張坤木, 李長(zhǎng)輝,宋紅梅,陳　彥，陳倩婧,鐘灼琴

(1. 福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二人民醫(yī)院，福建 福州 350003；2. 福建省立醫(yī)院，福建 福州 350003)

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論著

分子生物學(xué)技術(shù)研究桂枝加葛根湯和獨(dú)活寄生湯防治頸/腰椎病的機(jī)制

張坤木1, 李長(zhǎng)輝1,宋紅梅1,陳彥1，陳倩婧1,鐘灼琴2

(1. 福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二人民醫(yī)院，福建 福州 350003；2. 福建省立醫(yī)院，福建 福州 350003)

目的運(yùn)用分子生物學(xué)技術(shù)研究桂枝加葛根湯和獨(dú)活寄生湯防治頸/腰椎病的起效機(jī)制。方法用低、中、高劑量桂枝加葛根湯血清和獨(dú)活寄生湯血清及空白血清分別干預(yù)大鼠頸/腰椎間盤細(xì)胞，再采用MTT比色法和Western blotting技術(shù)分別檢測(cè)各組大鼠頸/腰椎間盤細(xì)胞生長(zhǎng)情況和CaM、CaMK、CREB相關(guān)蛋白表達(dá)水平。結(jié)果干預(yù)后第1天，5組間頸/腰椎間盤細(xì)胞生長(zhǎng)情況比色值比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)；干預(yù)后的第2—7天，各中藥血清組和胎牛血清組頸/腰椎間盤細(xì)胞生長(zhǎng)情況比色值均明顯高于空白血清組(P均<0.05)，且隨作用時(shí)間呈遞增趨勢(shì)。各中藥血清組和胎牛血清組頸/腰椎間盤細(xì)胞CaM、CaMK和CREB蛋白表達(dá)量均明顯高于空白血清組(P均<0.05)；中、高劑量中藥血清組和胎牛血清組各蛋白表達(dá)量比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)，但此3組各蛋白表達(dá)量均高于低劑量中藥血清組(P均<0.05)，且高劑量中藥血清組各蛋白表達(dá)量均明顯高于中劑量中藥血清組(P均<0.05)。結(jié)論分子生物學(xué)技術(shù)研究提示桂枝加葛根湯和獨(dú)活寄生湯可能通過(guò)促進(jìn)頸/腰椎椎間盤細(xì)胞的生長(zhǎng)及相關(guān)蛋白的表達(dá)水平達(dá)到防治頸/腰椎病的目的，而且其效應(yīng)過(guò)程可能存在一條重要的信號(hào)通路即CaM-CaMK-CREB通路。

桂枝加葛根湯；獨(dú)活寄生湯；頸椎??；腰椎病；信號(hào)通路

近年來(lái)，隨著城市生活節(jié)奏的加快、電子產(chǎn)品的普及，辦公人員幾乎都需要在電腦前長(zhǎng)時(shí)間伏案、久坐工作，即便是工作之余，大部分人仍然離不開(kāi)手機(jī)，使得頸腰椎病成為目前臨床常見(jiàn)病、多發(fā)病[1-2]。研究發(fā)現(xiàn)，我國(guó)目前頸椎病的發(fā)病率為17.3%，人一生中患頸椎病的概率為60%～90%，是導(dǎo)致45歲以下成人喪失勞動(dòng)能力的最常見(jiàn)原因之一[3]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，60%～80%的美國(guó)成年人在生活中有過(guò)腰痛的病因，由此也造成了巨大的醫(yī)療負(fù)擔(dān)，每年用于腰痛的花費(fèi)是各類腫瘤總花費(fèi)的3倍以上[4]。因此，尋求“簡(jiǎn)便驗(yàn)廉”的方法更好地防治頸腰椎疾病具有重要的社會(huì)經(jīng)濟(jì)效益，成為目前國(guó)內(nèi)外重點(diǎn)研究的課題。臨床治療方面中藥方劑具有“簡(jiǎn)便驗(yàn)廉”的優(yōu)點(diǎn)，諸多臨床研究表明桂枝加葛根湯對(duì)頸椎病、獨(dú)活寄生湯對(duì)腰椎病具有明顯的治療效果[5-10], 但以上研究大都局限于臨床病例觀察，其具體的起效機(jī)制尚未見(jiàn)深入報(bào)道研究。故筆者進(jìn)行了相關(guān)的機(jī)制研究，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1　實(shí)驗(yàn)資料

