陳情情，許秀勤，馬艷，馬龍，許暉，李娜

（蚌埠學(xué)院生物與食品工程系，安徽蚌埠233000）

超高壓誘變選育富鋅啤酒酵母菌株的研究

陳情情，許秀勤，馬艷，馬龍*，許暉，李娜

（蚌埠學(xué)院生物與食品工程系，安徽蚌埠233000）

以啤酒酵母為出發(fā)菌株，采用超高壓誘變方法誘變選育高富集鋅的酵母菌株。優(yōu)化了超高壓處理的工藝條件，并基于菌株對(duì)鋅離子的耐受性和富集性，對(duì)菌株進(jìn)行篩選。結(jié)果表明，培養(yǎng)10 h的啤酒酵母菌處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，適宜于誘變；超高壓處理壓力250 MPa、保壓時(shí)間20 min為誘變的最佳工藝條件；成功選育出一株高富集鋅的突變菌株，其細(xì)胞鋅含量達(dá)2.75 mg/g，是出發(fā)菌的6.55倍。

富鋅酵母；啤酒酵母；超高壓處理；誘變育種

鋅是人體必需的微量元素之一，對(duì)維持機(jī)體內(nèi)部蛋白質(zhì)、碳水化合物、脂類、核酸的正常代謝，維持細(xì)胞膜的完整性和再生，促進(jìn)身體生長(zhǎng)發(fā)育等方面起著重要作用［1］。但是只有有機(jī)態(tài)的鋅元素才能夠被機(jī)體安全且迅速地吸收，無機(jī)態(tài)的鋅不僅被吸收的水平很低，而且毒性較大；利用微生物將無機(jī)鹽形式的鋅元素轉(zhuǎn)化為較易被人體和動(dòng)物吸收利用的有機(jī)物形式的鋅是目前鋅元素利用的重要手段，其中富集微量元素能力極強(qiáng)的酵母菌成為該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)［2］。國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)富鋅酵母的營(yíng)養(yǎng)特性、發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵工藝條件作了大量研究［3-5］，同時(shí)也對(duì)生產(chǎn)菌株進(jìn)行了一系列的誘變和篩選，包括紫外誘變、化學(xué)誘變劑誘變等方法［6-7］，以進(jìn)一步提高酵母鋅的產(chǎn)量，但存在輻射性和毒性的局限。超高壓誘變技術(shù)是一種采用100 MPa以上的壓力對(duì)微生物進(jìn)行誘變處理的新型、安全的微生物育種方法［8］。超高壓作為一種逆境脅迫，對(duì)微生物的生理功能以及核酸結(jié)構(gòu)和基因表達(dá)有著較大影響，已得到學(xué)術(shù)界的廣泛關(guān)注［9-10］。該技術(shù)現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于各類酵母菌的誘變育種［11-12］，但應(yīng)用在富鋅酵母的育種未見報(bào)道。本研究采用超高壓誘變育種法對(duì)實(shí)驗(yàn)室保存的啤酒酵母菌株進(jìn)行選育，成功地篩選出一株富鋅能力強(qiáng)的正突變菌株，為工業(yè)生產(chǎn)用菌株的選育提供參考。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1菌種來源

啤酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）：蚌埠學(xué)院生物與食品工程系微生物實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2培養(yǎng)基與溶液［13］

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）液體培養(yǎng)基：葡萄糖20 g，酵母提取物10 g，胰蛋白胨20 g，蒸餾水1 000 mL，pH 5.5。

YPD固體培養(yǎng)基：YPD液體培養(yǎng)基中加入瓊脂20 g。

硫酸鋅儲(chǔ)備液：使用去離子水配制濃度0.10 mol/L的硫酸鋅溶液，用濃硫酸調(diào)節(jié)pH值4.0防止沉淀物產(chǎn)生，115℃滅菌20 min，需要時(shí)加入已滅菌的培養(yǎng)基中。

