王津津, 匡昉哲, 莊　華, 陸翠杰, 匡　穎（. 上海南方模式生物科技發(fā)展有限公司, 上海00；. 上海南方模式生物研究中心, 上海00；. 同濟(jì)大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院, 上海 0009）

Prss37 基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的確定及其轉(zhuǎn)錄調(diào)控的初步探討

王津津1, 匡昉哲2, 莊華1, 陸翠杰3, 匡穎2
（1. 上海南方模式生物科技發(fā)展有限公司, 上海201203；2. 上海南方模式生物研究中心, 上海201203；3. 同濟(jì)大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院, 上海 200092）

目的確定Prss37基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，并利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)在整體水平驗(yàn)證該啟動(dòng)子的組織特異性。方法運(yùn)用cDNA 5’末端快速擴(kuò)增法（5’RACE）對(duì)C57BL/6J小鼠睪丸mRNA進(jìn)行分析，確定Prss37的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)； 構(gòu)建Prss37內(nèi)源啟動(dòng)子區(qū)域轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游不同長(zhǎng)度DNA片段（1 kb、2 kb、4 kb）驅(qū)動(dòng)的熒光素酶基因表達(dá)的質(zhì)粒；通過(guò)受精卵雄原核顯微注射技術(shù)獲得上述三種啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)熒光素酶基因表達(dá)的轉(zhuǎn)基因小鼠；利用活體成像技術(shù)觀察熒光素酶基因的表達(dá)，明確啟動(dòng)子的組織特異性。結(jié)果Prss37基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)位于NCBI GeneBankTM （NM_026317.2）報(bào)道序列上游的40 bp處； 成功獲得三種轉(zhuǎn)基因小鼠，其中1 kb啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的轉(zhuǎn)基因小鼠檢測(cè)到熒光素酶基因的表達(dá)，且在腦、睪丸和附睪組織中的表達(dá)較強(qiáng)。結(jié)論明確Prss37的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，成功獲得了睪丸和附睪表達(dá)熒光素酶基因的轉(zhuǎn)基因小鼠，為進(jìn)一步的Prss37基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究奠定了基礎(chǔ)。

Prss37基因； 轉(zhuǎn)錄； 轉(zhuǎn)基因小鼠； 熒光素酶基因

哺乳動(dòng)物的受精是一個(gè)連續(xù)的、多步驟的過(guò)程，射出的精子需要在雌性生殖道內(nèi)獲能，并完成從子宮到輸卵管的遷移，與位于輸卵管壺腹部的卵子相遇，實(shí)現(xiàn)精卵結(jié)合，進(jìn)而通過(guò)頂體反應(yīng)、皮層反應(yīng)等過(guò)程完成精卵融合［1,2］。

絲氨酸蛋白酶超家族是發(fā)現(xiàn)最早，也是最大、最多樣的酶家族之一，其在生物有機(jī)體中起著重要而廣泛的生理作用［3］，已有證據(jù)表明，絲氨酸蛋白酶在受精過(guò)程中發(fā)揮了重要作用，參與精子獲能、精卵結(jié)合等生理過(guò)程［4-7］。Prss37是一種胰酶樣絲氨酸蛋白酶，其基因特異性地表達(dá)在小鼠的睪丸組織。課題組的研究已證實(shí)，Prss37基因純合缺失的精子無(wú)法完成從雌鼠子宮向輸卵管壺腹部的遷移，且精子與卵子的識(shí)別、結(jié)合能力也顯著下降，致使小鼠雄性不育［8］。Prss37蛋白在進(jìn)化上相對(duì)保守, 人和小鼠的同源度高達(dá)91%，Prss37基因?yàn)槿祟惸行圆挥\斷和治療方面提供新的方向，也為相關(guān)避孕藥物研發(fā)提供了新的靶點(diǎn)，通過(guò)抑制該蛋白或促進(jìn)該蛋白的表達(dá)，在不影響睪丸發(fā)育和精子的情況下達(dá)到正常避孕或提高受孕率的效果。

