殷浩白志毅韓學(xué)凱李家樂

（1. 上海海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)部淡水水產(chǎn)種質(zhì)資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 201306；2. 上海市水產(chǎn)養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心，上海 201306）

三角帆蚌微衛(wèi)星多重PCR體系的建立及其應(yīng)用

殷浩1，2白志毅1，2韓學(xué)凱1，2李家樂1，2

（1. 上海海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)部淡水水產(chǎn)種質(zhì)資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 201306；2. 上海市水產(chǎn)養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心，上海 201306）

為了提高三角帆蚌微衛(wèi)星分析效率，從已開發(fā)的微衛(wèi)星標(biāo)記中構(gòu)建了三組四重PCR，并將穩(wěn)定的多重PCR體系用于56個三角帆蚌紫色選育系的遺傳多樣性研究。結(jié)果表明該群體的平均等位基因數(shù)18.75，平均有效等位基因數(shù)為9.010，平均多態(tài)信息含量為0.857，平均觀測雜合度和期望雜合度分別為0.809和0.876，香農(nóng)多樣性指數(shù)為2.422。運(yùn)用Cervus v3.0 軟件對3個三角帆蚌全同胞家系共114個個體進(jìn)行親子鑒定，結(jié)果顯示，使用該3組微衛(wèi)星多重PCR體系進(jìn)行親子鑒定準(zhǔn)確率為100%。該三角帆蚌微衛(wèi)星多重PCR應(yīng)用于三角帆蚌群體遺傳多樣性分析、親子鑒定和家系管理等，可提高工作效率，降低實(shí)驗(yàn)成本。

三角帆蚌；微衛(wèi)星；多重PCR；遺傳多樣性；親子鑒定

三角帆蚌（Hyriopsis cumingii）作為我國特有的淡水珍珠蚌，孕育出世界上近80%的淡水珍珠［1］。我國三角帆蚌種質(zhì)資源豐富，尤以五大湖區(qū)的野生種群分布廣泛，其中鄱陽湖和洞庭湖種群生長和育珠性能最為優(yōu)良［2］。自從20世紀(jì)70年代三角帆蚌的人工繁殖實(shí)驗(yàn)成功之后，珍珠蚌養(yǎng)殖和生產(chǎn)出現(xiàn)大幅增長，但是育苗場人工育苗往往以利益為先，使得養(yǎng)殖品種質(zhì)量退化，近交嚴(yán)重，所產(chǎn)珍珠品質(zhì)低下。加之環(huán)境污染和過度捕撈野生資源遭到破壞，部分地區(qū)甚至出現(xiàn)滅絕。為了解決這些問題，展開了大量關(guān)于三角帆蚌種質(zhì)開發(fā)和保護(hù)的研究，包括五大湖區(qū)野生資源調(diào)查［3，4］、不同種質(zhì)生長性狀比較［2，5］、遺傳參數(shù)估計(jì)［6-8］，以及遺傳圖譜的繪制［9］。

微衛(wèi)星標(biāo)記具有高度多態(tài)性，在基因組廣泛分布，共顯性遺傳，以及符合孟德爾遺傳定律等優(yōu)點(diǎn)，是育種中理想的分子標(biāo)記。在三角帆蚌研究中，從第一批微衛(wèi)星標(biāo)記開發(fā)以來，研究人員已經(jīng)陸續(xù)開發(fā)了500多對微衛(wèi)星標(biāo)記［9-11］。最初微衛(wèi)星標(biāo)記主要運(yùn)用在五大湖區(qū)三角帆蚌野生資源的調(diào)查工作，逐步明晰了我國三角帆蚌資源的分布與親緣關(guān)系等［4］。但是，相比野生群體，養(yǎng)殖群體總存在哈迪—溫伯格平衡偏離和變異性下降的問題。三角帆蚌人工繁殖實(shí)驗(yàn)成功以后，許多苗種供應(yīng)商只依靠少量野生親本進(jìn)行多代的連續(xù)繁殖，并且不控制親本數(shù)量，這就導(dǎo)致了親本變異性的下降和近交退化。

