劉 孟，乜蘭春，王珊珊，胡淑明

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蘆筍三種花蕾性別分化相關(guān)差異蛋白表達(dá)分析

劉 孟，乜蘭春，王珊珊，胡淑明

（河北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，河北保定 071001）

【目的】探究與蘆筍性別分化相關(guān)的蛋白，為揭示性別分化的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)?！痉椒ā恳蕴J筍雌株、雄株、雄性兩性株兩性分化期的花蕾為材料，采用雙向電泳、質(zhì)譜鑒定和生物信息學(xué)相結(jié)合的方法，對(duì)其進(jìn)行蛋白質(zhì)差異表達(dá)分析?！窘Y(jié)果】通過雙向電泳3次重復(fù)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，雌、雄花蕾相比，雄花蕾特異蛋白點(diǎn)25個(gè)，上調(diào)蛋白點(diǎn)5個(gè)；雌花蕾特異蛋白點(diǎn)13個(gè)，上調(diào)蛋白點(diǎn)12個(gè)；雄性兩性花蕾與雄花蕾相比，特異蛋白點(diǎn)19個(gè)，上調(diào)蛋白點(diǎn)8個(gè)。經(jīng)過質(zhì)譜鑒定及生物信息學(xué)分析，鑒定出雄花蕾特異或上調(diào)表達(dá)同源蛋白6個(gè)，包括1個(gè)促進(jìn)α淀粉酶合成的luminal binding protein（BiP）；3個(gè)參與糖代謝的蛋白，分別為β淀粉酶、3-磷酸甘油醛脫氫酶和胞質(zhì)磷酸甘油酸激酶；1個(gè)與質(zhì)體相關(guān)的脂連接蛋白PAP fibrillin和1個(gè)未知功能的Os02g0634900蛋白；雄性兩性花蕾和雌花蕾特異或上調(diào)表達(dá)同源蛋白16個(gè)，包括2個(gè)參與糖酵解過程的蛋白，即烯醇化酶1和胞質(zhì)磷酸甘油酸激酶；2個(gè)維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)的蛋白，即肌動(dòng)蛋白亞型B和肌動(dòng)蛋白；2個(gè)參與能量代謝的蛋白，即ATP合成酶CF1α亞基和ATP合成酶β亞基；2個(gè)參與細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)運(yùn)輸?shù)牡鞍?，即小GTP結(jié)合蛋白和GTP結(jié)合蛋白，1個(gè)抑制蛋白質(zhì)合成的核糖體失活蛋白，1個(gè)參與物質(zhì)運(yùn)輸和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的蛋白，即ADP核糖激化因子相似蛋白，1個(gè)催化磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移的蛋白，即核苷二磷酸激酶，1個(gè)脂質(zhì)相關(guān)蛋白，1個(gè)與光合作用（光系統(tǒng)Ⅱ）有關(guān)的蛋白，即放氧增強(qiáng)蛋白1，1個(gè)允許離子、糖和氨基酸被動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)穿過外膜的蛋白，即細(xì)胞外膜孔道蛋白，2個(gè)未知功能的蛋白，即細(xì)胞內(nèi)病程相關(guān)蛋白亞型4和假想蛋白?！窘Y(jié)論】β淀粉酶、3-磷酸甘油醛脫氫酶、胞質(zhì)磷酸甘油酸激酶、luminal binding protein (BiP)、PAP fibrillin和Os02g0634900在蘆筍上的同源蛋白與蘆筍雄性器官發(fā)育相關(guān)；烯醇化酶1、胞質(zhì)磷酸甘油酸激酶、肌動(dòng)蛋白亞型B、肌動(dòng)蛋白、ATP合成酶CF1α亞基、小GTP結(jié)合蛋白、GTP結(jié)合蛋白、核糖體失活蛋白、ADP核糖激化因子相似蛋白、核苷二磷酸激酶、脂質(zhì)相關(guān)蛋白、放氧增強(qiáng)蛋白1、細(xì)胞外膜孔道蛋白和假想蛋白在蘆筍上的同源蛋白，ATP合成酶β亞基、細(xì)胞內(nèi)病程相關(guān)蛋白亞型4與蘆筍雌性器官發(fā)育相關(guān)。放氧增強(qiáng)蛋白1和細(xì)胞外膜孔道蛋白在蘆筍上的同源蛋白可能為雌性器官發(fā)育的關(guān)鍵蛋白。