1.1藥物、試劑與儀器

1.1.1中藥藥物桂枝加葛根湯由葛根、芍藥、生姜、甘草、大棗、桂枝組成；獨(dú)活寄生湯由獨(dú)活、桑寄生、杜仲、牛膝、細(xì)辛、秦艽、茯苓、肉桂心、防風(fēng)、川芎、人參、甘草、當(dāng)歸、芍藥、干地黃組成。

1.1.2主要試劑胎牛血清(杭州四季青生物公司)；DMEM培養(yǎng)基、Ⅱ型膠原酶(美國(guó)Gibco公司)；胰蛋白酶、EDTA(美國(guó)Amresco公司)；RIPA裂解液(強(qiáng))(北京碧云天公司)；甲苯胺藍(lán)染料(上海江萊生物科技有限公司，CAS:6586-4-5)；BCA蛋白定量試劑盒(北京碧云天公司)；DMSO(美國(guó)Sigma公司)；PMSF(北京碧云天公司)；Tris、甘氨酸(美國(guó)NOVON公司)；丙烯酰胺(上海博亞公司)；預(yù)染蛋白Marker(美國(guó)Invitrogen公司,SeeBlue Jia2)；Tween20(美國(guó)Amresco公司)；兔抗CaMⅠ、CaMKⅡ、CaMKⅣ及CREB單克隆抗體(美國(guó)Cell Signaling公司)；辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)(北京中杉金橋公司ZB-2301)；辣根酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(H+L)(北京中杉金橋公司ZB-2305)；Mouse Anti-beta Actin Monoclonal antibody(北京中杉金橋公司TA-09)；ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(美國(guó)Cell Signaling公司)；顯影定影液(美國(guó)Kodak公司)；NC膜(美國(guó)Biosciense公司)；細(xì)胞核蛋白與細(xì)胞質(zhì)蛋白抽提試劑盒(北京碧云天公司)；其余試劑購(gòu)買已經(jīng)配好的成品。

1.1.3主要儀器設(shè)備生物凈化工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備有限公司SW-CJ-IF)，倒置顯微鏡(德國(guó)Leica公司)，CO2培養(yǎng)箱(日本SANYO公司)，電熱式壓力消毒器(上海PHS-25)，離心沉淀器(上海手術(shù)器械廠80-2 CENTRIFUGE) ，恒溫水浴鍋(深圳HH-4)，550型酶標(biāo)儀(美國(guó)BIO-RAD公司)，穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀(北京六一儀器廠DYY-6B)，電泳系統(tǒng)(美國(guó)BIO-RAD 公司)，凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)BIO-RAD公司Gel Doc XR)。

1.2動(dòng)物①健康清潔級(jí)SD大鼠160只，雌雄各半，體質(zhì)量(200±10)g，用于制備中藥血清及空白血清；②健康1個(gè)月齡清潔級(jí)SD大鼠2只，雌雄不拘，體質(zhì)量100 g左右，用于提取頸/腰椎間盤細(xì)胞。以上動(dòng)物均來(lái)源于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司[許可證號(hào)SCXX(滬)]，飼養(yǎng)于福建中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(醫(yī)動(dòng)字23-016號(hào))。

1.3方法實(shí)驗(yàn)分為頸椎和腰椎2部分，頸椎實(shí)驗(yàn)所用中藥為桂枝加葛根湯，腰椎實(shí)驗(yàn)所用中藥為獨(dú)活寄生湯，2部分實(shí)驗(yàn)方法相同。

1.3.1中藥藥物制備由福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二人民醫(yī)院藥物制劑中心嚴(yán)格按《傷寒論》《備急千金要方》原方劑量比例制備。

1.3.2中藥血清及空白血清的制備[11-13]將制備好的中藥藥物按體表面積折算成動(dòng)物的等效劑量，大鼠生藥量為11.6 g/kg。每項(xiàng)實(shí)驗(yàn)各取SD大鼠80只以計(jì)算機(jī)隨機(jī)分組法分為低劑量組、中劑量組、高劑量組和空白組各20只。低劑量組以等效劑量的0.5倍(每只1 mL)、中劑量組以等效劑量(每只2 mL)、高劑量組以2倍劑量(每只4 mL)灌胃,空白組以2 mL生理鹽水代之。均連續(xù)灌胃4 d，每天2次，于末次灌胃2 h后乙醚吸入麻醉，于腹主動(dòng)脈及心臟采血，分離血清,-20 ℃保存，備用。