現(xiàn)階段改變?nèi)欠鲳B(yǎng)殖場選育策略應(yīng)該注意群體選育后代的遺傳變化情況，適時地引進(jìn)優(yōu)異親本；同時開展有效的家系選育項(xiàng)目，在操作過程中要記錄好家系信息，以防止遺傳侵蝕和基因流失。利用高效穩(wěn)定、經(jīng)濟(jì)節(jié)約的多重PCR技術(shù)，監(jiān)測選育項(xiàng)目進(jìn)展已成為必要環(huán)節(jié)。微衛(wèi)星多重PCR技術(shù)已廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)動物的遺傳分析和親子鑒定。如斑節(jié)對蝦（Penaeus monodon）［12］、三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus）［13］、中國明對蝦（Fenneropenaeus chinensis）［14］、長牡蠣（Crassostrea gigas）［15］、皺紋盤鮑（Haliotis discus hannai）［16］。目前還未見有關(guān)三角帆蚌微衛(wèi)星多重PCR體系建立和應(yīng)用的報道。本研究擬通過建立一套微衛(wèi)星多重PCR體系，結(jié)合基因掃描技術(shù)達(dá)到位點(diǎn)的自動化分析和檢測，給三角帆蚌群體選育和家系管理提供了一種穩(wěn)定而廉價的標(biāo)記工具。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)蚌采集自3個養(yǎng)殖群體，首先是開發(fā)適用于三角帆蚌的微衛(wèi)星多重PCR的實(shí)驗(yàn)樣品來自實(shí)驗(yàn)室2014年4月份采集的浙江武義偉民水產(chǎn)養(yǎng)殖公司的三角帆蚌15只；將構(gòu)建好的微衛(wèi)星多重PCR體系運(yùn)用于太湖群體紫色選育系F1代（50雄性，36雌性）遺傳多樣性研究；最后，利用本實(shí)驗(yàn)室經(jīng)過多年選育得到的三角帆蚌F5代家系進(jìn)行親子鑒定，隨機(jī)挑選其中3個家系（編號P1、D1、K2），每個家系取樣 36 個個體，以及各家系對應(yīng)的親本。所有樣品剪取斧足，將其固定在無水乙醇中備用。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA的提取和檢測 用苯酚/氯仿法抽提三角帆蚌基因組DNA，100 μL雙蒸水溶解。DNA濃度和純度通過NanoDrop 2000C分光光度計(jì)測量，完整性用1% 瓊脂糖凝膠檢測，隨后對應(yīng)稀釋成40-50 ng/μL的實(shí)驗(yàn)濃度，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 微衛(wèi)星多重PCR的設(shè)計(jì)和優(yōu)化 首先根據(jù)實(shí)驗(yàn)室繪制遺傳圖譜提供的微衛(wèi)星位點(diǎn)信息，主要包括所在連鎖群的位置、位點(diǎn)多態(tài)性和片段大小等特性，選取40個微衛(wèi)星候選位點(diǎn)，所選微衛(wèi)星位點(diǎn)的最適退火溫度均為55℃。之后，對所有40個位點(diǎn)進(jìn)行單一引物擴(kuò)增，以擴(kuò)增效率，條帶清晰程度以及亮度為條件，挑選出最好的24個微衛(wèi)星標(biāo)記用于多重PCR的開發(fā)。用熒光基團(tuán)FAM 或 HEX 修飾其上游引物 5' 端，熒光基團(tuán)的修飾引物由上海邁浦生物科技有限公司合成。初始20 μL的PCR反應(yīng)體系：10 μL 2 x Taq PCR Mastermix（0.1 U Taq Polymerase / μL、500 μmol/L dNTP、20 mmol/L Tris-HCl pH 8.3、100 mmol/L KCl、3 mmol/L MgCl2），10 mmol / L 引物對各 0.25 μL，基因組DNA 2 μL，無菌水補(bǔ)充到20 μL，其中2×Taq PCR Mastermix 購自天根生化科技（北京）有限公司。PCR 擴(kuò)增程序：94℃ 預(yù)變性 3 min；94℃ 變性1 min，退火 1 min，72℃ 延伸1 min，擴(kuò)增 35 個循環(huán)；再 72℃ 延伸 10 min，最后10℃ 保存。PCR擴(kuò)增反應(yīng)在Eppendorf Mastercycler pro 384梯度PCR儀（Eppendorf，德國）上進(jìn)行。熒光標(biāo)記的 PCR 產(chǎn)物由上海邁浦生物科技有限公司進(jìn)行STR 測序分析（毛細(xì)管電泳檢測ABI 3730XL全自動DNA測序儀）。