蘆筍；雌花蕾；雄花蕾；雄性兩性花蕾；性別分化；差異蛋白

0 引言

【研究意義】蘆筍（L.），又名石刁柏，是百合科天門冬屬宿根性多年生草本植物，具有較高的營(yíng)養(yǎng)和保健價(jià)值[1-3]。蘆筍雌雄異株，其性別分化先經(jīng)歷“兩性”時(shí)期，之后在特定階段，性器官選擇性發(fā)育。但也有極少數(shù)雄株花的雌性器官發(fā)育完全，為雄性兩性株[4-6]。蘆筍性別由1對(duì)等位基因決定，Mm為雄株（包括雄性兩性株），mm為雌株[7-9]，其中雄株產(chǎn)量高，經(jīng)濟(jì)壽命長(zhǎng)[10-11]。雄性兩性株（Mm）及其自交后代超雄株（MM）是蘆筍遺傳研究及全雄育種的重要種質(zhì)材料。但自然條件下，雄性兩性株出現(xiàn)的比例極低，加之田間篩選困難，蘆筍種質(zhì)創(chuàng)新和全雄品種選育受到很大限制[6,10,12]。明確蘆筍性別分化機(jī)理，將為蘆筍性別調(diào)控和種質(zhì)創(chuàng)新奠定基礎(chǔ)，也可進(jìn)一步豐富雌雄異株植物性別分化的相關(guān)理論?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】蘆筍性別分化是由性別決定基因主導(dǎo)的，同時(shí)許多特異表達(dá)基因參與調(diào)控[13-17]。國(guó)內(nèi)外學(xué)者已經(jīng)分離并且得到與蘆筍花器官發(fā)育相關(guān)的10多個(gè)特異基因，但又證實(shí)這些基因與蘆筍性別決定與分化無(wú)直接關(guān)系，由于蘆筍性別決定基因區(qū)域有大量重復(fù)序列，阻礙了單拷貝M位點(diǎn)的定位，蘆筍性別決定與分化的分子機(jī)理尚未完全揭示[13]。蘆筍性別分化的基因調(diào)控是復(fù)雜的，采用轉(zhuǎn)錄子組和蛋白質(zhì)組技術(shù)是識(shí)別這些基因的有效方法?；虮磉_(dá)的直接產(chǎn)物是蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)通過其自身特異的活動(dòng)控制和調(diào)節(jié)生命活動(dòng)[18]。在性別分化過程中，蛋白質(zhì)的差異在一定程度上可以反映基因?qū)τ诨òl(fā)育的調(diào)控[19]，對(duì)蛋白質(zhì)組學(xué)及差異蛋白質(zhì)研究可從植物本身的代謝活動(dòng)方面更清晰地揭示植物性別分化的機(jī)理?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前，在文冠果[19]、苦瓜[20]、黃瓜[21]、果梅[22]等植物上已研究發(fā)現(xiàn)了與其性別分化相關(guān)的特異蛋白，但大部分停留在檢測(cè)其分子量方面，有關(guān)蘆筍性別分化相關(guān)蛋白的研究尚未見報(bào)道。【擬解決的關(guān)鍵問題】本試驗(yàn)利用雙向電泳和質(zhì)譜鑒定技術(shù)對(duì)蘆筍雌株、雄株和雄性兩性株進(jìn)入兩性分化期的花蕾可溶性蛋白進(jìn)行分離和鑒定，結(jié)合生物信息學(xué)分析，確定其功能，以期找出與蘆筍性別分化有關(guān)的蛋白，為揭示性別分化的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

蛋白質(zhì)樣品制備、雙向電泳及圖譜分析和質(zhì)譜鑒定于2015年6—8月在北京華大蛋白技術(shù)有限公司實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.1 供試材料

材料為3年生蘆筍品種‘冠軍’，采自河北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)林試驗(yàn)基地。2015年春季萌芽后，嫩莖側(cè)枝展開，根據(jù)形態(tài)學(xué)和解剖學(xué)觀察[23]，分別取雌株、雄株、雄性兩性株上進(jìn)入兩性分化期的花蕾液氮速凍，-80℃冰箱保存。

1.2 差異蛋白分析

1.2.1 蛋白質(zhì)樣品制備 分別取適量花蕾加入10% PVPP和液氮進(jìn)行研磨，將磨細(xì)后的粉末放入離心管中，加入10% TCA的預(yù)冷丙酮，-20℃沉淀2 h，在4℃下20 000×離心30 min，棄上清；再加入預(yù)冷的純丙酮，清洗沉淀，振蕩后于-20℃沉淀30 min，重復(fù)清洗3次，除去丙酮后，加入終濃度為1 mmol·L-1PMSF，2 mmol·L-1EDTA，10 mmol·L-1DTT的L3裂解液500 μL，冰浴超聲5 min，最后在15℃，20 000×條件下離心30 min，收集上清保存于-80℃冰箱備用。使用2-D Quant-kit法對(duì)蛋白進(jìn)行定量。

1.2.2 雙向電泳及圖譜分析 采用18 cm、pH為4—7的線性IPG膠條，上樣量500 μg。等電聚焦電壓設(shè)置為：水化12 h，然后依次經(jīng)過50 v 2 h、500 v 2 h、1 000 v 2 h，最終穩(wěn)定在8 000 v，最后總電壓時(shí)間積為110 000 vh。等電聚焦結(jié)束后將膠條移至平衡槽中，在膠條平衡緩沖液中平衡15 min，然后進(jìn)行第二向SDS-PAGE電泳。在50 mA/gel、20℃條件下電泳至溴酚藍(lán)指示劑跑出膠底。用純水沖去電泳液，倒入考染液，室溫染色1 h，然后倒入考染脫色液，室溫脫色至背景透明，使用UMAXPowerLook 2100xl掃描儀掃描雙向電泳凝膠并保存可用于膠圖分析的TIF圖，每個(gè)蛋白質(zhì)樣品重復(fù)3次。將掃描后膠圖導(dǎo)入IMAGEMASTER 5.0分析軟件中，分別分析每一張膠，將同一個(gè)樣品的3張膠圖擬合成一張?zhí)摂M膠圖進(jìn)行定量分析，得出3倍以上差異點(diǎn)和特異點(diǎn)列表。

