王赟翟素珍張春林王吉平

（1. 貴州醫(yī)科大學(xué)生物與工程學(xué)院，貴陽 550004；2.貴州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，貴陽 550004）

美洲大蠊i型溶菌酶的原核表達(dá)及多克隆抗體制備

王赟1翟素珍2張春林2王吉平2

（1. 貴州醫(yī)科大學(xué)生物與工程學(xué)院，貴陽 550004；2.貴州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，貴陽 550004）

旨在獲得美洲大蠊i型溶菌酶PaI的原核表達(dá)蛋白，并制備鼠抗PaI多克隆抗體。PCR擴(kuò)增PaI成熟肽編碼序列，構(gòu)建原核表達(dá)載體pET28a-PaI，誘導(dǎo)表達(dá)、純化PaI-His融合蛋白，免疫Balb/c小鼠，間接ELISA法檢測抗血清效價，Western blotting檢測多克隆抗體的特異性。結(jié)果顯示，PaI成熟肽部分的編碼序列長414 bp，由137個氨基酸組成。構(gòu)建的原核表達(dá)載體pET28a-PaI在大腸桿菌Rosetta（DE3）中成功表達(dá)，SDS-PAGE檢測顯示純化的PaI-His融合蛋白的大小約為18 kD，間接ELISA和Western blotting分析表明免疫小鼠產(chǎn)生的抗血清具有較高的效價和較強(qiáng)的特異性。美洲大蠊溶菌酶PaI成功實現(xiàn)原核表達(dá)，并獲得了高效價特異性多克隆抗體。

美洲大蠊；溶菌酶；原核表達(dá)；多克隆抗體

溶菌酶（Lysozyme，LYZ）是一類酶的總稱，能水解細(xì)菌細(xì)胞壁的肽聚糖，水解位點是N-乙酰葡萄糖胺和N-乙酰胞壁酸之間的β-1，4糖苷鍵，引起細(xì)菌裂解。溶菌酶是許多生物先天性免疫系統(tǒng)的重要組成成分，它不僅成為蛋白質(zhì)化學(xué)、酶學(xué)、結(jié)晶學(xué)、光譜學(xué)、免疫學(xué)和分子生物學(xué)的研究模型，還被證實具有抑菌防御功效，并被用作食品和藥品的防腐劑［1，2］。根據(jù)結(jié)構(gòu)特征、催化特征、免疫特性和來源可以將溶菌酶分成6種類型：c型溶菌酶（Chicken-type lysozyme）、g型溶菌（Goose-type lysozyme）、i型溶菌酶（Invertebrate-type lysozyme）、噬菌體溶菌酶、植物溶菌酶和細(xì)菌溶菌酶［3］。c型、g型和i型溶菌酶是動物型溶菌酶。其中，c型溶菌酶是同時存在于無脊椎動物和脊椎動物中的類型，g型溶菌酶主要存在于脊椎動物，而i型溶菌酶存在于無脊椎動物中［4］。目前，科研人員已對不同動物來源的不同溶菌酶基因和蛋白進(jìn)行了廣泛的研究，發(fā)現(xiàn)溶菌酶在動物的很多組織中廣泛存在，經(jīng)不同外源微生物刺激后其表達(dá)水平會發(fā)生改變［5-7］。同時，利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)和酵母表達(dá)系統(tǒng)等進(jìn)行體外異源表達(dá)，獲得溶菌酶進(jìn)行抑菌活性研究［8，9］。

美洲大蠊屬于昆蟲綱蜚蠊目，其生活環(huán)境骯臟，能攜帶多種病原體，是人類許多傳染性疾病的重要傳播媒介［10］。當(dāng)然，美洲大蠊能夠在惡劣的環(huán)境中頑強(qiáng)生存，也說明它能有效抵御病原菌的感染，具有獨(dú)特的免疫防御機(jī)制。在前期工作中，本課題組通過RT-PCR和RACE PCR技術(shù)，獲得了美洲大蠊i型溶菌酶基因PaI（GenBank登錄號：JQ754173），并對其功能活性位點等進(jìn)行了分析［11］。為進(jìn)一步明確該基因的功能，本研究通過擴(kuò)增PaI成熟肽的編碼序列，構(gòu)建其原核表達(dá)載體，并進(jìn)行原核表達(dá)和純化，免疫小鼠制備多克隆抗體，旨在為進(jìn)一步研究美洲大蠊i型溶菌酶的分子生物學(xué)特征及功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種與載體 表達(dá)菌株大腸桿菌Rosetta（DE3）及質(zhì)粒pET-28a（+）、pMD18-PaI均由本校生物學(xué)教研室保存。

