(bào)道，但鉻對(duì)中藥地黃的生長(zhǎng)發(fā)育影響至今尚無研究報(bào)道。作為藥用價(jià)值主要在根部的懷地黃，鉻污染對(duì)懷地黃生長(zhǎng)影響的研究有著重要意義。

本研究中，我們以懷地黃85-5品種的無菌苗為材料在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行組培，研究了不同濃度鉻(Cr6+)對(duì)懷地黃幼苗生長(zhǎng)的影響，為初步改善懷地黃的產(chǎn)量和品質(zhì)、早期預(yù)報(bào)工業(yè)鉻污染的危害、有效利用鉻污染土壤以及確定其對(duì)鉻的耐受能力等提供了有用的參考資料。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料和處理

供試材料為實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的85-5地黃無菌苗，取其莖段接種于MS培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)室中培養(yǎng)35天后取生長(zhǎng)狀況相對(duì)一致的幼苗莖段進(jìn)行鉻脅迫處理。以MS為基本培養(yǎng)基，蔗糖濃度為3%，瓊脂濃度為0.6%，pH值為5.8～6.2，在培養(yǎng)基中添加不同質(zhì)量的重鉻酸鉀進(jìn)行處理，培養(yǎng)室溫度為25±1℃，光照強(qiáng)度為2 000 Ix，光照時(shí)間為14 h/d，RH=70%～80%。培養(yǎng)基中六價(jià)鉻離子濃度(鉻離子濃度以純鉻計(jì))梯度設(shè)為0、0.5、1、2、3和5 mmol/L(其中0為對(duì)照組)共6個(gè)處理，每個(gè)處理3瓶，每瓶接5株幼苗。全程觀察記錄其生長(zhǎng)變化情況，并在第21天取材測(cè)量其生長(zhǎng)指標(biāo)。

1.2測(cè)定方法

株高測(cè)量是從莖基部一直測(cè)量到苗頂端，葉的測(cè)量是取每株幼苗的三個(gè)最大葉片測(cè)量后計(jì)算平均值，葉長(zhǎng)取葉片的主脈長(zhǎng)度，葉寬取葉片最寬處的長(zhǎng)度，葉面積以葉長(zhǎng)×葉寬表示。根長(zhǎng)測(cè)量是取每株幼苗的三條最長(zhǎng)根測(cè)量后計(jì)算平均值。根、莖、葉各組分分開分別測(cè)定鮮質(zhì)量，然后于烘箱中105℃烘5小時(shí)后測(cè)干質(zhì)量。由于3 mmol/L和5 mmol/L處理的幼苗脅迫21天時(shí)已經(jīng)死亡，故只對(duì)其生物量進(jìn)行了測(cè)量。

1.3數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用Excel 2010統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析。對(duì)于同組間數(shù)據(jù)的三次重復(fù)觀測(cè)分別計(jì)算平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。對(duì)于處理組，則用學(xué)生t檢驗(yàn)方法分別計(jì)算其與對(duì)照組差異的顯著性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果通過origin軟件作圖。

2　結(jié)果與分析

2.1Cr6+濃度和脅迫時(shí)間對(duì)懷地黃幼苗生長(zhǎng)的總體影響

為研究Cr6+對(duì)地黃生長(zhǎng)的影響，我們將地黃分為6組分別給予不同濃度的Cr6+進(jìn)行培養(yǎng)，并檢測(cè)不同Cr6+濃度和脅迫時(shí)間對(duì)懷地黃幼苗株高的影響。如圖1所示，當(dāng)Cr6+濃度低于2 mmol/L時(shí)，在脅迫的第1天到第10天對(duì)懷地黃幼苗生長(zhǎng)無明顯影響。到脅迫的第21天，0.5 mmol/L、1 mmol/L處理的幼苗株高分別為對(duì)照的96.1%、86.2%。當(dāng)Cr6+濃度為2 mmol/L時(shí)，幼苗生長(zhǎng)受到抑制，在第21天Cr6+濃度為2 mmol/L組株高為對(duì)照65.4%，極顯著低于對(duì)照組(p=0.005<0.01)，葉片枯萎率為42.2%，幼苗死亡率為20%；當(dāng)Cr6+濃度達(dá)到3 mmol/L時(shí)，懷地黃幼苗在整個(gè)過程中幾乎無生長(zhǎng)，幼苗死亡率為100%。