微衛(wèi)星多重PCR反應(yīng)體系的組合。根據(jù)單個微衛(wèi)星位點(diǎn)的 PCR 擴(kuò)增結(jié)果，挑選沒有非特異性條帶的24對引物。將最適的退火溫度、目的片段大小范圍以及引物序列等信息輸入到Multiplex Manager1.0軟件［17］，設(shè)置相應(yīng)的參數(shù)，所用的熒光標(biāo)記設(shè)置為2種、單個循環(huán)體系中能夠容納的最大引物數(shù)為4、引物序列互補(bǔ)的臨界值以及相同染料顏色等位基因最小差距等。將相應(yīng)的參數(shù)設(shè)置完成后，輸出軟件計(jì)算結(jié)果，對于相應(yīng)結(jié)果挑選目的片段長度差異大于50 bp的微衛(wèi)星組合進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。首先進(jìn)行3個位點(diǎn)的組合實(shí)驗(yàn)，獲得清晰的目的條帶后再添加一條引物進(jìn)行四重PCR擴(kuò)增，反復(fù)實(shí)驗(yàn)直到能夠擴(kuò)增得到條帶均一且清晰組合為止。

微衛(wèi)星多重PCR反應(yīng)體系的調(diào)整優(yōu)化。對于實(shí)驗(yàn)結(jié)果要嚴(yán)格區(qū)別多重PCR反應(yīng)產(chǎn)物中4組峰值是否為對應(yīng)引物產(chǎn)物，避免出現(xiàn)高度相似的引物間錯配；根據(jù)分型后峰值的相對高低調(diào)整引物的相對濃度，每次調(diào)整單個引物濃度的增減量為0.05 μL；為保證添加值極小的引物能夠精確點(diǎn)樣，可以增加總點(diǎn)樣管數(shù)，先將多對引物組充分混勻，再平均點(diǎn)樣，有效保證極低濃度引物的按量添加，最終使擴(kuò)增效率達(dá)到基本一致。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

所有的STR 基因型分析，使用GeneMapper v4.0軟件讀取微衛(wèi)星等位基因數(shù)據(jù)，利用 Cervus v3.0 軟件分析12個微衛(wèi)星位點(diǎn)的等位基因數(shù)（A）、觀測雜合度（Ho）、期望雜合度（He）和多態(tài)信息含量（PIC），而有效等位基因數(shù)（An）、香農(nóng)多樣性指數(shù)（I）通過Popgene v1.32計(jì)算。親子鑒定根據(jù)兩種方法計(jì)算得來：（1）采用x2檢驗(yàn)檢測在子代中等位基因的分離比是否符合孟德爾遺傳規(guī)律，顯著性水平設(shè)為P＞0.01；（2）利用Cervus v3.0 的Paternity 功能進(jìn)行模擬分析完成。

2 結(jié)果

2.1 微衛(wèi)星多重PCR的建立

表 1 三角帆蚌 3 組微衛(wèi)星多重 PCR 的特性

利用Multiplex Manager1.0軟件將24對高度多態(tài)性的微衛(wèi)星位點(diǎn)成功的組合出6組的微衛(wèi)星多重PCR體系。將得到引物組合依次實(shí)驗(yàn)，除去沒有擴(kuò)增出來的引物組合、能夠得到4條的組合調(diào)整引物濃度使得每對引物的擴(kuò)增效率相似，最后成功組合出3組4重微衛(wèi)星多重PCR體系（表1）。

2.2 應(yīng)用微衛(wèi)星多重PCR分析三角帆蚌紫色選育系遺傳多樣性

微衛(wèi)星多重PCR工具對太湖群體紫色選育系F1代56個個體進(jìn)行分析，12個位點(diǎn)在群體中表現(xiàn)出較高的多態(tài)性，平均等位基因數(shù)到達(dá)了18.75，每個位點(diǎn)的等位基因數(shù)（A）12-25；有效等位基因數(shù)（An）3.959-15.525，平均有效等位基因數(shù)9.010；觀測雜合度（Ho）0.518-1.000，平均觀測雜合度0.809；期望雜合度（He）0.754-0.944，平均期望雜合度0.876；多態(tài)信息含量（PIC）0.728-0.932，平均多態(tài)性信息含0.857；香農(nóng)多樣性指數(shù)（I）1.907-2.935，平均香農(nóng)多樣性指數(shù)2.422（表2）。從STR分型部分峰值圖（圖1）可以看到，使用的微衛(wèi)星多重PCR具有穩(wěn)定和均一的擴(kuò)增效果，能夠適用于三角帆蚌的遺傳多樣性研究。總體而言，紫殼色三角帆蚌養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性較高，具有較高的改良潛力。