1.2儀器與設(shè)備

HPP.L2-600/0.6型超高壓處理設(shè)備：天津市華泰森淼生物工程技術(shù)有限公司；DZ-400/2C型真空包裝機(jī)：上海青葩包裝機(jī)械有限公司；ZWY-100H型搖床：上海智誠(chéng)儀器制造有限公司；752型紫外可見分光光度計(jì)：上海菁華科技儀器有限公司；TAS-990型原子吸收分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限公司。

1.3方法

1.3.1菌懸液的制備

取斜面保存的啤酒酵母菌種接入裝有5 mL YPD固體培養(yǎng)基的試管中28℃靜置培養(yǎng)48 h進(jìn)行活化。刮取3環(huán)已活化的菌種至裝有50 mL YPD液體培養(yǎng)基的150 mL三角瓶中28℃、150 r/min搖瓶培養(yǎng)24 h進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。取擴(kuò)大培養(yǎng)后的啤酒酵母菌液10 mL于4℃、4 000 r/min離心10 min，沉淀以無菌生理鹽水洗滌3次，用生理鹽水調(diào)整至細(xì)胞濃度為106CFU/mL，輕微振蕩30 min使菌體分散均勻，制得菌懸液。

1.3.2生長(zhǎng)曲線的繪制

將啤酒酵母菌懸液以10%的接種量分別接入12瓶裝有30 mL YPD液體培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，于28℃、150 r/min搖瓶培養(yǎng)，每隔2 h取出一瓶，從中吸取1 mL培養(yǎng)液于4℃、4 000 r/min離心10 min，以無菌生理鹽水洗滌3次，加入4mL無菌生理鹽水使菌體重新懸浮，以生理鹽水為空白，在波長(zhǎng)600 nm處測(cè)定吸光度值，以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，光密度OD600nm值為縱坐標(biāo)繪制啤酒酵母生長(zhǎng)曲線［14］。

1.3.3啤酒酵母菌株的耐鋅能力測(cè)定

分別吸取0.10 mol/L硫酸鋅溶液10 μL、20 μL、30 μL、40 μL、50 μL、60 μL、70 μL、80 μL、90 μL、100 μL到無菌平板，加入10 mL加熱呈液態(tài)的斜面固體培養(yǎng)基，趁熱搖勻，冷卻即得鋅離子終濃度0.1 mmol/L、0.2 mmol/L、0.3mmol/L、0.4mmol/L、0.5mmol/L、0.6mmol/L、0.7mmol/L、0.8 mmol/L、0.9 mmol/L、1.0 mmol/L的系列平板。吸取200 μL啤酒酵母菌懸液涂布平板，于28℃倒置培養(yǎng)72 h，觀察平板，能夠長(zhǎng)出啤酒酵母菌落的最高鋅離子濃度即為啤酒酵母菌對(duì)鋅離子的耐受濃度［7］。

1.3.4超高壓處理壓力對(duì)啤酒酵母菌株誘變的影響

將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的啤酒酵母制備成細(xì)胞濃度為106CFU/mL的菌懸液，在無菌操作條件下將5 mL菌懸液轉(zhuǎn)入滅菌的聚丙烯包裝袋內(nèi)，用真空包裝機(jī)封口，設(shè)置50 MPa、100 MPa、150 MPa、200 MPa、250 MPa、300 MPa、350 MPa、400 MPa、450 MPa不同壓力梯度高壓處理20 min，吸取200 μL處理后的菌懸液涂布平板培養(yǎng)，同時(shí)以出發(fā)菌株作為空白對(duì)照。待平板上長(zhǎng)出菌落后，根據(jù)菌落數(shù)計(jì)算致死率。

將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的啤酒酵母制備成細(xì)胞濃度為106CFU/mL的菌懸液，在無菌操作條件下將5 mL菌懸液轉(zhuǎn)入滅菌的聚丙烯包裝袋內(nèi)，用真空包裝機(jī)封口，在250 MPa壓力條件下分別保壓處理5 min、10 min、15 min、20 min、25 min、30 min，吸取200 μL處理后的菌懸液涂布平板培養(yǎng)，同時(shí)以出發(fā)菌株作為空白對(duì)照。待平板上長(zhǎng)出菌落后，根據(jù)菌落數(shù)計(jì)算致死率。