1.2.3 差異蛋白質(zhì)質(zhì)譜檢測(cè) 使用液相二級(jí)質(zhì)譜（LC-MS-MS）檢測(cè)，得到肽指紋圖譜、肽段長(zhǎng)度、分子量等參數(shù)，基于這些參數(shù)進(jìn)行mascot搜索，得到與其匹配的蛋白。數(shù)據(jù)庫(kù)選擇NCBInr，種屬選擇Green Plants，氨基酸固定修飾方式選擇“Carbamidomethyl (C)”修飾，可變的修飾方式選擇“Gln->pyro-Glu (N-term Q)，Oxidation (M)”修飾，選取單同位素峰檢索，可接受的肽段分子量誤差設(shè)為15 ppm。

2 結(jié)果

2.1 蘆筍雌花蕾、雄花蕾與雄性兩性花蕾的雙向電泳圖譜分析

3種花蕾全蛋白雙向電泳后，得到電泳圖（圖1）。雌、雄花蕾相比，雄花蕾特異蛋白點(diǎn)25個(gè)，分子量主要在12—59 kD，pI主要在5.5—8.0，上調(diào)蛋白點(diǎn)5個(gè)（點(diǎn)43、48、58、155、233），分子量分別為16 kD、16 kD、17 kD、32 kD和43 kD，pI分別為6.0、5.8、5.8、8.4、7.5；雌花蕾特異蛋白點(diǎn)13個(gè)，分子量主要在21—39 kD，pI主要在4.9—6.9，上調(diào)蛋白點(diǎn)12個(gè)(點(diǎn)67、72、84、105、122、162、167、169、193、269、273、276)，分子量主要在15—56 kD，pI主要在5.4—6.3（表1）。雄性兩性花蕾與雄花蕾相比，雄性兩性花蕾特異蛋白點(diǎn)19個(gè)，分子量主要在11—33 kD，pI主要在5.0—6.4，上調(diào)蛋白點(diǎn)8個(gè)（點(diǎn)29、47、108、113、116、173、181、195），分子量主要在20—33 kD，pI主要在5.6—6.0（表2）。

用IMAGEMASTER 5.0軟件分析，得到3種花蕾的差異蛋白點(diǎn)電泳圖，如圖2。將上述雌、雄花蕾相比，雄花蕾特異且占全部蛋白量比例大于0.11%的15個(gè)蛋白點(diǎn)（點(diǎn)18、24、26、37、38、54、72、133、134、154、161、164、206、211、237）和上調(diào)量大于7.3倍的4個(gè)蛋白點(diǎn)（點(diǎn)43、48、58、233）；雌花蕾特異且占全部蛋白量比例大于0.20的8個(gè)蛋白點(diǎn)（點(diǎn)7、53、60、92、106、180、274、275）和上調(diào)量大于4.4倍的5個(gè)蛋白點(diǎn)（點(diǎn)84、167、169、273、276）；雄性兩性花蕾和雄花蕾相比，雄性兩性花蕾特異且占全部蛋白量比例大于0.30%的10個(gè)蛋白點(diǎn)（點(diǎn)59、63、64、69、71、72、79、82、175、195）和上調(diào)量大于4.3倍的4個(gè)蛋白點(diǎn)（點(diǎn)29、47、113、116）進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。

2.2 差異蛋白質(zhì)的質(zhì)譜鑒定和生物信息學(xué)分析

對(duì)差異表達(dá)蛋白點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。結(jié)果見表3。從表3可以看出，雄花蕾15個(gè)特異蛋白點(diǎn)中，鑒定出1種蛋白即早期開花蛋白（點(diǎn)54、211）和8種蘆筍同源蛋白，分別為ATP合成酶CF1α亞基（點(diǎn)18）、ATP合成酶β亞基（點(diǎn)161、206）、β淀粉酶（點(diǎn)24、26、37、38、72）、核糖體失活蛋白（點(diǎn)164）、胞質(zhì)磷酸甘油酸激酶（點(diǎn)237）、luminal binding protein (BiP)（點(diǎn)134）、PAP fibrillin（點(diǎn)154）和Os02g0634900（點(diǎn)133）。由于蛋白質(zhì)的翻譯后修飾在雙向電泳中很容易顯示出來，因此可能會(huì)造成在凝膠上不同蛋白點(diǎn)被鑒定為同一蛋白質(zhì)的現(xiàn)象，稱為重復(fù)點(diǎn)（multiple spots）。雄花蕾4個(gè)上調(diào)蛋白點(diǎn)中，共鑒定出3種蘆筍同源蛋白，分別為β淀粉酶（點(diǎn)43、58）、3-磷酸甘油醛脫氫酶（點(diǎn)48）和胞質(zhì)磷酸甘油酸激酶（點(diǎn)233）。雌花蕾8個(gè)特異蛋白點(diǎn)中，共鑒定出3種蛋白，即細(xì)胞內(nèi)病程相關(guān)蛋白亞型4（點(diǎn)53）、早期開花蛋白1（點(diǎn)60）和ATP合成酶β亞基（點(diǎn)274）；5種蘆筍同源蛋白，分別為細(xì)胞外膜孔道蛋白（點(diǎn)7）、放氧增強(qiáng)蛋白1（點(diǎn)180）、ATP合成酶β亞基（275）、ADP核糖基化因子相似蛋白（點(diǎn)92）和登錄號(hào)為gi|61968970、序列覆蓋率為38.4%認(rèn)定為磷酸甘油酸激酶的蛋白（點(diǎn)106）。雌花蕾5個(gè)上調(diào)蛋白點(diǎn)中，共鑒定出1種蛋白，即ATP合成酶β亞基（點(diǎn)276）；4種蘆筍同源蛋白，分別為烯醇化酶1（點(diǎn)84）、核糖體失活蛋白（點(diǎn)167）、肌動(dòng)蛋白亞型B（點(diǎn)169）和ATP合成酶CF1α亞基（點(diǎn)173）。其中ATP合成酶CF1α亞基、ATP合成酶β亞基、β淀粉酶、早期開花蛋白1、核糖體失活蛋白和胞質(zhì)磷酸甘油酸激酶在雌雄花蕾特異或上調(diào)同源蛋白中均存在。因此，雌、雄花蕾相比，luminal binding protein（BiP）、PAP fibrillin和Os02g0634900為蘆筍雄花蕾特異表達(dá)同源蛋白，β淀粉酶、3-磷酸甘油醛脫氫酶和胞質(zhì)磷酸甘油酸激酶為雄花蕾上調(diào)表達(dá)同源蛋白。而細(xì)胞外膜孔道蛋白、細(xì)胞內(nèi)病程相關(guān)蛋白亞型4、放氧增強(qiáng)蛋白1和ADP核糖基化因子相似蛋白為蘆筍雌花蕾特異表達(dá)同源蛋白，烯醇化酶1、核糖體失活蛋白、肌動(dòng)蛋白亞型B、ATP合成酶CF1α亞基和ATP合成酶β亞基為雌花蕾上調(diào)表達(dá)同源蛋白。

