王　鑫，趙艷霞，李海霞，李愛(ài)軍，劉　爽，陳惠敏，崔衛(wèi)正

(河北省邯鄲市中心醫(yī)院，河北 邯鄲 056001)

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誘導(dǎo)型一氧化氮合酶和細(xì)胞凋亡在急性百草枯中毒大鼠腎損傷中的作用

王鑫，趙艷霞，李海霞，李愛(ài)軍，劉爽，陳惠敏，崔衛(wèi)正

(河北省邯鄲市中心醫(yī)院，河北 邯鄲 056001)

目的觀察急性百草枯中毒大鼠腎組織中誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)的表達(dá)和細(xì)胞凋亡情況，探討百草枯導(dǎo)致腎損傷發(fā)生的病理生理機(jī)制。方法將84只成年健康SD大鼠(雌雄各半)隨機(jī)分為對(duì)照組、染毒組各42只，染毒組給予20%百草枯溶液25 mg/kg腹腔內(nèi)一次性注射，對(duì)照組大鼠給予等量0.9%氯化鈉溶液腹腔內(nèi)注射。分別于注射1 d、3 d、7 d、14 d、21 d、28 d、35 d，每組各取6只，在乙醚麻醉下，留取腎組織標(biāo)本，免疫組織化學(xué)法檢測(cè)iNOS蛋白表達(dá)水平，原位末端標(biāo)記法(TUNEL法)標(biāo)記凋亡細(xì)胞，RT-PCR檢測(cè)腎組織中iNOS mRNA表達(dá)情況。結(jié)果染毒組不同時(shí)點(diǎn)大鼠腎組織中iNOS 蛋白和iNOS mRNA表達(dá)量均明顯高于對(duì)照組(P均<0.05)，細(xì)胞凋亡率均明顯高于對(duì)照組(P均<0.05)。結(jié)論急性百草枯中毒大鼠腎組織中iNOS含量和細(xì)胞凋亡率明顯升高，它們可能參與了百草枯導(dǎo)致腎損傷的過(guò)程。

百草枯；iNOS；細(xì)胞凋亡；腎損傷

百草枯是一種高效、非選擇性、接觸性除草劑，目前在世界范圍內(nèi)廣泛使用。百草枯除草效果好，但它對(duì)人畜具有很強(qiáng)毒性，每年因自服或誤服引起的急性中毒時(shí)有發(fā)生。我國(guó)雖無(wú)百草枯中毒的正式統(tǒng)計(jì)資料，但根據(jù)諸多文獻(xiàn)報(bào)道，百草枯中毒已成為最常見(jiàn)的農(nóng)藥中毒之一，在有些地區(qū)已成為繼有機(jī)磷農(nóng)藥中毒之后排第二位、死亡絕對(duì)數(shù)占第一位的農(nóng)藥中毒類型[1]。由于百草枯中毒病死率高，也無(wú)特效解毒藥物，因此已成為當(dāng)前中毒治療學(xué)研究的熱點(diǎn)。腎臟是百草枯損傷的主要臟器，也是百草枯排泄的主要器官，所以腎功能的損傷程度與百草枯患者的預(yù)后密切相關(guān)[2]。然而，在急性百草枯中毒中，腎損傷的病理生理機(jī)制目前尚未完全闡明。本研究通過(guò)觀察急性百草枯中毒大鼠模型的腎組織病理學(xué)改變及腎組織中誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)的表達(dá)和細(xì)胞凋亡情況，探討了急性百草枯中毒導(dǎo)致腎損傷的病理生理機(jī)制，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1　實(shí)驗(yàn)資料

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物清潔級(jí)成年健康SD大鼠84只(雌雄不拘)，體質(zhì)量250～300 g,由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(冀)2011-0004。