1.1.2 主要試劑 Hind III和BamH I限制性核酸內(nèi)切酶、Taq酶、T4 DNA連接酶、DNA Marker、低分子量蛋白質(zhì)Marker為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品；DNA凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、His-鎳蛋白純化套裝為北京天恩澤基因科技有限公司產(chǎn)品；異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside，IPTG）、卡那霉素、氯霉素為北京索萊寶科技有限公司產(chǎn)品；兔抗His標(biāo)簽抗體、辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記羊抗兔二抗、HRP標(biāo)記羊抗鼠二抗、二氨基聯(lián)苯胺（DAB）/5-四甲基聯(lián)苯胺（TMB）顯色試劑、BCA蛋白定量試劑盒為博士德生物工程有限公司產(chǎn)品；引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.1.3 實驗用動物 Balb/c小鼠購自貴州醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心。

1.2 方法

1.2.1 PaI成熟肽編碼序列的擴(kuò)增 根據(jù)前期獲得的PaI基因序列，用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計擴(kuò)增成熟肽序列的上下游引物。上游引物為5'-CGGGATCCCAGCAGCAACCGAAG-3'（下劃線為BamH I酶切位點）；下游引物為5'-CCCAAGCTTTTACAGTGGAACG-3'（下劃線為Hind III酶切位點）。以實驗室構(gòu)建的重組質(zhì)粒pMD18-PaI為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，該重組質(zhì)粒含PaI全長編碼序列。PCR擴(kuò)增條件：94℃ 5 min；94℃ 1 min，56℃ 30 s，72℃1 min，30個循環(huán)；72℃ 5 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，使用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收目的片段。

1.2.2 重組表達(dá)質(zhì)粒pET28a-PaI的構(gòu)建及測序 用BamH I和Hind III雙酶切純化的PaI基因片段以及pET-28a（+）載體，回收酶切產(chǎn)物。用T4 DNA連接酶將質(zhì)粒與目的基因片段在16℃水浴連接過夜，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，挑取單菌落進(jìn)行培養(yǎng)。經(jīng)PCR初步篩選陽性克隆，再抽提重組質(zhì)粒用BamH I和Hind III雙酶切進(jìn)一步鑒定后測序。

1.2.3 重組載體的誘導(dǎo)表達(dá) 將構(gòu)建成功的重組工程菌接種于含卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃搖床培養(yǎng)至OD600≈0.6時，加入終濃度為1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)4 h，按常規(guī)進(jìn)行SDS-PAGE檢測，分析目的蛋白表達(dá)情況。以空質(zhì)粒pET-28a（+）作對照。

1.2.4 產(chǎn)物表達(dá)形式的鑒定 取5 mL誘導(dǎo)表達(dá)的菌液以8 000 r/min離心10 min收集菌體，加入細(xì)菌裂解緩沖（50 mmol/L Tris-HCl pH8.0、1 mmol/L EDTA、0.1 mol/L NaCl）懸浮菌體沉淀，反復(fù)凍融后在冰浴中超聲破碎細(xì)菌，離心后分別收集上清及沉淀樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳，分析重組蛋白的表達(dá)情況。

1.2.5 包涵體的提取和純化 重組工程菌大量誘導(dǎo)表達(dá)，離心收集菌體沉淀，用細(xì)菌裂解緩沖液重懸菌體，反復(fù)凍融3次，加入100 mmol/L PMSF，在冰浴中超聲碎菌。破碎后離心棄上清，獲得包涵體蛋白。向包涵體中加入含8 mol/L尿素的PBS緩沖液，4℃緩慢攪拌下使包涵體溶解過夜。待包涵體完全溶解后，用0.45 μm濾膜過濾，用Ni-NTA親和層析柱按操作說明純化溶解的包涵體蛋白。其中洗柱的結(jié)合液含5 mol/L尿素，洗脫液含200 mmol/L咪唑。