a、b、c為雌花蕾雙向電泳標(biāo)準(zhǔn)圖譜，d、e、f為雄花蕾雙向電泳標(biāo)準(zhǔn)圖譜，g、h、i為雄性兩性花蕾雙向電泳標(biāo)準(zhǔn)圖譜

表1 雌花蕾與雄花蕾差異表達(dá)蛋白點(diǎn)

表2 雄性兩性花蕾與雄花蕾差異表達(dá)蛋白點(diǎn)

從左到右依次為雌花蕾、雄花蕾和雄性兩性花蕾差異顯著表達(dá)蛋白點(diǎn)圖

表3 3種花蕾質(zhì)譜鑒定結(jié)果

雄性兩性花蕾10個(gè)特異蛋白點(diǎn)中，共鑒定出1種蛋白，即早期開花蛋白1（點(diǎn)71）；8種蘆筍同源蛋白，分別為核苷二磷酸激酶（點(diǎn)59）、3-磷酸甘油醛脫氫酶（點(diǎn)63、64）、ATP合成酶α亞基（點(diǎn)69）、脂質(zhì)相關(guān)蛋白（點(diǎn)72）、β淀粉酶（點(diǎn)79）、假想蛋白（點(diǎn)82）、肌動(dòng)蛋白（點(diǎn)175）和放氧增強(qiáng)蛋白1（點(diǎn)195）。4個(gè)上調(diào)蛋白點(diǎn)中共鑒定出4種蘆筍同源蛋白，分別為細(xì)胞外膜孔道蛋白（點(diǎn)29）、小GTP結(jié)合蛋白（點(diǎn)47）、GTP結(jié)合蛋白（點(diǎn)113）和磷酸甘油酸激酶（點(diǎn)116）。其中早期開花蛋白1、3-磷酸甘油醛脫氫酶、ATP合成酶α亞基和β淀粉酶在雄花蕾特異或上調(diào)同源蛋白中均存在。因此，與雄花蕾相比，核苷二磷酸激酶、脂質(zhì)相關(guān)蛋白、假想蛋白、肌動(dòng)蛋白和放氧增強(qiáng)蛋白1為蘆筍雄性兩性花蕾特異表達(dá)同源蛋白；小GTP結(jié)合蛋白、GTP結(jié)合蛋白、細(xì)胞外膜孔道蛋白和磷酸甘油酸激酶為雄性兩性花蕾上調(diào)表達(dá)同源蛋白。其中放氧增強(qiáng)蛋白1和細(xì)胞外膜孔道蛋白同時(shí)出現(xiàn)在雌花蕾和雄性兩性花蕾的特異或上調(diào)表達(dá)同源蛋白中，可能為蘆筍雌性器官發(fā)育的關(guān)鍵蛋白。

3 討論

關(guān)于植物性別分化特異蛋白的研究已有很多報(bào)道，但大多停留在檢測(cè)條帶差異性與分子量上[24-28]。本研究利用雙向電泳、質(zhì)譜鑒定和生物信息學(xué)分析相結(jié)合的技術(shù)方法，研究了蘆筍雌株、雄株和雄性兩性株進(jìn)入兩性分化期的花蕾的差異蛋白，經(jīng)質(zhì)譜鑒定和生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)蘆筍同源蛋白luminal binding protein（BiP）、PAP fibrillin和Os02g0634900在雄花蕾中特異表達(dá)，β淀粉酶、3-磷酸甘油醛脫氫酶和胞質(zhì)磷酸甘油酸激酶在雄花蕾中上調(diào)表達(dá)，它們可能與蘆筍雄性器官選擇性發(fā)育相關(guān)。其中l(wèi)uminal binding protein是一種分子伴侶，其過表達(dá)有助于α淀粉酶合成[29]。PAP fibrillin是由核基因編碼，與質(zhì)體相關(guān)的脂連接蛋白[30]。Os02g0634900功能尚未見報(bào)道。β淀粉酶可將直鏈淀粉分解成麥芽糖，3-磷酸甘油醛脫氫酶和胞質(zhì)磷酸甘油酸激酶參與糖酵解中的放能階段?？梢?，蘆筍雄性器官選擇性發(fā)育需要大量可溶性糖和更多的能量物質(zhì)，所以β淀粉酶，3-磷酸甘油醛脫氫酶和胞質(zhì)磷酸甘油酸激酶表達(dá)量增加。王學(xué)德[31]研究表明，棉花花藥內(nèi)雄性細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育對(duì)碳水化合物等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的需求可促進(jìn)淀粉酶基因的表達(dá)和活性的提高，本研究結(jié)果與其結(jié)論一致。