1.2實(shí)驗(yàn)試劑與儀器20%百草枯溶液(英國(guó)捷利康股份有限公司生產(chǎn))，SABC免疫組化染色試劑盒、兔抗鼠iNOS多克隆抗體、iNOS試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所，RNA提取試劑Trizol Reagent購(gòu)自Invitrogen公司。核糖核酸酶抑制劑、逆轉(zhuǎn)錄酶、Taq DNA聚合酶、dNTP、瓊脂糖(agarose)和隨機(jī)引物(Random primers)均購(gòu)自美國(guó)Promega公司。原位末端標(biāo)記(TUNEL)試劑盒由武漢博士德生物工程有限公司生產(chǎn)提供。離心機(jī)、-85 ℃超低溫冰箱、電熱恒溫水箱等均由河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院提供。

1.3動(dòng)物分組及模型制備將84只SD大鼠隨機(jī)分成對(duì)照組和染毒組各42只，染毒組一次性腹腔內(nèi)注射百草枯25 mg/kg建立中毒模型，對(duì)照組腹腔內(nèi)注射等量0.9%氯化鈉溶液。

1.4取材及樣品制備在第1，3，7，14，21，28，35天清晨，空腹?fàn)顟B(tài)下每組中各取出6只大鼠，行乙醚麻醉后開(kāi)腹，使用預(yù)先滅酶的器械剪取腎組織，用4 ℃、0.1%DEPC水迅速洗去血液，液氮罐速凍，儲(chǔ)存于-85 ℃超低溫冰箱，行iNOS mRNA的檢測(cè)。PBS緩沖液沖冼，10%甲醛固定，保存于4 ℃冰箱，常規(guī)石蠟包埋連續(xù)切片以備HE染色、免疫組化染色及TUNEL染色。

1.5免疫組化染色及TUNEL染色①按照SABC試劑盒說(shuō)明進(jìn)行免疫組化染色操作：取出大鼠腎組織，常規(guī)中性甲醛液固定、脫水，制成3 μm石蠟切片，高壓修復(fù)抗原，3%H2O2室溫孵育10 min，以消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性，滴加兔抗鼠iNOS一抗工作液，4 ℃ 孵育過(guò)夜，滴加適量生物素標(biāo)記二抗工作液，37 ℃孵育30 min，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色劑顯色10 min。從每組選取切片5張，每張切片隨機(jī)選取10個(gè)完整并且不重疊的高倍視野，結(jié)果判定：以細(xì)胞核和/或細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性細(xì)胞，光學(xué)顯微鏡觀察每張切片的陽(yáng)性細(xì)胞并拍照，應(yīng)用圖像分析軟件Image- Pro Plus(IPP)6.0處理，測(cè)定各個(gè)視野下的平均吸光度值，同時(shí)測(cè)定同一切片的平均吸光度值作為背景值，最后，前者減去后者，算出矯正后的平均吸光度值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。②TUNEL法標(biāo)記：嚴(yán)格參照檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，在脫氧核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶的作用下，用生物素化的dUTP標(biāo)記到DNA斷裂后形成3'-OH末端，并將過(guò)氧化物酶連接至DNA斷點(diǎn)，加入底物，通過(guò)3，3-DAB顯色劑顯色。結(jié)果判定：細(xì)胞質(zhì)和/或細(xì)胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性細(xì)胞，每張切片隨機(jī)選取10個(gè)完整且不重疊的10×40倍顯微鏡視野，用MoticMed6.0圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行處理，計(jì)算出平均陽(yáng)性細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)。

1.6RT-PCR檢測(cè)iNOS mRNA表達(dá)按照Invitrogen公司生產(chǎn)的RNA試劑盒說(shuō)明書(shū)提取大鼠腎組織總RNA。RT-PCR試劑盒檢測(cè)iNOS mRNA表達(dá)，磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)作為內(nèi)參。iNOS及內(nèi)參GAPDH引物由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司按照基因庫(kù)基因序列設(shè)計(jì)、合成。引物序列：iNOS上游鏈5’-CCT CAA GTC TTA TTT CCT CAA-3’，下游鏈5’-TCA GCA GCA AGT TCC ATC GTT-3’，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為185 bp；GAPDH上游鏈5’-TTC AAC GGC ACA GTC AAG-3’，下游鏈5’- CGA CAT ACT CAG CAC CAG-3’，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為125 bp。PCR循環(huán)過(guò)程：45 ℃ 15 min，94 ℃ 5 min，94 ℃變性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，重復(fù)進(jìn)行第3步至第5步，共計(jì)35個(gè)循環(huán)，然后72 ℃延伸5 min。取RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物10 μL，滴入緩沖液1 μL，在2%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳45 min，兩端電壓80 V，溴化乙啶染色。擴(kuò)增產(chǎn)物電泳條帶用UVP凝膠圖像掃描系統(tǒng)進(jìn)行密度掃描，記錄并分析光密度值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2　結(jié)　　果