圖1　Cr6+脅迫條件下懷地黃幼苗生長(zhǎng)狀況

(A)不同Cr6+濃度處理?xiàng)l件下，植株第6、10、21天的生長(zhǎng)狀況采樣。(B)不同Cr6+濃度處理對(duì)懷地黃幼苗株高的影響(第21天)(星號(hào)表示與對(duì)照組的差異顯著性。*：差異顯著；**：差異極顯著)。(C)不同Cr6+濃度脅迫條件下懷地黃幼苗的葉片枯萎率(第21天)。(D)不同Cr6+濃度脅迫條件下懷地黃幼苗的死亡率(第21天)。

2.2Cr6+濃度和脅迫時(shí)間對(duì)懷地黃幼苗根部的影響

地黃幼苗的根部決定地黃塊根的生物量，因而我們檢測(cè)了不同Cr6+濃度和脅迫時(shí)間對(duì)地黃幼苗根部的影響。當(dāng)Cr6+濃度小于2 mmol/L時(shí)，第1天到第10天懷地黃幼苗根部生長(zhǎng)無明顯差別，第21天時(shí)0.5 mmol/L處理的幼苗根長(zhǎng)跟對(duì)照組相比有顯著增加(3.75%，p<0.05)，根數(shù)有顯著減少(13.70%，p<0.05)。1 mmol/L處理的幼苗根長(zhǎng)和根數(shù)則顯著減少(36.07%，28.53% ，p<0.05)。當(dāng)Cr6+濃度達(dá)到2 mmol/L時(shí)，第1天到第10天懷地黃幼苗根部幾乎無變化，第21天時(shí)測(cè)量的根長(zhǎng)，根數(shù)和對(duì)照組相比有極顯著的減少(47.78%，62.13%，

圖2　不同Cr6+濃度脅迫條件對(duì)懷地黃根部的影響(第21天)

(星號(hào)表示與對(duì)照組的差異顯著性。*：差異顯著；**：差異極顯著)

p<0.01)。當(dāng)Cr6+濃度進(jìn)一步提高到3 mmol/L和5 mmol/L時(shí)，第10天時(shí)幼苗已經(jīng)出現(xiàn)部分枯萎壞死，第21天時(shí)幼苗已經(jīng)全部枯萎死亡。這表明當(dāng)Cr6+濃度較低時(shí)，其對(duì)根的生長(zhǎng)影響相對(duì)較少，當(dāng)濃度達(dá)到2 mmol/L甚至更高時(shí)，Cr6+對(duì)幼根生長(zhǎng)短時(shí)間內(nèi)即表現(xiàn)出極顯著的抑制作用。

2.3Cr6+濃度和脅迫時(shí)間對(duì)懷地黃幼苗葉片的影響

根據(jù)圖1A，脅迫第6天時(shí)，3 mmol/L和5 mmol/L Cr6+脅迫的幼苗葉片普遍偏黃綠色，葉片卷曲，干皺，有枯萎跡象；2 mmol/L Cr6+的幼苗有半數(shù)葉片開始發(fā)黃，葉片背部發(fā)黑，其它濃度幼苗正常生長(zhǎng)。脅迫第10天，0.5、1 mmol/L Cr6+處理的幼苗中部分新生葉片也開始呈現(xiàn)出失綠現(xiàn)象。脅迫第21天，當(dāng)Cr6+濃度不超過1mmol/L時(shí)，前期的失綠現(xiàn)象已經(jīng)消失，葉片顏色恢復(fù)正常，葉數(shù)和葉寬與對(duì)照組無顯著差異，而葉片長(zhǎng)度和面積均有所下降(圖3)。當(dāng)Cr6+濃度達(dá)到2 mmol/L時(shí)，葉數(shù)和對(duì)照組相比有顯著的減少(33.3%，p<0.05)，葉長(zhǎng)、葉寬、葉面積的減少則達(dá)到極顯著水平。當(dāng)Cr6+濃度達(dá)到3 mmol/L時(shí)，葉的四種指標(biāo)均有(極)顯著下降，表明懷地黃幼苗葉片已經(jīng)無法進(jìn)行光合作用儲(chǔ)存物質(zhì)供機(jī)體生長(zhǎng)。