1.3.6突變菌株的篩選

從致死率在70%～80%的250 MPa、20 min誘變處理的平板中挑取生長(zhǎng)快、較大的單菌落，經(jīng)無菌生理鹽水適當(dāng)稀釋后涂布于兩倍耐受濃度環(huán)境平板上培養(yǎng)，同時(shí)以出發(fā)菌株作為空白對(duì)照。在空白對(duì)照不生長(zhǎng)的情況下，挑取生長(zhǎng)出的菌落接入更高濃度（如4倍和8倍耐受濃度）鋅平板上馴化，并做傳代培養(yǎng)，測(cè)定細(xì)胞含鋅量，其中細(xì)胞含鋅量高的菌落即為優(yōu)良突變菌株。

1.3.7啤酒酵母細(xì)胞鋅含量的測(cè)定

采用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 5009.14—2003《食品中鋅的測(cè)定》中的原子吸收光譜法。

2　結(jié)果與分析

2.1出發(fā)菌的生長(zhǎng)曲線

通過比濁法測(cè)定啤酒酵母的生長(zhǎng)曲線，結(jié)果見圖1。

圖1　啤酒酵母的生長(zhǎng)曲線Fig.1 Growth curve ofSaccharomyces cerevisiae

由圖1可知，啤酒酵母的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期在8～16 h范圍內(nèi)，培養(yǎng)18 h后啤酒酵母進(jìn)入穩(wěn)定期。研究表明，處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌體生長(zhǎng)旺盛、代謝活性強(qiáng)，對(duì)誘變因素敏感［15］。因此，選擇培養(yǎng)10 h的啤酒酵母菌液進(jìn)行超高壓誘變處理。

信息技術(shù)在財(cái)會(huì)工作中的應(yīng)用，在一定程度上減少了財(cái)會(huì)人員的工作量，但對(duì)財(cái)務(wù)人員的要求并未降低。管理會(huì)計(jì)主要是為企業(yè)管理者在制定決策時(shí)提供有效、及時(shí)的意見或建議，如企業(yè)決策中的控制、決策、分析等工作，均需具有較高專業(yè)素質(zhì)的財(cái)會(huì)工作者提供理論支持。因此，企業(yè)財(cái)會(huì)工作者必須不斷提升自身專業(yè)能力，可從員工績(jī)效管理能力、業(yè)績(jī)?cè)u(píng)價(jià)能力、決策分析能力、財(cái)務(wù)核算能力等方面作為切入點(diǎn)，進(jìn)一步健全自身知識(shí)體系。財(cái)務(wù)人員在提高自身專業(yè)能力同時(shí)，也應(yīng)增加相關(guān)領(lǐng)域的知識(shí)累積，如經(jīng)濟(jì)分析識(shí)別、資本運(yùn)營(yíng)、公司治理等。

2.2出發(fā)菌的耐鋅能力

觀察鋅離子濃度梯度系列平板上菌生長(zhǎng)情況，能長(zhǎng)出菌落的最高鋅離子濃度即為該菌株對(duì)鋅離子的最大耐受濃度。出發(fā)菌株耐鋅能力測(cè)定結(jié)果見表1。

表1　啤酒酵母對(duì)鋅離子的耐受能力Table 1 Zinc resistance ofSaccharomyces cerevisiae

由表1可知，在規(guī)定的培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)，隨著平板中鋅離子濃度的增加，出發(fā)菌菌落數(shù)量在不斷地減少，在鋅離子濃度0.8 mmol/L時(shí)菌落數(shù)最少，在鋅離子濃度為0.9 mmol/L、1.0 mmol/L時(shí)沒有菌落生長(zhǎng)。因此，0.8 mmol/L為啤酒酵母出發(fā)菌對(duì)鋅離子的最大耐受濃度。

2.3超高壓處理壓力對(duì)啤酒酵母菌株誘變影響

固定高壓處理時(shí)間為20 min時(shí)，超高壓處理壓力對(duì)啤酒酵母致死率的影響結(jié)果見圖2。

圖2　壓力對(duì)啤酒酵母菌致死率的影響Fig.2 Effect of processing pressure onSaccharomyces cerevisiae lethality rate