本研究發(fā)現(xiàn)，與雄花蕾相比，在蘆筍雌花蕾和雄性兩性花蕾中特異表達(dá)或上調(diào)表達(dá)的同源蛋白有16個(gè)。其中蘆筍同源蛋白細(xì)胞外膜孔道蛋白、細(xì)胞內(nèi)病程相關(guān)蛋白亞型4、放氧增強(qiáng)蛋白1和ADP核糖基化因子相似蛋白在雌花蕾中特異表達(dá)；烯醇化酶1、核糖體失活蛋白、肌動(dòng)蛋白亞型B、ATP合成酶CF1α亞基和ATP合成酶β亞基在雌花蕾中上調(diào)表達(dá)。核苷二磷酸激酶、脂質(zhì)相關(guān)蛋白、假想蛋白、肌動(dòng)蛋白和放氧增強(qiáng)蛋白1在雄性兩性花蕾中特異表達(dá)、小GTP結(jié)合蛋白、GTP結(jié)合蛋白、細(xì)胞外膜孔道蛋白和磷酸甘油酸激酶在雄性兩性花蕾中上調(diào)表達(dá)。它們都有可能與蘆筍雌性器官的選擇性發(fā)育有關(guān)。放氧增強(qiáng)蛋白1和細(xì)胞外膜孔道蛋白同時(shí)出現(xiàn)在雌花蕾和雄性兩性花蕾的特異或上調(diào)表達(dá)同源蛋白中，可能為蘆筍雌性器官發(fā)育的關(guān)鍵蛋白。細(xì)胞外膜孔道蛋白參與離子，糖和氨基酸被動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)穿過外膜。放氧增強(qiáng)蛋白1是與光合作用（光系統(tǒng)Ⅱ）有關(guān)的蛋白。另外，蘆筍同源蛋白肌動(dòng)蛋白亞型B在雌花蕾中的表達(dá)量為雄花蕾的4.5倍，肌動(dòng)蛋白為雄兩性花蕾的特異蛋白，表明肌動(dòng)蛋白可能在蘆筍雌性器官發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用。肌動(dòng)蛋白在形成細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)，維持細(xì)胞形態(tài)等方面具有重要作用。這與胡青[19]報(bào)道的文冠果子房膨大，胚珠發(fā)育成熟，需要細(xì)胞壁具有較強(qiáng)的延展性，以維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)的研究結(jié)果一致。

烯醇化酶1和磷酸甘油酸激酶參與糖酵解過程。但Ucker等[32]報(bào)道，過量表達(dá)的烯醇化酶1也可能是細(xì)胞凋亡的早期表現(xiàn)。在凋亡細(xì)胞中，烯醇化酶1失去了糖酵解酶的活性，作為纖溶酶原受體參與調(diào)控細(xì)胞凋亡的過程[33]。蘆筍雌花蕾中同源蛋白烯醇化酶1表達(dá)量增加，也可能與雌花蕾中的雄性生殖細(xì)胞的凋亡有關(guān)。ATP合成酶α亞基和ATP合成酶β亞基參與ATP的合成。核苷二磷酸激酶可以維持NDP和NTP代謝平衡，參與植物細(xì)胞的生長(zhǎng)與分化，光敏色素A和氧化脅迫相應(yīng)中的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等生命活動(dòng)[34]。GTP結(jié)合蛋白參與細(xì)胞通訊，核糖體與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)合，小泡運(yùn)輸，蛋白質(zhì)合成等；小GTP結(jié)合蛋白在細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的運(yùn)輸過程中起重要作用；核糖體失活蛋白抑制蛋白質(zhì)的合成；脂質(zhì)相關(guān)蛋白參與脂質(zhì)合成。細(xì)胞內(nèi)病程相關(guān)蛋白亞型4，假想蛋白功能尚未見報(bào)道。它們與蘆筍雌性器官發(fā)育的關(guān)系尚有待進(jìn)一步研究。

從本研究鑒定出的蛋白及其功能來看，涉及光合作用、糖酵解、能量代謝、維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)、物質(zhì)運(yùn)輸、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)合成等過程的多種蛋白。性別分化是一個(gè)復(fù)雜的過程，尚需對(duì)這些蛋白質(zhì)進(jìn)行純化，制作探針，用于性別分化基因的定位研究。