圖3　不同濃度鉻脅迫對(duì)懷地黃葉片生長(zhǎng)的影響(第21天)(星號(hào)表示與對(duì)照組的差異顯著性。*：差異顯著；**：差異極顯著)

2.4Cr6+脅迫對(duì)懷地黃幼苗鮮質(zhì)量、干質(zhì)量的影響

地黃的塊根是其藥用部分，因此我們檢測(cè)了不同濃度Cr6+對(duì)懷地黃根莖生物量的影響。 如圖4所示，在 0.5 mmol/L的Cr6+濃度條件下，懷地黃根和葉的鮮質(zhì)量和干質(zhì)量均有顯著增長(zhǎng)，分別是對(duì)照的125.45%和113.34%。之后隨著Cr6+濃度的增加，開始表現(xiàn)出對(duì)懷地黃生長(zhǎng)的抑制作用。并且Cr6+對(duì)懷地黃的鮮、干質(zhì)量的抑制作用隨著Cr6+濃度的增加呈加重趨勢(shì)，當(dāng)Cr6+濃度達(dá)到2 mmol/L時(shí)，幼苗的鮮質(zhì)量和干質(zhì)量均顯著下降。

圖4　不同濃度Cr6+脅迫對(duì)懷地黃幼苗鮮質(zhì)量(A)和干質(zhì)量(B)的影響(第21天)

3　討論與結(jié)論

土壤是人類賴以生存的主要自然資源之一 ,也是植物生長(zhǎng)的重要組成部分。土壤中重金屬污染的日益嚴(yán)重，不僅影響了糧食作物的產(chǎn)量、質(zhì)量，而且對(duì)其他經(jīng)濟(jì)作物的價(jià)值，如中藥的藥用價(jià)值等也產(chǎn)生了極大的影響。

目前關(guān)于重金屬污染，尤其是鉻污染對(duì)中藥地黃的生長(zhǎng)和毒害作用尚無相關(guān)研究報(bào)道。本研究首次研究了不同鉻濃度和脅迫時(shí)間對(duì)地黃幼苗生長(zhǎng)的影響。研究結(jié)果表明，當(dāng)鉻濃度較低時(shí)，鉻離子的存在反而對(duì)懷地黃的生長(zhǎng)有一定的促進(jìn)作用，而巢麗儀等[5]、石貴玉等[8]研究也表明，低濃度鉻對(duì)玉米，煙草等植物的生長(zhǎng)有一定的促進(jìn)作用。本實(shí)驗(yàn)中低濃度鉻雖對(duì)葉片數(shù)量、鮮質(zhì)量起到了促進(jìn)作用，但是對(duì)葉片長(zhǎng)度、寬度、面積均起到了抑制作用，這說明低濃度鉻能夠促進(jìn)葉片光合作用積累有機(jī)產(chǎn)物，并有利于其個(gè)數(shù)的增加，卻不利于單個(gè)葉片表面積的增大。另外本實(shí)驗(yàn)中低濃度鉻脅迫的幼苗根、莖干質(zhì)量均有所下降，只有葉的干質(zhì)量增加，說明此濃度時(shí)鉻對(duì)干物質(zhì)積累的促進(jìn)作用主要表現(xiàn)在植物的葉片上。另外，本研究發(fā)現(xiàn)Cr6+濃度達(dá)到1 mmol/L時(shí)對(duì)植物根部生長(zhǎng)開始有顯著的抑制作用。懷地黃幼苗在高濃度Cr6+的脅迫下，株高、根長(zhǎng)、根數(shù)、鮮質(zhì)量、干質(zhì)量、葉面積等生長(zhǎng)指標(biāo)均顯著低于對(duì)照植株。隨著脅迫時(shí)間的增加和鉻濃度的提高，植株開始逐漸出現(xiàn)葉枯萎，甚至死亡。