2.3 微衛(wèi)星多重PCR在家系鑒定中的應(yīng)用

在3個家系中12個微衛(wèi)星位點(diǎn)的等位基因數(shù)（A）從7到15，平均等位基因數(shù)為10.50。多態(tài)信息含量（PIC）為0.682-0.912，平均多態(tài)信息含量為0.8176，反映了這個多重PCR工具在家系鑒定中具有較高的排除能力。其觀測雜合度（Ho）范圍為0.265-0.980，平均觀測雜合度為0.724，期望雜合度（He）范圍為0.720-0.921，平均期望雜合度為0.839。

利用Cervus v3.0 軟件進(jìn)行家系鑒定顯示（表3），所有微衛(wèi)星位點(diǎn)均能匹配，12個微衛(wèi)星位點(diǎn)親本基因型未知的累積排除率為99.92%，已知一個親本基因型時的累積排除率為99.99%；并且子代個體的分離比符合孟德爾遺傳定律，在子代中等位基因分別來自父母本。分析3個家系的分離模式發(fā)現(xiàn)，如果考慮無效等位基因的存在，所有子代的基因型都符合孟德爾遺傳定律。

圖1 部分三角帆蚌個體三組多重PCR基因掃描圖

3 討論

微衛(wèi)星多重PCR要求在一個反應(yīng)體系中能夠穩(wěn)定、均一地擴(kuò)增出多條引物，要求所有引物的退火溫度相近、片段大小不能重疊、不能有非特異性擴(kuò)增，因而構(gòu)建穩(wěn)定多重PCR體系在技術(shù)難度較大，需要全面的分析和反復(fù)優(yōu)化［18］。微衛(wèi)星多重PCR體系的構(gòu)建能夠極大地減少基因分型成本和時間，尤其是在分析大量實(shí)驗(yàn)樣本時，多重PCR技術(shù)的優(yōu)勢更為明顯。結(jié)合熒光微衛(wèi)星的基因掃描技術(shù)能夠提高分析的效率。多重PCR掃描得到的信息并不是簡單地把幾對微衛(wèi)星信息累加，其掃描得到的信息比單純單對微衛(wèi)星要得到更多的遺傳信息［13］。同時，與傳統(tǒng)的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳相比，毛細(xì)管電泳檢測能夠得到更豐富等位基因以及更高的判讀準(zhǔn)確性。郝晨陽等［19］對SSR熒光標(biāo)記和銀染技術(shù)的比較發(fā)現(xiàn)，熒光技術(shù)較銀染方法在每個位點(diǎn)上多檢測到3個等位變異，檢測效率顯著高于銀染法7.8倍。利用相同的RSO0683位點(diǎn)，劉萍等［20］通過傳統(tǒng)的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳在20個明對蝦個體中檢測到12個等位基因，而孔杰等［14］采用毛細(xì)管電泳檢測的等位基因數(shù)是上述結(jié)果的2倍。

表 2 三角帆蚌紫殼色選育群體和3個家系的遺傳參數(shù)

微衛(wèi)星用于三角帆蚌群體的遺傳結(jié)構(gòu)的研究較多，最初主要運(yùn)用于我國五大湖區(qū)野生三角帆蚌的親緣關(guān)系分析［4］，在野生資源與諸暨和金華的養(yǎng)殖群體比較中發(fā)現(xiàn)養(yǎng)殖群體出現(xiàn)了輕微的遺傳多樣性下降［21］。同樣，在很多水產(chǎn)動物的養(yǎng)殖群體和野生群體的比較研究中都發(fā)現(xiàn)了遺傳多樣性下降的現(xiàn)象［22，23］。本研究的結(jié)果顯示，三角帆蚌群體觀察雜合度平均值和期望雜合度平均值分別是0.809和0.876，平均多態(tài)性信息含量為0.857，最小值為0.728，具有較高的遺傳多樣性（PIC＞0.5）。這主要是用于繁殖的親本來自太湖水域的野生三角帆蚌并且大規(guī)模養(yǎng)殖在外蕩中，在人工選擇時沒有經(jīng)過高強(qiáng)度淘汰，這可能是導(dǎo)致該群體遺傳多樣性較高的主要原因。利用微衛(wèi)星進(jìn)行遺傳多樣性監(jiān)測有利于在早期淘汰遺傳多樣性低的群體，減少養(yǎng)殖和管理的成本。