1.3.3大鼠頸/腰椎間盤細(xì)胞原代培養(yǎng)、傳代培養(yǎng)及鑒定參考文獻(xiàn)[14-18]，反復(fù)實(shí)驗(yàn)研究出簡(jiǎn)單易行、重復(fù)性強(qiáng)的方法，具體方法見(jiàn)文獻(xiàn)[19-20]。

1.3.3.1大鼠頸/腰椎間盤纖維環(huán)細(xì)胞原代培養(yǎng)大鼠麻醉后脫頸處死， 75%乙醇浸泡5 min，置于第一超凈臺(tái)內(nèi)，于托盤內(nèi)沿后正中線剪開(kāi)皮膚，用75%的乙醇擦拭；更換手套和手術(shù)器械后沿棘突用剪刀剪開(kāi)兩旁肌肉，沿椎弓根剪斷肋骨，將整條脊柱取出，盡量剝離椎間盤前緣所附著的肌肉，用磷酸鹽緩沖液PBS(含青鏈霉素)沖洗3遍以上至無(wú)明顯血跡。用眼科剪分離出椎間盤，放入盛有PBS無(wú)菌培養(yǎng)皿中漂洗3遍，用尖刀將髓核去除干凈，再用眼科剪將纖維環(huán)剪成1 mm3的小塊，再用磷酸鹽緩沖液PBS漂洗2遍，800 r/min×2 min離心，收集沉淀，用2.5 g/L胰蛋白酶37 ℃消化15 min，DMEM終止消化。1 000 r/min×5 min離心，去上清，沉淀用無(wú)血清培養(yǎng)液清洗2次后加入1 g/L Ⅱ型膠原酶，37 ℃消化。待組織大部分消化(約需4 h)，用DMEM培養(yǎng)液終止消化，200目不銹鋼網(wǎng)過(guò)濾，收集懸液，1 000 r/min×5 min離心得細(xì)胞團(tuán)，棄上清液，加入DMEM(內(nèi)含15%的胎牛血清)液稀釋，以細(xì)胞2×104/cm2接種到100 mL塑料培養(yǎng)瓶中，置于37 ℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；如果有剩余組織，可以往組織塊中加入1 g/L Ⅱ型膠原酶過(guò)夜消化，步驟同上。逐日倒置顯微鏡觀察，每隔3 d換液1次。

1.3.3.2大鼠頸/腰椎間盤纖維環(huán)細(xì)胞傳代培養(yǎng)當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至近培養(yǎng)瓶底面積的90%時(shí)(原代細(xì)胞培養(yǎng)12～16 d)進(jìn)行傳代，棄培養(yǎng)液，用0.01 mol/L PBS洗滌細(xì)胞2次，棄掉液體，沿瓶壁均勻滴入0.25%的胰蛋白酶(含0.01%的EDTA)，輕晃動(dòng)培養(yǎng)瓶，鏡下觀察消化情況，見(jiàn)細(xì)胞皺縮、間隙加大、個(gè)別細(xì)胞變圓漂浮時(shí)立即用含血清的培養(yǎng)液3 mL終止消化，再用滴管輕輕吹打細(xì)胞數(shù)次制成細(xì)胞懸液，1 000 r/min×5 min離心棄上清液，加入DMEM培養(yǎng)液(內(nèi)含15%的胎牛血清)混懸細(xì)胞后按1∶2接種。細(xì)胞傳代培養(yǎng)1代后可換成10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3.3.3纖維環(huán)細(xì)胞甲苯胺藍(lán)染色將第3代傳代纖維環(huán)細(xì)胞接種在放有預(yù)處理蓋玻片的6孔培養(yǎng)板中進(jìn)行細(xì)胞爬片，待細(xì)胞長(zhǎng)成單層時(shí)進(jìn)行甲苯胺藍(lán)染色。中性樹(shù)膠封固，顯微鏡下觀察，拍照記錄。

1.3.3.4纖維環(huán)細(xì)胞Ⅰ，Ⅱ型膠原的免疫細(xì)胞化學(xué)染色將第3代傳代纖維環(huán)細(xì)胞，以2×104/cm2接種在放有預(yù)處理蓋玻片的6孔培養(yǎng)板中進(jìn)行細(xì)胞爬片，待細(xì)胞長(zhǎng)成單層時(shí)，進(jìn)行Ⅰ，Ⅱ型膠原免疫細(xì)胞化學(xué)染色，中性樹(shù)膠封固，顯微鏡下觀察，拍照記錄。