Van Assche等[9]研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞內(nèi)重金屬離子能與酶和蛋白質(zhì)結(jié)合，并且替換金屬蛋白中的必需元素，使酶失去活性，阻礙植物的正常生長(zhǎng)和光合作用。因此鉻對(duì)懷地黃生長(zhǎng)的毒害作用可能是由于鉻抑制幼苗體內(nèi)酶的活性，使植株新陳代謝發(fā)生了紊亂。王五宏等[10]研究了水培條件下鉻脅迫對(duì)四個(gè)品種苗用型大白菜生長(zhǎng)的影響，其中雙耐、浙白8號(hào)在100 μmol/L脅迫下鮮質(zhì)量抑制率分別為63.40%、49.04%,浙白6號(hào)和早熟5號(hào)在50 μmol/L脅迫下鮮質(zhì)量抑制率達(dá)到70%。陳耕云等[11]對(duì)煙草的研究表明，當(dāng) Cr6 +濃度達(dá)到 800 μmol/L 時(shí)，煙草的生長(zhǎng)發(fā)育完全被抑制。在本研究中Cr6 +濃度達(dá)到 3 mmol/L對(duì)懷地黃幼苗的生長(zhǎng)有強(qiáng)烈的抑制作用，與上述研究結(jié)果研究一致。另外，由于煙草和懷地黃同屬合瓣花亞綱管狀花目，本實(shí)驗(yàn)中懷地黃幼苗在1mmol/L仍可以較好的生長(zhǎng)，可見地黃相比其他植物對(duì)重金屬鉻毒害的抵抗能力更強(qiáng)。

綜上所述，本研究以生長(zhǎng)參數(shù)指標(biāo)作為判斷標(biāo)準(zhǔn)，探究了懷地黃經(jīng)重金屬鉻脅迫的生長(zhǎng)狀況及致死濃度。研究結(jié)果表明，土壤重金屬的污染不僅影響農(nóng)作物的生長(zhǎng)，其對(duì)中草藥植物的生長(zhǎng)也有毒害作用。本研究可為改善地黃質(zhì)量和預(yù)防土壤重金屬污染對(duì)地黃的生長(zhǎng)提供有效的評(píng)估依據(jù)。另外，本研究?jī)H以生長(zhǎng)參數(shù)指標(biāo)作為判斷標(biāo)準(zhǔn)，而沒有對(duì)生理指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定，故今后將會(huì)對(duì)鉻對(duì)懷地黃幼苗生理生化特性的影響以及其它重金屬對(duì)懷地黃幼苗生長(zhǎng)的影響進(jìn)行進(jìn)一步的研究。

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The effect of Chromium (Cr6+) stress on Rehmannia glutinosa seedling

Zhang Yuhong

(College of Life Sciences, Henan Normal University, Xinxiang 453007, China)

e studied the stress effects in Rehmannia glutinosa seedlings by tissue culture under different Cr6+concentrations and the time of Cr6+stress. The plant height, growth status of root, stem, and leaf, biomass and mortality were measured. The results indicated that, in given stress time, low concentration of Cr6+(0.5mmol/L)had a positive effect on fresh weight, dry weight, root length, and leaf number of Rehmannia glutinosa seedlings, while high concentration of Cr6+significantly reduced their biological activities. Rehmannia glutinosa seedlings could still grow well when the Cr6+concentration was up to 1.0 mmol/L, which suggested they had strong tolerance ability to Cr6+.

chromium (Cr6+) stress; Rehmannia glutinosa seedlings; tissue culture; growth

2014年度河南師范大學(xué)校級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練計(jì)劃(編號(hào)：20140138)

2016-06-05; 2016-07-18 修回

張宇虹，女，1996年生，河南三門峽人，本科，研究方向： 植物遺傳學(xué)。E-mail：yuhongruoyi@163.com

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