由圖2可知，超高壓處理可導(dǎo)致啤酒酵母細(xì)胞的死亡，隨著壓力的升高其致死率迅速增大；當(dāng)處理壓力達(dá)到250 MPa時(shí)，啤酒酵母細(xì)胞的致死率達(dá)到80%左右，而壓力超過400 MPa時(shí)菌體幾乎全部死亡。研究表明，致死率在70%～80%時(shí)微生物出現(xiàn)正突變較高［16］，故選取壓力250 MPa作為最優(yōu)處理壓力。

2.4保壓時(shí)間對(duì)啤酒酵母菌致死率的影響

在250 MPa壓力處理?xiàng)l件下，不同保壓時(shí)間對(duì)啤酒酵母致死率的影響結(jié)果見圖3。

圖3　保壓時(shí)間對(duì)啤酒酵母菌致死率的影響Fig.3 Effect of processing time onSaccharomyces cerevisiae lethality rate

由圖3可知，隨著保壓時(shí)間的延長(zhǎng)，啤酒酵母菌的致死率也在迅速增大；當(dāng)保壓時(shí)間達(dá)到20 min時(shí)，細(xì)胞致死率最高可以達(dá)到80%，處理時(shí)間超過25 min，細(xì)胞的致死率變化緩慢。故從經(jīng)濟(jì)成本考慮，選取超高壓保壓時(shí)間為20 min。綜上，超高壓誘變處理啤酒酵母的最優(yōu)誘變參數(shù)為壓力250 MPa、保壓時(shí)間20 min。

2.5篩選突變菌株

超高壓處理后的啤酒酵母菌株經(jīng)過鋅濃度梯次增加的馴化培養(yǎng)后，在4倍耐受濃度（3.2 mmol/L）平板上生長(zhǎng)了3株啤酒酵母，標(biāo)記為UP1、UP2、UP3。將初篩出的三株菌株連續(xù)傳代5代，測(cè)定細(xì)胞含鋅量，并與出發(fā)菌株比較，結(jié)果見表2。

表2　啤酒酵母細(xì)胞含鋅量測(cè)定結(jié)果Table 2 Determination of zinc content inSaccharomyces cerevisiae

由表2可知，啤酒酵母菌株經(jīng)過超高壓誘變處理后富集鋅元素的能力均得到大幅度提高，其中菌株UP2提高最大，細(xì)胞鋅含量達(dá)到2.75 mg/g，是出發(fā)菌的6.55倍，故菌株UP2可確定為最終獲得的優(yōu)良富鋅酵母菌株。

3　結(jié)論

研究結(jié)果表明，超高壓技術(shù)是一種可行的微生物誘變育種方法，能夠顯著地提高啤酒酵母富集鋅元素的性能。采用壓力250MPa、保壓時(shí)間20min對(duì)處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的啤酒酵母菌株進(jìn)行超高壓誘變處理，成功選育出一株富集鋅元素能力強(qiáng)的突變菌株，其細(xì)胞鋅含量達(dá)到2.75 mg/g，是出發(fā)菌的6.55倍，這一突變菌株遺傳穩(wěn)定性良好，可作為富鋅酵母生產(chǎn)用工業(yè)菌株。超高壓誘變技術(shù)操作簡(jiǎn)便、無污染，在微生物誘變育種領(lǐng)域具有較好的應(yīng)用前景。

［1］朱婭敏，夏長(zhǎng)虹，李詠，等.富鋅酵母的研究現(xiàn)狀及應(yīng)用進(jìn)展［J］.微量元素與健康研究，2011，28（4）：45-48.

［2］郭雪娜，崔黎，王肇悅，等.富集微量元素的功能酵母研究概況及應(yīng)用前景［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2009，35（4）：124-127.

［3］關(guān)轉(zhuǎn)飛，賈飛，王戰(zhàn)勇，等.利用啤酒廢酵母制備富鋅酵母［J］.中國(guó)釀造，2010，29（4）：178-180.

［4］許秀勤，駱偉，陳情情，等.富鋅酵母的研究進(jìn)展［J］.廣州化工，2014，42（8）：12-13，37.