1.3.4MTT比色法測(cè)定大鼠頸/腰椎間盤細(xì)胞生長(zhǎng)曲線參考張慧鋒等[21]關(guān)于細(xì)胞活性檢測(cè)方法優(yōu)化研究中的方法，結(jié)合本實(shí)驗(yàn)實(shí)際情況主要分為4個(gè)步驟：①計(jì)算細(xì)胞量，調(diào)整濃度。預(yù)設(shè)5組，5個(gè)復(fù)孔，每孔4 000個(gè)細(xì)胞，每孔加入100 μL。將二代培養(yǎng)細(xì)胞消化下來(lái)后計(jì)算培養(yǎng)基中的細(xì)胞總數(shù)，根據(jù)已知每孔濃度400個(gè)/100 μL =4×104個(gè)/mL,計(jì)算出所需往培養(yǎng)瓶中加入的DMEM培養(yǎng)液，使得最終濃度為4×104個(gè)/mL，再取出其中5×5×100 μL×7=17.5 mL，分別加入96孔板中。②培養(yǎng)細(xì)胞。先用上述含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液孵育24 h，使細(xì)胞貼壁再棄除培養(yǎng)液，5孔分別加入空白血清、低劑量中藥血清、中劑量中藥血清、高劑量中藥血清和胎牛血清各10 μL，每2 d換液1次。③呈色。之后的每天取出其中一板，先直接往每孔加入MTT 20 μL，37 ℃孵育4 h，棄所有液體，加入150 μL DMSO，振蕩10 min。④比色。置于492 nm波長(zhǎng)的酶標(biāo)儀上檢測(cè)吸光度值(即比色值)。

1.3.5Western blotting檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá)水平

1.3.5.1實(shí)驗(yàn)步驟參考李莎莎等[22]關(guān)于Western blotting檢測(cè)方法。取蛋白進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳90 min，按照濕轉(zhuǎn)法將電泳產(chǎn)物放在NC膜上轉(zhuǎn)膜2 h，TBST液清洗3次，將NC膜放入封閉液中室溫下?lián)u床2 h，置于4 ℃冰箱過(guò)夜，一抗孵育用TBS稀釋(1∶500)室溫下孵育2 h，TBST清洗3次，每次10 min；二抗孵育用TBST稀釋(1∶3 000)室溫下孵育2 h,TBS清洗2次，每次5 min。最后用購(gòu)買的AB試劑盒顯色，膠片成像收集圖像。

1.3.5.2蛋白條帶分析采用BIO-RAD 凝膠成像系統(tǒng)采集膠片圖像，運(yùn)用Image-Pro Jia 6.0軟件計(jì)算條帶的OD值，并進(jìn)行半定量分析。

2　結(jié)　　果

2.1各組大鼠頸/腰椎間盤細(xì)胞生長(zhǎng)情況比色值比較干預(yù)后第1天，5組間頸/腰椎間盤細(xì)胞生長(zhǎng)情況比色值比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)；干預(yù)后的第2—7天，各中藥血清組和胎牛血清組頸/腰椎間盤細(xì)胞生長(zhǎng)情況比色值均明顯高于空白血清組(P均<0.05)，且隨作用時(shí)間呈遞增趨勢(shì)。見(jiàn)表1。

表1　各組大鼠頸/腰椎間盤細(xì)胞生長(zhǎng)情況比色值比較±s)

注：①與空白血清組比較，P<0.05。

2.2各組大鼠頸/腰椎間盤細(xì)胞CaM、CaMK和CREB蛋白表達(dá)情況比較各中藥血清組和胎牛血清組頸/腰椎間盤細(xì)胞CaM、CaMK和CREB蛋白表達(dá)量均明顯高于空白血清組(P均<0.05)；中、高劑量中藥血清組和胎牛血清組各蛋白表達(dá)量比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)，但此3組各蛋白表達(dá)量均高于低劑量中藥血清組(P均<0.05)，且高劑量中藥血清組各蛋白表達(dá)量均明顯高于中劑量中藥血清組(P均<0.05)。見(jiàn)表2。