1.2.6 包涵體的復(fù)性 采用梯度透析法對純化的變性蛋白進(jìn)行復(fù)性［12］。調(diào)整親和層析洗脫的蛋白濃度為1 mg/mL，將稀釋后的變性蛋白裝入預(yù)先處理的透析袋中。將透析袋依次在含6、4、3、2、1和0mol/L尿素的50 mmol/L Tris-HCl溶液及ddH2O中，分別在4℃條件下攪拌透析4 h。其中在含2 mol/L和1 mol/L尿素的Tris-HCl中均加入終濃度為0.8 mol/L的精氨酸，一定程度上抑制復(fù)性過程中蛋白的聚集。復(fù)性后的蛋白用BCA蛋白定量試劑盒測定其濃度。

1.2.7 重組融合蛋白的Western blotting分析 將純化蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，然后電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉液4℃封閉過夜，經(jīng)TBS-T（pH7.4）漂洗后，PVDF膜轉(zhuǎn)入兔抗His標(biāo)簽抗體（1∶1 000），低速搖床上結(jié)合1 h，TBS-T洗膜后與HRP標(biāo)記羊抗兔二抗在低速搖床上結(jié)合1 h，最后DAB顯色至目的條帶清晰。

1.2.8 PaI多克隆抗體的制備 將純化的重組蛋白進(jìn)行動物免疫。取5-7周齡Balb/c小鼠4只，尾靜脈取血作為陰性對照。初次免疫，50 μg純化的融合蛋白與弗氏佐劑等比例混合，超聲乳化后皮下和腹腔多點注射；2周后，加強(qiáng)免疫，PaI蛋白與不完全弗氏佐劑等量混合超聲乳化后皮下和腹腔多點注射；加強(qiáng)免疫后2周，追加免疫，同等劑量PaI蛋白腹腔注射。追加免疫后3 d，眼球取血并分離多抗血清。

1.2.9 抗血清的效價檢測及特異性分析 將純化得到的重組PaI蛋白作為抗原包被ELISA板，用BSA封閉后，將倍比稀釋的抗血清加入反應(yīng)孔中，37℃孵育2 h，同時用免疫前的小鼠血清作對照。洗滌后加入HRP標(biāo)記的羊抗小鼠二抗，37℃孵育1.5 h。洗滌后，加入底物TMB顯色，反應(yīng)20 min，加入終止液，以450 nm波長測定其光密度。Western blotting檢測效價最高抗血清的特異性，方法同1.2.7。

2 結(jié)果

2.1 PaI成熟肽編碼序列的擴(kuò)增

以含有酶切位點的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測（圖1），可見約430bp的特異條帶大小，與預(yù)期相符。

圖1 美洲大蠊i型溶菌酶成熟肽基因片段PCR結(jié)果

2.2 重組表達(dá)質(zhì)粒pET28a-PaI的酶切鑒定及測序

圖2 pET28a-PaI重組質(zhì)粒的酶切鑒定

回收的PCR產(chǎn)物和表達(dá)載體pET-28a（+）經(jīng)BamH I和Hind III雙酶切后進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞Rosetta（DE3），獲得重組質(zhì)粒pET28a-PaI。重組質(zhì)粒經(jīng)雙酶切后得到一條約430 bp與PCR產(chǎn)物大小較一致的條帶，在約6 000 bp處出現(xiàn)了與線性pET-28a（+）大小較一致的條帶（圖2），初步判斷目的基因成功與表達(dá)載體相連。測序結(jié)果顯示插入序列與課題組前期提交的PaI序列（JQ754173）完全一致，且閱讀框正確，進(jìn)一步證明重組表達(dá)載體構(gòu)建成功。