4 結(jié)論

蘆筍雄性器官發(fā)育涉及糖代謝、α淀粉酶合成、質(zhì)體相關(guān)和未知功能的蛋白等4類蘆筍同源蛋白，包括3種參與糖代謝的蛋白，分別為β淀粉酶、3-磷酸甘油醛脫氫酶和胞質(zhì)磷酸甘油酸激酶；1種促進(jìn)α淀粉酶合成的蛋白，即luminal binding protein（BiP）；1種質(zhì)體相關(guān)蛋白即PAP fibrillin和1種未知功能的蛋白Os02g0634900。雌性器官發(fā)育涉及糖酵解過程、維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)、能量代謝、細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)運(yùn)輸、蛋白質(zhì)合成、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、催化磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移、脂質(zhì)代謝、光合作用過程和未知功能的蛋白等10類蘆筍同源蛋白，包括2種參與糖酵解過程的蛋白，分別為烯醇化酶1和胞質(zhì)磷酸甘油酸激酶；2種維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)的蛋白，分別為肌動(dòng)蛋白亞型B和肌動(dòng)蛋白；2種與能量代謝有關(guān)的蛋白，分別為ATP合成酶CF1α亞基和ATP合成酶β亞基；3種與細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)運(yùn)輸有關(guān)的蛋白，分別為小GTP結(jié)合蛋白、GTP結(jié)合蛋白和細(xì)胞外膜孔道蛋白；1種與蛋白質(zhì)合成有關(guān)的蛋白，即核糖體失活蛋白；1種與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)的蛋白，即ADP核糖激化因子相似蛋白；1種催化磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移的蛋白，即核苷二磷酸激酶；1種參與脂質(zhì)代謝的蛋白，即脂質(zhì)相關(guān)蛋白；1種參與光合作用過程的蛋白，即放氧增強(qiáng)蛋白1；2種未知功能的蛋白，分別為細(xì)胞內(nèi)病程相關(guān)蛋白亞型4和假想蛋白。放氧增強(qiáng)蛋白1和細(xì)胞外膜孔道蛋白可能為蘆筍雌性器官發(fā)育的關(guān)鍵同源蛋白。

References：

[1] Chin C K, Garrison S A. Functional elements from asparagus for human health., 2008, 776: 219-225.

[2] 李翠霞, 毛箬青, 李志忠, 王永剛, 劉曉風(fēng). 蘆筍營(yíng)養(yǎng)成分的分析評(píng)價(jià). 現(xiàn)代食品科技, 2011, 27(10): 1260-1263.

LI C X, MAO R Q, LI Z Z, WANG Y G, LIU X F. Composition analysis and nutritional evaluation of the., 2011, 27(10): 1260-1263. (in Chinese)

[3] WANG L W, ZHAO B, HUANG Y X. Determination of diosgenin inbyproduct by RP-HPLC., 2011, 2(1): 42-44.

[4] Mitchell C H, Diggle P K. The evolution of unisexual flowers: morphological and functional convergence results from diverse developmental transitions., 2005, 92(7): 1068-1076.

[5] LONGO G P M, CAPORALI E, CARBONI A, SPADA A, FALAVIGNA A, NICHOLS M, SWAIN D. Transition from hermaphroditic to unisexual flowers in male and female plants of asparagus., 1996, 415: 151-155.

[6] 陳光宇, 周勁松, 湯泳萍, 羅紹春, 占豐溪, 尹富強(qiáng). 蘆筍兩性株利用的初步研究. 園藝學(xué)報(bào), 2007, 34(6): 1530.

CHEN G Y, ZHOU J S, TANG Y P, LUO S C, ZHAN F X, YIN F Q.Preliminary utilization on the andromonoecious plants of the Asparagus., 2007, 34(6): 1530. (in Chinese)

[7] BRACAL M, CAPORALI E, GALLI M G, LONGO C, MARZIANI- LONGO G, ROSSI G, SPA A, SOAV C, FALAVIGN A, RAFFALDI F, MAESTRI E, RESTIVOC F M, TASSIC F. Sex determination and differentiation inL., 1991, 80(1/2): 67-77.

[8] REAMON-BUTTNER S M, JUNG C. AFLP-derived STS markers for the identification of sex inL., 2000, 100(3/4): 432-438.

[9] JAMSARI A, NITZ I, Reamon-Buttner S M, JUNG C. BAC-derived diagnosetic markers for sex determination in asparagus., 2004, 108(6): 1140-1146.

[10] 周勁松, 湯泳萍, 羅紹春, 尹富強(qiáng), 占豐溪, 梁國(guó)華, 陳光宇. DNA分子標(biāo)記早期快速鑒別蘆筍雌雄株. 分子植物育種, 2007, 15(3): 363-366.

ZHOU J S, TANG Y P, LUO S C, YIN F Q, ZHAN F X, LIANG G H, CHEN G Y. Quick distinguishing the sex ofplant at early growth stage by a STS marker., 2007, 15(3): 363-366. (in Chinese)

[11] SINTON S M, WILSON D R, BENSON B. Comparative performance of male and female plants during the annual growth cycle of a dioecious asparagus cultivar., 1999, 479: 347-353.

[12] 陳光宇, 周勁松, 湯泳萍, 羅紹春, 占豐溪, 尹富強(qiáng). 蘆筍兩性株調(diào)查與初步利用研究. 江西農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 2007, 19(9): 31-34.

CHEN G Y, ZHOU J S, TANG Y P, LUO S C, ZHAN F X, YIN F Q. Investigation and preliminary utilization of andromonoecious plants of., 2007, 19(9): 31-34. (in Chinese)

[13] 周勁松, 湯泳萍, 盛文濤, 羅紹春, 陳光宇. 蘆筍性別決定與性別分化研究進(jìn)展. 植物遺傳資源學(xué)報(bào), 2010, 11(5): 600-604.