表2　各組大鼠頸/腰椎間盤細(xì)胞CaM、CaMK和CREB蛋白表達(dá)情況比較

注：①與空白血清組比較，P<0.05；②與低劑量中藥血清組比較，P<0.05；③與中劑量中藥血清組比較，P<0.05。

3　討　　論

桂枝加葛根湯原方出自張仲景《傷寒論》，主治太陽(yáng)中風(fēng)兼太陽(yáng)經(jīng)氣不舒證。頸椎病主癥為頸項(xiàng)僵硬、頸肩疼痛，頸項(xiàng)背部又為太陽(yáng)經(jīng)脈循行部位，頸背拘急轉(zhuǎn)動(dòng)不能自如，多為風(fēng)寒外束、經(jīng)氣不舒、津液阻滯不能敷布,以致經(jīng)脈失于濡養(yǎng)。方中桂枝為君，助衛(wèi)陽(yáng)，通經(jīng)絡(luò)，解肌發(fā)表而祛在表之風(fēng)邪。白芍益陰斂營(yíng)，固斂外泄之營(yíng)陰，桂芍等量合用，內(nèi)調(diào)營(yíng)衛(wèi)、陰陽(yáng)，外可解肌發(fā)表；葛根解肌祛風(fēng)而幫助桂枝湯發(fā)表解肌、宣通經(jīng)氣，解經(jīng)脈氣血之郁滯，生津液以緩經(jīng)脈之拘急，共為臣藥。生姜辛溫，既助桂枝辛散表邪，又兼和胃止嘔；大棗甘平，既能益氣補(bǔ)中，又可資脾生津。姜棗相配，是為補(bǔ)脾和胃、調(diào)和營(yíng)衛(wèi)的常用組合，共為佐藥。炙甘草調(diào)和藥性，合桂枝辛甘化陽(yáng)以實(shí)衛(wèi)，合芍藥酸甘化陰以和營(yíng)，功兼佐使之用。上藥共奏解肌祛風(fēng)、調(diào)和營(yíng)衛(wèi)、升津舒經(jīng)之功。

獨(dú)活寄生湯方原出孫思邈《備急千金要方》。方中重用獨(dú)活為君，辛苦微溫，善治伏風(fēng)，除久痹，且性善下行，以祛下焦與筋骨間的風(fēng)寒濕邪。臣以細(xì)辛、防風(fēng)、秦艽、桂心、細(xì)辛入少陰腎經(jīng)，秦艽祛風(fēng)濕、舒筋絡(luò)而利關(guān)節(jié)，桂心溫經(jīng)散寒，通利血脈，防風(fēng)祛一身之風(fēng)而勝濕；佐入桑寄生、杜仲、牛膝以補(bǔ)益肝腎而強(qiáng)筋健骨，當(dāng)歸、川芎、地黃、白芍養(yǎng)血和血，人參、茯苓、甘草健脾益氣。縱觀全方，以祛風(fēng)寒濕邪為主，輔以補(bǔ)肝腎、益氣血之品，邪正兼顧，祛邪不傷正，扶正不留邪。

血清藥理學(xué)是指將中藥或中藥復(fù)方經(jīng)口給動(dòng)物灌服一定時(shí)間后采集動(dòng)物血液,分離血清，用含有藥物成分的血清進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)的一種半體內(nèi)實(shí)驗(yàn)方法。該方法對(duì)中藥離體實(shí)驗(yàn)有重大意義，主要針對(duì)中藥及其復(fù)方復(fù)雜多樣的化學(xué)成分特點(diǎn)，用含藥血清代替煎劑或粗提物進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)，克服了中藥粗制劑直接進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)的缺點(diǎn),其結(jié)果的可信度高。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)MTT比色法檢測(cè)中藥血清對(duì)大鼠椎間盤細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)低、中、高劑量中藥血清和胎牛血清均能明顯促進(jìn)大鼠椎間盤細(xì)胞生長(zhǎng)，這種作用跟時(shí)間、劑量息息相關(guān)，隨著中藥劑量的增加，中藥血清促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)能力增強(qiáng)。但同時(shí)由于MTT法只能用來(lái)檢測(cè)細(xì)胞相對(duì)數(shù)和相對(duì)活力，不能測(cè)定細(xì)胞絕對(duì)數(shù)，說(shuō)服力度不夠，如何更精確地測(cè)定其真實(shí)細(xì)胞數(shù)有待進(jìn)一步深入探討。本實(shí)驗(yàn)Western blotting方法檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，各劑量中藥血清均能提高大鼠椎間盤細(xì)胞CaM、CaMK Ⅱ、CaMK Ⅳ和CREB蛋白表達(dá)量，但在等效劑量(相當(dāng)于本實(shí)驗(yàn)的中劑量)以下中藥血清在提高相關(guān)蛋白表達(dá)能力方面與胎牛血清比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，等效劑量以上的中藥血清在提高相關(guān)蛋白表達(dá)水平方面與胎牛血清組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