2.3 重組質(zhì)粒的誘導(dǎo)表達(dá)及檢測

重組質(zhì)粒經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后，SDS-PAGE電泳檢測結(jié)果（圖3）顯示，誘導(dǎo)后的菌體總蛋白相對未誘導(dǎo)的菌體總蛋白在相對分子質(zhì)量約18 kD處可見特異性蛋白條帶，與預(yù)期大小相符。收集菌體經(jīng)超聲破碎后，取離心后的上清和沉淀分別進(jìn)行SDSPAGE電泳，結(jié)果顯示目的蛋白以包涵體形式存在。

圖3 SDS-PAGE分析重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)情況

2.4 重組融合蛋白的純化及復(fù)性

超聲破碎處理誘導(dǎo)后的重組工程菌，離心獲得包涵體，將包涵體變性后純化并用梯度尿素復(fù)性，復(fù)性蛋白進(jìn)行SDS-PAGE檢測（圖4），呈現(xiàn)一條約18 kD條帶。BCA法測定蛋白濃度為1.23 mg/mL。利用抗His標(biāo)簽抗體進(jìn)行Western blotting分析純化和復(fù)性后的重組蛋白，同樣在約18 kD處可見清晰的條帶（圖5），與SDS-PAGE檢測結(jié)果一致。

圖4 SDS-PAGE分析復(fù)性的重組蛋白

圖5 重組蛋白的免疫印跡鑒定

圖6 抗PaI多克隆抗血清的效價

2.5 抗血清效價檢測及特異性分析

將純化復(fù)性的PaI重組蛋白共免疫4只Balb/c小鼠，獲得小鼠抗PaI抗體后，用間接ELISA檢測抗體效價，結(jié)果（圖6）顯示，免疫的4只小鼠均產(chǎn)生了較強(qiáng)的免疫反應(yīng)。其中3號免疫小鼠的抗血清效價最高，超過1∶128 000，最低的2號小鼠亦達(dá)到1∶64 000以上。選擇效價最高的3號免疫小鼠的抗血清進(jìn)行Western blotting分析，結(jié)果（圖7）表明，免疫后的抗血清可見明顯的特異性免疫反應(yīng)條帶，而陰性對照血清在相應(yīng)的位置未識別出條帶。

3 討論

昆蟲具有許多免疫功能的多肽類物質(zhì)，與血細(xì)胞一起組成了昆蟲體內(nèi)免疫功能體系。受到細(xì)菌等異物刺激后，很多昆蟲均能有效誘導(dǎo)溶菌酶、抗菌肽、凝集素和血素等血淋巴抗菌蛋白的增加，以增強(qiáng)機(jī)體的免疫防衛(wèi)能力，維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定［13］。美洲大蠊是重要的衛(wèi)生昆蟲，有研究報道發(fā)現(xiàn)美洲大蠊在大腸桿菌誘導(dǎo)后，其血淋巴的抗菌活性增強(qiáng)，被認(rèn)為是誘導(dǎo)后其體內(nèi)溶菌酶、抗菌肽、凝集素、血素等抗菌蛋白增加［14］。李遠(yuǎn)輝等［15］運(yùn)用不同的方法獲得美洲大蠊提取液，證實其對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和綠膿桿菌均有抑菌活性。因此，本研究在獲得美洲大蠊i型溶菌酶PaI編碼序列的基礎(chǔ)上，通過體外表達(dá)獲得溶菌酶PaI蛋白并制備抗PaI多克隆抗體對其功能的研究具有重要的意義。

圖7 Western blotting檢測分析鼠抗PaI抗體的特異性

大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)由于其遺傳背景清楚、轉(zhuǎn)化及表達(dá)效率高、成本低廉，被廣泛地用于異源蛋白的體外表達(dá)［16，17］。但在使用大腸桿菌對高等生物功能基因進(jìn)行重組表達(dá)過程中，重組蛋白往往以無活性的包涵體形式存在，這主要是因為在重組蛋白的大量表達(dá)過程中，缺乏某些蛋白質(zhì)正確折疊所需要的酶和分子伴侶等，或因環(huán)境不適無法形成正確的次級鍵等［18］。為了獲得有活性的重組蛋白，需要將包涵體中的重組蛋白變性溶解，然后再加以復(fù)性，使重組蛋白分子重新折疊形成正確的空間結(jié)構(gòu)［19，20］。本研究構(gòu)建了重組表達(dá)載體pET28a-PaI，轉(zhuǎn)入大腸桿菌Rosetta（DE3）感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后成功表達(dá)目的蛋白，但重組蛋白以包涵體形式存在。經(jīng)高濃度尿素變性純化并通過梯度尿素復(fù)性后，獲得的目的蛋白可用于后續(xù)功能的研究。