ZHOU J S, TANG Y P, SHENG W T, LUO S C, CHEN G Y. Progress in research on sex determination and differentiation inL., 2010, 11(5): 600-604. (in Chinese)

[14] LOSA A, CAPORALI E, SPADA A, MARTINELLI S, MARZIANI G. AOM3 and AOM4: two MADS box genes expressed in reproductive structures of., 2004, 16(5): 215-221.

[15] PARK J H, ISHIKAWA Y C, YOSHIDA R, KANNO A, KAMEYA T. Expression of AODEF, a B-functional MADS-box gene,instamens and inner tepals of the dioecious speciesL., 2003, 51(6): 867-875.

[16] KANNO A, HIENUKI H, ITO T, NAKAMURA T, FUKUDA T, YUN P Y,SONG I J, KAMIMURA T, OCHIAI T, YOKOYAMA J, MAKIi M, KAMEYA T. The structure and expression of SEPALLATA-like genes in(Asparagaceae)., 2006, 19(3): 133-144.

[17] ALEX H, FRANCESCO M, SHAN H Y, FRANCESCO S, AGOSTINO F, JIM L M. Sex-biased gene expression in dioecious garden asparagus()., 2015, 207(3): 883-892.

[18] 張鵬, 朱育強(qiáng), 陳新娟, 陳麗萍, 周勝軍. 差異蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)及其在園藝植物中的應(yīng)用. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào), 2011, 27(4): 212-218.

ZHANG P, ZHU Y Q, CHEN X J, CHEN L P, ZHOU S J. Differential proteomics technology and its application in horticultural plants., 2011, 27(4): 212-218. (in Chinese)

[19] 胡青. 文冠果兩種不同類型花中雌蕊發(fā)育情況的比較研究[D]. 北京: 北京林業(yè)大學(xué), 2004.

Hu Q. The comparative study on pistil development in two different kinds of flowers ofBunge [D]. Beijing: Beijing Forestry University, 2004. (in Chinese)

[20] 汪俏梅, 曾廣文. 苦瓜性別分化的特異蛋白質(zhì)研究. 植物學(xué)報(bào), 1998,42(3): 58-63.

WANG Q M, ZENG G W. Study of specific protein on sex differentiation of., 1998, 42(3): 58-63. (in Chinese)

[21] 林鳴, 曹宗巽. 黃瓜器官特異蛋白的研究. 植物學(xué)報(bào), 1996, 40(7): 525-529, 588.

LIN M, CAO Z X.The floral-specific proteins of cucumber., 1996, 40(7): 525-529, 588. (in Chinese)

[22] 王珊, 蔡斌華, 章鎮(zhèn), 侯計(jì)華, 徐軍霞, 高志紅. 果梅完全花與不完全花的差異蛋白分析. 植物遺傳資源學(xué)報(bào), 2008, 9(4): 465-468.

WANG S, CAI B H, ZHANG Z, HOU J H, XU J X, GAO Z H. Analysis of differential proteins in perfect and imperfect flowers of Japanese Apricot (Prunusmume Sieb. et Zucc.)., 2008, 9(4): 465-468. (in Chinese)

[23] 胡淑明, 陳海媛, 王海燕, 乜蘭春. 蘆筍雌雄花發(fā)育過程的解剖學(xué)觀察. 河北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2013, 36(1): 25-27, 45.

HU S M, CHEN H Y, WANG H Y, NIE L C. Anatomical observation on the developmental stages ofL. staminate and pistillate flowers., 2013, 36(1): 25-27, 45. (in Chinese)

[24] 于靜娟, 徐南方, 孟繁靜. 大麻雄蕊特異蛋白質(zhì)的初步研究. 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 1997, 2(3): 78.

YU J J, XU N F, MENG F J. Study of stamen specilie protein of hemp., 1997, 2(3): 78. (in Chinese)

[25] 龐廣昌, 馬全祥, 王宇, 張波. 利用單花粉蛋白電泳技術(shù)對(duì)玉米花粉發(fā)育過程特異蛋白表達(dá)的研究. 西北植物學(xué)報(bào), 1996, 16(1): 28-33.

PANG G C, MA Q X, WANG Y, ZHANG B. Studies on expression of specific proteins during pollen development ofL. single pollen grain protein electrophoresis., 1996, 16(1): 28-33. (in Chinese)

[26] 于鳳池, 孫耘子, 袁高峰, 汪俏梅. 栝樓性別分化特異大分子標(biāo)記物研究. 浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 2003, 15(6): 8-11.

YU F C, SUN Y Z, YUAN G F, WANG Q M. Studies on the specific macromolecular markers of sex differentiation inMaxim., 2003, 15(6): 8-11. (in Chinese)

[27] VERGNE P, RICCARDI F, BECKERT M, DUMAS C. Identification of a 32-kDa anther marker protein for androgenic response in maize,L., 1993, 86(7): 843-850.

[28] Golan-Goldhirsh A, Peri I, Yehudith B, Smirnoff P. Inflorescence bud proteins of., 1998, 12(7): 415.

[29] 張達(dá)瀚, 張屹. 水稻S5-ORF3蛋白質(zhì)的進(jìn)化分析. 河北科技大學(xué)學(xué)報(bào), 2014, 35(4): 397-402.