［5］王慧，張霞，辛蕊華，等.酵母鋅對(duì)肉雞生長(zhǎng)性能及生理功能的影響［J］.中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2012，32（3）：488-492.

［6］郭雪娜，傅秀輝，何秀萍，等.富鋅酵母的選育及培養(yǎng)條件研究［J］.微生物學(xué)報(bào)，2004，44（2）：240-243.

［7］孔林，郝勃，喻子牛.富鋅酵母的選育及其培養(yǎng)工藝［J］.食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2006，25（6）：97-101，123.

［8］林德慧，杜雙奎，李志西，等.高靜水壓對(duì)纖維素產(chǎn)生菌葡糖醋桿菌性質(zhì)及其產(chǎn)纖維能力的影響［J］.西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2011，39（3）：119-124.

［9］ABRAM A，F(xiàn)ILIP M，MARC E G.Biotechnology under high pressure：Applications and implications［J］.Trends Biotechnol，2009，27（7）：434-441.

［10］HUANG H，LUNG H，YANG B B，et al.Responses of microorganisms to high hydrostatic pressure processing［J］.Food Control，2014，40（6）：250-259.

［11］袁仲，張百勝，馬綺云，等.超高壓處理誘變選育全小麥啤酒酵母菌株及其應(yīng)用研究［J］.中國(guó)釀造，2010，29（12）：33-37.

［12］王歲樓，陳德經(jīng)，鄧百萬.紅酵母超高壓誘變及其β-胡蘿卜素發(fā)酵條件的初步研究［J］.食品科學(xué)，2007，28（9）：409-414.

［13］葉明.微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)［M］.合肥：合肥工業(yè)大學(xué)出版社，2009：125.

［14］李黨生，王振偉.高壓誘變啤酒酵母研究及其突變株RAPD分析［J］.食品科學(xué)，2009，30（21）：226-227.

［15］袁仲，張百勝，張慎舉，等.全小麥啤酒酵母菌株的誘變育種及應(yīng)用研究［J］.中國(guó)細(xì)胞生物學(xué)學(xué)報(bào)，2011，33（4）：379-384.

［16］杜雙奎，李志西，毋銳琴，等.細(xì)菌纖維素菌株超高壓誘變選育及其發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化［J］.高壓物理學(xué)報(bào)，2011，25（1）：79-88.

CHEN Qingqing，XU Xiuqin，MA Yan，MA Long*，XU Hui，LI Na
（Department of Food and Bioengineering，Bengbu College，Bengbu 233000，China）

UsingSaccharomyces cerevisiaeas starting strain，high zinc-enrichedS.cerevisiaemutant strain was breeded by ultra-high pressure mutagenesis method.The conditions of ultra-high pressure processing were studied and then the screening was performed based on the tolerability and enrichment of mutant strains to zinc.The results showed that the strains in logarithmic growth phage after 10 h culture were suitable for the mutation，pressure value 250 MPa，pressure time 20 min were the optimal processing conditions for mutation.Finally，a strain with high enrichment of zinc（cell content 2.75 mg/g，about 6.55 times of the starting strains）was obtained.

zinc enriched yeast；Saccharomyces cerevisiae；ultra-high pressure processing；mutation breeding

TS202.3

0254-5071（2016）06-0081-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.06.017

2016-02-22

安徽省高等學(xué)校省級(jí)自然科學(xué)研究項(xiàng)目（KJ2013B136）；蚌埠學(xué)院教師指導(dǎo)學(xué)生參與教師科研項(xiàng)目（2013xsky17）；安徽省高等學(xué)校省級(jí)卓越工程師計(jì)劃蚌埠學(xué)院食品科學(xué)與工程專業(yè)建設(shè)點(diǎn)；安徽省高等學(xué)校省級(jí)卓越工程師計(jì)劃蚌埠學(xué)院食品質(zhì)量與安全專業(yè)建設(shè)點(diǎn)

陳情情（1993-），女，本科生，研究方向?yàn)槭称房茖W(xué)與工程。

馬龍（1979-），男，副教授，博士，研究方向?yàn)槭称房茖W(xué)。