抗PaI抗體是在翻譯水平研究i型溶菌酶表達(dá)模式的關(guān)鍵試劑，但目前國內(nèi)外尚未見該抗體的產(chǎn)品或抗體制備的研究報道。常規(guī)制備多克隆抗體可采用免疫家兔或小鼠獲得，與免疫家兔相比，免疫小鼠制備免疫血清具有蛋白用量少、周期短、免疫效價高、成本低等優(yōu)點［21］。因此，本研究利用原核表達(dá)獲得的PaI重組蛋白免疫Balb/c小鼠，獲得的抗血清能與PaI蛋白特異性結(jié)合，可用于PaI在美洲大蠊體內(nèi)表達(dá)水平的研究，為美洲大蠊i型溶菌酶基因功能的研究奠定了基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本研究獲得了美洲大蠊i型溶菌酶（PaI）成熟肽編碼序列，成功構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET28a-PaI，并在大腸桿菌中表達(dá)，親和層析純化獲得大小約18 kD的目的蛋白，并成功制備了鼠抗PaI多克隆抗體，ELISA檢測顯示抗血清效價較高，Western blotting驗證其具有較好的特異性。

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（責(zé)任編輯馬鑫）

Prokaryotic Expression of i-type Lysozyme from Periplaneta americana and Preparation of Its Polyclonal Antibodies

WANG Yun1ZHAI Su-zhen2ZHANG Chun-lin2WANG Ji-ping2
（1. School of Biology and Engineering，Guizhou Medical University，Guiyang 550004；2. School of Basic Medical Sciences，Guizhou Medical University，Guiyang 550004）

The objective of this work is to express i-type lysozyme（PaI）from Periplaneta americana in Escherichia coli and prepare its polyclonal antibodies of anti-PaI in mice. The coding gene of mature peptide region was amplified by PCR and prokaryotic expression vector pET28a-PaI was constructed. PaI-His fusion protein was expressed with IPTG induction and purified by Ni-NTA affinity chromatography. Then，Balb/c mice were immunized with the purified recombinant protein， and the titers of antiserum and the specificity of polyclonal antibodies were detected by indirect ELISA and Western blotting respectively. Results were as below. The length of nucleotide sequence encoding the mature peptide was 414 bp that encoded a putative protein with 137 amino acids. The constructed prokaryotic expression vector pET28a-PaI was successfully expressed in Escherichia coli. SDS-PAGE detection indicated that the PaI-His fusion protein was about 18 kD. Indirect ELISA and Western blotting analysis showed that the antiserum from immunized mice had high titer and specificity. In conclusion， the prokaryotic expression of PaI protein was successfully realized， and the anti-PaI polyclonal antibody with high efficiency and specificity were prepared， which laid the foundation for the further researches on the biological function of PaI protein.

Periplaneta americana；lysozyme；prokaryotic expression；polyclonal antibody

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.01.023

2015-05-19

貴州省科技合作計劃項目（黔科合LH字［2015］7336號），貴陽市科技計劃項目（筑科合同［20151001］社19號），貴州省科技基金項目（黔科合LH字［2014］7085號），貴州省教育廳自然科學(xué)研究項目（黔教合KY字［2012］039號）

王赟，女，碩士，研究方向：醫(yī)學(xué)昆蟲分子生物學(xué)；E-mail：forever_wangyun@sina.cn

張春林，男，碩士，研究方向：醫(yī)學(xué)昆蟲分子生物學(xué)；E-mail：zcl@gmc.edu.cn