ZHANG D H, ZHANG Y. Evolution analysis of rice protein S5-ORF3., 2014, 35(4): 397-402.(in Chinese)

[30] 滕蕾, 黃瑾, 趙竹露, 李旭鋒, 楊毅. Fibrillin操縱子在甘藍(lán)型油菜和擬南芥中的瞬時(shí)表達(dá). 四川大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 2006, 43(6): 1394-1398.

TENG L, HUANG J, ZHAO Z L, LI X F, YANG Y. Transient expression of Fibrillin promoter in protoplasts ofand., 2006, 43(6): 1394-1398. (in Chinese)

[31] 王學(xué)德. 棉花細(xì)胞質(zhì)雄性不育花藥的淀粉酶與碳水化合物. 棉花學(xué)報(bào), 1999, 11(3): 113-116.

WANG X D. Amylase and carbohydrate in anthers of cytoplasmic male sterile cotton., 1999, 11(3): 113-116. (in Chinese)

[32] UCKER D S, JAIN M R, PATTABIRAMAN G, PALASIEWICZ K, BIRGE R B, LI H. Externalized glycolytic enzymes are novel, conserved, and early biomarkers of apoptosis., 2012, 287(13): 10325-10343.

[33] O,mullane M J, Baker M S. Loss of cell viability dramatically elevates cell surface plasminogen binding and activation., 1998, 242(1): 153-164.

[34] 王文斌, 王金勝, 鄧西平, 劉建東. 植物核苷二磷酸激酶(NDPKs)研究進(jìn)展. 農(nóng)學(xué)學(xué)報(bào), 2011, 1(6): 1-5.

WANG W B, WANG J S, DENG X P, LIU J D. Research advances on nucleoside diphosphate kinases (NDPKs) of plants., 2011, 1(6): 1-5. (in Chinese)

（責(zé)任編輯 趙伶俐）

Expression Analysis of Differential Proteins in Three Kinds of Flower Buds with Sex Differentiation of Asparagus

LIU Meng, NIE Lan-chun, WANG Shan-shan, HU Shu-ming

(College of Horticulture, Agriculture University of Hebei, Baoding 071000, Hebei)

【Objective】 To investigate the proteins which are related to the sex differentiation, and lay a foundation for revealing the molecular mechanism of sex differentiation inL. 【Method】Differential proteins were analyzed in female flower buds, male flower buds and hermaphroditic flower buds at hermaphroditic differentiation stage by 2-D electrophoresis, mass spectrometry and bioinformatics method. 【Result】Compared male and female flower buds, 25 specific protein spots and 5 up-regulated protein spots were detected in male flower buds, 13 specific protein spots and 12 up-regulated protein spots were detected in female flower buds. Compared with male flower buds, 19 specific protein spots and 8 up-regulated protein spots were detected in hermaphroditic flower buds. The proteins were identified by LC-MS-MS and analyzed through bioinformatics. Six specific or up-regulated homologous proteins ofwere identified in male flower buds, including luminal binding protein (BiP) which promoted the synthesis of alpha amylase; beta-amylase, glyceraldehyde-3-phosphate and cytosolic phosphoglycerate kinase which are all involved in the glycolytic pathway, PAP fibrillin which is associated with liposomes,Os02g0634900 which its function is unknown. There were 16 specific or up-regulated homologous proteins ofwere identified in hermaphroditic and female flower buds, including enolase 1 and cytosolic phospho-glycerate kinase which are involved in the glycolytic pathway, actin isoform B and actin which maintained cell structure, ATP synthase CF1 alpha subunit and ATP synthase beta subunit which participated in energy metabolism;small GTP-binding protein and GTP-binding protein which participated in material transportation, ribosome inactivating protein RIPm which depressed protein synthesis, ADP-ribosylation factor which participated in material transportation and signal transduction, nucleoside diphosphate kinase which catalyzed phosphate group transfer, plastid-lipid-associated protein which participated in lipid metabolism,oxygen-evolving enhancer protein 1 which was related to photosynthesis, porin which allowed ions, sugars and amino acids across the outer membrane, intracellular pathogenesis-related protein isoform 4 and hypothetical protein which their functions are unknown.【Conclusion】Beta-amylase,glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, cytosolic phosphoglycerate kinase, luminal binding protein (BiP), PAP fibrillin and Os02g0634900 which are homologous proteins ofare related to the male organ development. Enolase 1, cytosolic phosphoglycerate kinase, actin isoform B, actin, ATP synthase CF1 alpha subunit, small GTP-binding protein, GTP-binding protein, ribosome inactivating protein RIPm, with strong similarity to ADP-ribosylation factor, nucleoside diphosphate kinase, plastid-lipid-associated protein, oxygen-evolving enhancer protein 1, porin and hypothetical protein which are homologous proteins of, ATP synthase beta subunit and intracellular pathogenesis-related protein isoform 4 are related to the female organ development. Oxygen-evolving enhancer protein 1 and porin which are homologous proteins ofmight be the key proteins of female organ’s development.

; female flower buds; male flower buds; hermaphroditic flower buds; sex differentiation; differential proteins

2016-04-15；接受日期：2016-08-25

河北省自然科學(xué)基金（C2012204065）

聯(lián)系方式：劉孟，Tel：15933589812；E-mail：hbndsclm10@163.com。通信作者乜蘭春，Tel：13784960296；E-mail：nlch66@126.com