綜上所述，分子生物學(xué)技術(shù)研究提示桂枝加葛根湯和獨(dú)活寄生湯可能通過(guò)促進(jìn)頸/腰椎椎間盤細(xì)胞的生長(zhǎng)及相關(guān)蛋白的表達(dá)水平達(dá)到防治頸/腰椎病的目的，而且其效應(yīng)過(guò)程可能存在一條重要的信號(hào)通路即CaM-CaMK-CREB通路，為臨床傳統(tǒng)中藥方劑防治頸腰椎病提供了理論支持。但由于實(shí)驗(yàn)條件的限制，本課題設(shè)計(jì)中并未加入相關(guān)蛋白抑制劑，Western blotting檢測(cè)結(jié)果只能說(shuō)明應(yīng)用中藥血清作用于大鼠椎間盤細(xì)胞可明顯改變CaM、CaMK、CREB表達(dá)，但臨床上防治頸/腰椎病的效應(yīng)過(guò)程是否確實(shí)存在著一條重要的信號(hào)通路即CaM-CaMK-CREB尚有待進(jìn)一步研究，而且是否存在其他信號(hào)通路影響也將是需要進(jìn)一步深入探討的重要問(wèn)題。

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Study on the mechanism of prevention and treatment for cervical or lumbar disease with Guizhi+Gegen decoction and Duhuo Jisheng decoction by molecular biology

ZHANG Kunmu1, LI Changhui1,SONG Hongmei1,CHEN Yan1,CHEN Qianjing1,ZHONG Zhuoqin2

(1.The Second People’s Hospital Affiliated to Fujian University of Traditional Chinese Medicine,Fuzhou 350003,Fujian,China；2.Fujian Provincial Hospital,Fuzhou 350003,Fujian,China)

Objective It is to study the mechanism of prevention and treatment for cervical or lumbar disease with Guizhi+Gegen decoction and Duhuo Jisheng decoction by molecular biology. Methods Lumbar/cervical cells in rats were treated respectively with low, medium, high dosage of serum which contained Guizhi+Gegen decoction,Duhuo Jisheng decoction and blank serum. Then the growth of the cells and the expression of correlated protein of CaM, CaMK, CREB in every group were detected by MTT colorimetric method and Western blotting technology. Results On the first day of intervention, there was no significant difference in the colorimetric value of growth of lumbar/cervical cells among the five groups(P>0.05); On the second day to the seventh day, the values in every Chinese medicine group and fetal calf serum group were significantly higher than that in blank serum group (P<0.05), and the effects were more significant with the time increase. The expression of correlated protein of CaM, CaMK, CREB in every Chinese medicine group and fetal calf serum group was obviously higher than that in blank serum group (P<0.05), there was no significant difference in the expression among medium, high dosage of Chinese medicine serum group and fetal calf serum group(P>0.05), but the expression was higher than that in low dosage group (P<0.05), and the expression in high dosage group was higher than that in medium dosage group (P<0.05). Conclusion By molecular biology technology research showed that Guizhi+Gegen decoction and Duhuo Jisheng decoction can promote the growth of the cervical, lumbar intervertebral disc cells and related protein expression level to achieve the purpose of prevention and treatment of neck, lumbar disease, and its effect to process there may be an important signaling pathways, that is CaM- CaMK-CREB pathway.

Guizhi+Gegen decoction; Duhuo Jisheng decoction; cervical spondylosis；lumbar disease; signaling pathways

張坤木，男，主治醫(yī)師，碩士，從事脊柱病及其相關(guān)性疾病的基礎(chǔ)與臨床研究。

鐘灼琴，E-mail:277873495@qq.com

福建省衛(wèi)生廳青年課題(2013-1-39)；福建省衛(wèi)生廳中醫(yī)藥課題(wzkf201304；wzln201302)；福建省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(2013J01320)

10.3969/j.issn.1008-8849.2016.25.001

R-332

A

1008-8849(2016)25-2737-05

2016-04-20