2.12組大鼠腎組織病理學(xué)表現(xiàn)對(duì)照組：光鏡下觀察可見(jiàn)腎小球、腎小管、腎間質(zhì)及血管周?chē)鸁o(wú)充血及增寬，無(wú)炎細(xì)胞浸潤(rùn)。染毒組：大體標(biāo)本觀察可見(jiàn)腎體積增大，色呈暗紅，表面有點(diǎn)片狀出血點(diǎn)和/或淤斑，切面皮髓質(zhì)有明顯的分界；光鏡下見(jiàn)腎小球內(nèi)紅細(xì)胞增多，腎間質(zhì)有不同程度的充血、水腫、空泡變性，伴有小灶狀和/或大片狀炎細(xì)胞浸潤(rùn)。染毒1 d，腎小管近曲上皮細(xì)胞呈現(xiàn)充血水腫、空泡變性、管腔變窄，部分上皮細(xì)胞壞死、脫落，隨著時(shí)間延長(zhǎng)上述現(xiàn)象逐漸加重；染毒7 d，上皮細(xì)胞重度水腫、空泡變性，胞漿脫失，核溶解、破裂，大量上皮細(xì)胞可見(jiàn)壞死、脫落堵塞管腔，見(jiàn)圖1；染毒28 d以后腎小管上皮細(xì)胞可見(jiàn)水腫明顯好轉(zhuǎn)，管腔壞死物逐漸減少、消失，堵塞減輕，見(jiàn)圖2。

圖1　染毒組7 d腎組織病理表現(xiàn)(HE，×400)

圖2　染毒組28 d腎組織病理表現(xiàn)(HE，×400)

2.22組大鼠腎組織中iNOS蛋白表達(dá)情況對(duì)照組大鼠腎組織中iNOS多不表達(dá)，有少數(shù)在近曲腎小管上皮細(xì)胞、皮質(zhì)部腎小球內(nèi)皮細(xì)胞呈弱表達(dá)。染毒組染毒1 d在近曲腎小管上皮細(xì)胞、皮質(zhì)部腎小球內(nèi)皮細(xì)胞呈陽(yáng)性表達(dá)，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，表達(dá)顯著增強(qiáng)，染毒3 d iNOS蛋白表達(dá)量顯著升高，7 d達(dá)高峰，此后逐漸下降，但仍維持在較高水平。染毒組不同時(shí)點(diǎn)腎組織中iNOS 蛋白表達(dá)量均明顯高于對(duì)照組(P均<0.05)。見(jiàn)表1。

表1　2組不同時(shí)點(diǎn)大鼠腎組織中iNOS蛋白表達(dá)情況±s)

注：①與對(duì)照組比較，P<0.05。

2.32組大鼠腎組織中細(xì)胞凋亡情況染毒組染毒1 d在腎小管可觀察到標(biāo)記陽(yáng)性的凋亡細(xì)胞，染毒7 d顯著增加(見(jiàn)圖3)，染毒21 d達(dá)到高峰(見(jiàn)圖4)，染毒28 d明顯下降，但各時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞凋亡率均明顯高于對(duì)照組(P均<0.05)，見(jiàn)表2。

圖3　染毒組7 d腎組織細(xì)胞凋亡情況(TUNEL，×400)

圖4　染毒組21 d腎組織細(xì)胞凋亡情況(TUNEL，×400)