在水產(chǎn)動物的家系選育中通常要了解混養(yǎng)條件下子代的親子關(guān)系，才能在最大程度地避免近交，微衛(wèi)星標(biāo)記可以有效地區(qū)分混養(yǎng)群體的家系信息。在家系鑒定中所用標(biāo)記的識別能力和位點(diǎn)的穩(wěn)定性是家系鑒定成功的主要原因，理論上所選微衛(wèi)星標(biāo)記的遺傳多樣性越豐富，其非親排除率就越高，越容易通過特異性條帶確定親緣關(guān)系。本研究的親子代具有高的遺傳多樣性0.818，利用Cervus 3.0軟件分析雙親未知時的排除率為99.92%，已知一個親本時的排除率為99.99%，表明本研究建立的由12個微衛(wèi)星位點(diǎn)組成的3個多重PCR體系可以實(shí)現(xiàn)比普通PCR方法具有更高效的親子鑒定率。在長牡蠣的親子鑒定研究中利用具有較高的多態(tài)信息含量multiplex set 4 和其余任意一組就可達(dá)到100% 的實(shí)際鑒定結(jié)果［15］。傅建軍等［24］使用12個多態(tài)微衛(wèi)星位點(diǎn)對草魚進(jìn)行親權(quán)分析發(fā)現(xiàn)使用其中8個位點(diǎn)即能達(dá)到 100%的親權(quán)鑒定成功率。在3個家系統(tǒng)計(jì)分析了親本和子代的基因型分離情況，12個微衛(wèi)星標(biāo)記在考慮無效等位基因的前提下，x2檢驗(yàn)沒有發(fā)現(xiàn)偏離孟德爾遺傳比例的情況。但在雙殼貝類中也存在偏離孟德爾遺傳的現(xiàn)象［15，16］，其主要原因普遍認(rèn)為是存在大量無效等位基因，可能會對家系鑒定結(jié)果有一定影響［25，26］。但也和取樣家系的數(shù)量、DNA的突變、致死基因的存在等因素有關(guān)。本研究也檢測到兩個位點(diǎn)存在無效等位基因，并將其看做隱性基因處理則子代的分離比符合孟德爾遺傳規(guī)律。

表 3 多重 PCR 在3個三角帆蚌家系中的微衛(wèi)星基因型分離比

4 結(jié)論

本研究構(gòu)建的3組微衛(wèi)星多重PCR體系，具有相比普通PCR方法高3-4倍的分析效率；這套微衛(wèi)星多重PCR體系不僅能夠應(yīng)用于三角帆蚌群體多樣性研究和資源管理，而且在家系重建和親子鑒定上也有較高識別力。

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（責(zé)任編輯李楠）

The Development and Application of Multiplex PCR Panels of Microsatellites in Hyriopsis cumingii

YIN Hao1，2BAI Zhi-yi1，2HAN Xue-kai1，2LI Jia-le1，2
（1. Key Laboratory of Freshwater Fishery Germplasm Resources of Ministry of Agriculture Shanghai Ocean University，Shanghai 201306；2. Shanghai Engineering Research Center of Aquaculture，Shanghai 201306）

In order to increase the analysis efficiency of microsatellite in Hyriopsis cumingii， 3 groups of 4 multiplex PCRs panels were established from the developed microsatellite labels. The stable multiplex PCR panels were used to analyze the genetic diversities of 56 purple breeding lines of H. cumingii. The results showed that the average number of alleles（A）was 18.75， the effective number of alleles（An）was 9.010，the average of polymorphism information content（PIC）was 0.857， the average observed heterozygosity（Ho）and expected heterozygosity（He）were 0.809 and 0.876， respectively， and Shannon information index（I）was 2.422. The Cervus v3.0 software was used to have parentage assignment for 114 individuals in 3 full-sib families， and the results revealed that accuracy of parentage assignment by this 3 groups of multiplex PCR panels was 100%. Therefore， this multiplex panels can be applied in genetic diversity studies of H. cumingii population， parentage assignment and family management with increased detection efficiency and reduced test cost.

Hyriopsis cumingii；microsatellites；multiplex PCR；genetic diversity；parentage assignment

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.01.026

2015-05-22

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31272657），國家科技支撐計(jì)劃課題（2012BAD26B04），水產(chǎn)動物遺傳育種中心上海市協(xié)同創(chuàng)新中心（ZF1206）

殷浩，男，碩士，研究方向：種質(zhì)資源與遺傳育種；E-mail：yinhao0222@163.com

白志毅，男，博士，副教授，研究方向：種質(zhì)資源與遺傳育種；E-mail：zybai@shou.edu.cn