2.42組大鼠腎組織中iNOS mRNA表達(dá)情況對(duì)照組大鼠腎組織中iNOS mRNA多不表達(dá)，少數(shù)在皮質(zhì)部腎小球內(nèi)皮細(xì)胞呈弱表達(dá)。染毒組染毒1 d在近曲腎小管上皮細(xì)胞、皮質(zhì)部腎小球內(nèi)皮細(xì)胞呈陽(yáng)性表達(dá)，伴隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，表達(dá)逐漸增強(qiáng)，染毒3 d iNOS mRNA就達(dá)高峰，以后逐漸下降，但仍然維持較高水平。染毒組不同時(shí)點(diǎn)腎組織中iNOS mRNA表達(dá)量均明顯高于對(duì)照組(P均<0.05)。見(jiàn)表3。

表2　2組不同時(shí)點(diǎn)大鼠腎組織中細(xì)胞凋亡情況±s，%)

注：①與對(duì)照組比較，P<0.05。

3　討　　論

表3　2組不同時(shí)點(diǎn)大鼠腎組織中iNOS mRNA表達(dá)情況

注：①與對(duì)照組比較,P<0.05。

百草枯又名對(duì)草快、克蕪蹤，綠色無(wú)味、易溶于水，在酸性環(huán)境下較穩(wěn)定，遇堿易分解。百草枯中毒可以導(dǎo)致多臟器功能損傷，其中腎功能受損程度是決定患者預(yù)后的關(guān)鍵因素[3]。近年的文獻(xiàn)報(bào)道，百草枯中毒腎損傷主要表現(xiàn)為近曲小管上皮細(xì)胞水腫、變性、壞死、脫落，管腔變窄，甚至堵塞，腎小球內(nèi)紅細(xì)胞增多，腎間質(zhì)伴有小灶狀和/或大片狀炎細(xì)胞浸潤(rùn)[4]，與本實(shí)驗(yàn)觀察到的病理變化一致。目前研究認(rèn)為，百草枯引起的腎損傷與其吡啶陽(yáng)離子還原和再氧化過(guò)程中生成的大量氧自由基有關(guān)。大量氧自由基的形成可以使細(xì)胞遭受氧化損傷，組織內(nèi)炎癥因子、黏附分子和生長(zhǎng)因子聚集，從而出現(xiàn)應(yīng)激、炎癥和免疫反應(yīng)及細(xì)胞凋亡。

Christmann等[5]采用TUNEL法檢測(cè)急性百草枯中毒大鼠腎組織細(xì)胞凋亡情況，結(jié)果顯示，中毒組腎組織細(xì)胞凋亡顯著多于對(duì)照組，在中毒20 d后，細(xì)胞凋亡更為顯著。本實(shí)驗(yàn)也采用TUNEL法檢測(cè)大鼠腎組織細(xì)胞凋亡率，結(jié)果顯示，染毒組各時(shí)間段腎組織細(xì)胞凋亡數(shù)明顯多于對(duì)照組?？梢?jiàn)，急性百草枯中毒導(dǎo)致腎損傷的機(jī)制之一即細(xì)胞凋亡。然而，百草枯導(dǎo)致腎組織細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制目前仍不清楚。

NO是一種氣體自由基, 由一氧化氮合酶 (NOS)催化氧分子與L- 精氨酸經(jīng)多步氧化還原反應(yīng)生成，主要發(fā)揮第二信使作用，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)、免疫反應(yīng)、抑制血小板凝聚和血壓生理調(diào)控等功能。大量的NO(納摩爾級(jí))可以調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)的細(xì)胞生長(zhǎng)和細(xì)胞毒作用，大量NO也可直接引起細(xì)胞毒性作用, 與過(guò)氧化物一起導(dǎo)致過(guò)氧化,從而引起細(xì)胞損傷[6]。由于 NO半衰期短，性質(zhì)活潑，因此眾多關(guān)于 NO的研究都集中在 NOS的研究上。現(xiàn)已知NOS有3種亞型，即內(nèi)皮型、神經(jīng)元型和誘導(dǎo)型，前兩種主要分布在內(nèi)皮組織和神經(jīng)系統(tǒng)，負(fù)責(zé)基礎(chǔ)的一氧化氮合成，以調(diào)節(jié)機(jī)體各種生理功能。當(dāng)機(jī)體受到過(guò)氧化、炎癥等刺激時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的iNOS大量合成，呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)，大量的iNOS可催化NO的大量合成，非生理濃度的NO可以通過(guò)其細(xì)胞毒作用，使細(xì)胞產(chǎn)生一系列病理生理改變，如細(xì)胞能量代謝障礙、氧化損傷及DNA斷裂等，最終引起細(xì)胞不同程度的損傷，發(fā)生炎癥反應(yīng)及細(xì)胞凋亡[7]。有研究證實(shí)，在百草枯中毒所致大鼠肺細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化及炎癥反應(yīng)的過(guò)程中，iNOS可能是主要的啟動(dòng)因子，并參與中毒肺組織的損傷過(guò)程[8]。Chen等[9]通過(guò)建立百草枯中毒大鼠模型，應(yīng)用免疫組化法檢測(cè)大鼠肺細(xì)胞iNOS蛋白表達(dá)情況，結(jié)果顯示，中毒組iNOS蛋白表達(dá)顯著增高。Liu等[10]應(yīng)用RT-PCR方法檢測(cè)到百草枯染毒后大鼠腎組織中iNOS mRNA高表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)采用免疫組化和RT-PCR法檢測(cè)大鼠腎組織中iNOS蛋白和mRNA的表達(dá)，結(jié)果顯示，各時(shí)間段染毒組iNOS蛋白表達(dá)和iNOS mRNA表達(dá)均顯著高于對(duì)照組?？梢?jiàn)，腎組織中iNOS高表達(dá)可能是急性百草枯中毒導(dǎo)致腎損傷的分子機(jī)制之一。此外，可能還存在其他機(jī)制參與百草枯中毒所致腎損傷，如c-fos、c-jun蛋白的過(guò)度表達(dá)以及氧化應(yīng)激中JNK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活等。然而，目前的研究仍不十分明確。

綜上所述，百草枯可能通過(guò)誘導(dǎo)iNOS mRNA及其蛋白的高表達(dá)，從而導(dǎo)致腎組織細(xì)胞的凋亡，iNOS的參與可能是百草枯致腎組織損傷的重要機(jī)制之一。然而，百草枯中毒致腎組織中iNOS的高表達(dá)與其他分子機(jī)制之間的關(guān)系還有待進(jìn)一步研究探討。

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Effect of iNOS and cell apoptosis on renal injury in rats with acute paraquat poisoning

WANG Xin, ZHAO Yanxia, LI Haixia, LI Aijun, LIU Shuang, CHEN Huimin, CUI Weizheng

(Handan Central Hospital, Handan 056001, Hebei, China)

Objective It is to observe the expression of inducible nitric oxide synthase (iNOS) and cell apoptosis in renal tissue in acute paraquat-intoxication rats, thus to explore the pathological and physiological mechanism of renal injury induced by paraquat. Methods Eighty-four healthy adult Sprague-Dawley rats (42 male, 42 female) were randomly divided into two groups：control group and poisoned group, each group had 42 rats. The poisoned group was given 20% paraquat liquid 25 mg/kg once by intraperitoneal injection, while the control group was given the same dosage of normal saline by intraperitoneal injection. On 1st、3rd、7th、14th、21st、28th、and 35th day，six rats in each group were used to get their renal tissue to detect the levels of iNOS by immunohistochemistry, mark the apoptosis cells by TUNEL method, detect the expression of iNOS mRNA in renal tissue by RT-PCR method. Results Compared with control group, the levels of iNOS mRNA and protein in poisoned group were significantly higher while the apoptosis rate was significantly lower than that at every time point (P<0.05). Conclusion The levels of inducible nitric oxide synthase (iNOS) and cell apoptosis in kidney of acute paraquat-induced rats were significantly increased. They could participate in the mechanism leading to renal damage.

paraquat; iNOS; cell apoptosis; renal injury

王鑫，男，碩士，副主任醫(yī)師，研究方向?yàn)榧痹\醫(yī)學(xué)。

10.3969/j.issn.1008-8849.2016.25.004

R-332

A

1008-8849(2016)25-2747-04

2016-03-20