活體動(dòng)物體內(nèi)光學(xué)成像技術(shù)是近年來(lái)一種新興的生物發(fā)光成像技術(shù)［9-11］。利用該技術(shù), 研究人員將報(bào)告基因［如熒光素酶（luciferase）或者綠色熒光蛋白等］克隆在特定基因的啟動(dòng)子序列下游, 利用轉(zhuǎn)基因小鼠技術(shù)導(dǎo)入到小鼠基因組中, 獲得可遺傳的轉(zhuǎn)基因小鼠品系, 這些小鼠被稱之為報(bào)告小鼠（reporter mice）,利用體內(nèi)光學(xué)成像技術(shù)在不傷害小鼠的情況下，可實(shí)時(shí)定量地檢測(cè)小鼠體內(nèi)熒光素酶的表達(dá)，反映活體中被研究基因轉(zhuǎn)錄的實(shí)時(shí)變化和表達(dá)位置。Prss37基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究至今未見(jiàn)報(bào)道, 作者通過(guò)cDNA5’末端快速擴(kuò)增（5’RACE）技術(shù)成功明確該基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，構(gòu)建了不同長(zhǎng)度啟動(dòng)子片段驅(qū)動(dòng)熒光素酶表達(dá)的轉(zhuǎn)基因小鼠，成功獲得了在睪丸和附睪組織中表達(dá)熒光素酶基因的小鼠，為進(jìn)一步的Prss37轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制研究提供理論和技術(shù)支持。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)C57BL/6J、基因工程小鼠等由上海南方模式生物科技發(fā)展有限公司繁育生產(chǎn)［SCXK（滬）2014-002］和研發(fā)，所有小鼠均飼養(yǎng)于上海南方模式生物研究中心SPF級(jí)動(dòng)物設(shè)施［SYXK（滬）2013-0035］，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的使用與管理嚴(yán)格遵從國(guó)際實(shí)驗(yàn)動(dòng)物評(píng)估與認(rèn)可管理委員會(huì)（AAALAC）的規(guī)定，實(shí)驗(yàn)方案得到中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用管理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.2質(zhì)粒和菌株

D-H5α為天根公司產(chǎn)品，pMD18-T載體購(gòu)自TaKaRa公司, pGL3-basic vector購(gòu)自Promega公司。

1.3試劑

各種限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、Taq酶、PCR及RT-PCR相關(guān)試劑等均購(gòu)自Takara公司，蛋白酶K購(gòu)自Amresco公司。常規(guī)化學(xué)試劑主要購(gòu)自Sigma-Aldrich公司、上海國(guó)藥集團(tuán)和生工生物工程（上海）有限公司, 熒光素鉀鹽（Potassium Lucifein）購(gòu)自Gold Biotechnology公司，Luciferase Assay System購(gòu)自Promega公司，Trizol試劑購(gòu)自nvitrogen或Takara公司，SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒為Takara公司。

1.4引物

所有引物均采用PrimerSelect 軟件包根據(jù)序列資料自行設(shè)計(jì)，由上海生工生物技術(shù)公司合成，引物終濃度均為10 μmol/mL，引物序列如下。

5’RACE引物：

ower1： GGGGGATGTCTACCGGAGCCAGCA；

ower5： CAGCAGAGGCCGGAATCTTCTGCTCAC

載體構(gòu)建引物：

P1： ACC CTCGAG CTGTCACTGTTTCATCACTCAGATATCATCAC

P2： AAT ACGCGT GACCCAGAAATGAACCCAC-

ACACC

P3： TAG ACGCGT ACCGTTGCTGTGCTTCC-TCTA

P4： CTG ACGCGT GCAGTAAATGGGAGCAAAGAACTTCAC

小鼠基因型鑒定引物：

Pre40： GTGATGATATCTGAGTGATGAAACAGTG；Plower： GTCACATCTCATCTACCTCCCGG；

小鼠Luciferase表達(dá)檢測(cè)引物：

Luciferase-F： GCCAAAAGCACTCTGATTGAC

Luciferase-R： CCATATCCTTGCCTGATACCTG

RT-PCR所用引物：

Actb F： TACCCAGGCATTGCTG-ACAGG

Actb R：ACTTGCGGTGCACGATGGA

Prss37 R： CCTGCCACCTTCAA-CCACAA-3

Prss37 R： GGCTGCTTCCTTGTT-GAGT-3

1.55’ cDNA末端快速克隆（5’RACE）

小鼠睪丸組織總RNA用Trizol法抽提，利用紫外分光光度計(jì)測(cè)定并計(jì)算A260/A280比值。根據(jù)已知小鼠Prss37的基因組序列采用PrimerSelect軟件設(shè)計(jì)2條用于5’RACE的基因特異性引物（lower1和lower5），這種方法能最大程度保證完整的釣取Prss37基因的5’端序列及其可能的剪接變異體。實(shí)驗(yàn)采用Clontech公司的SMARTer RACE cDNA Amplification試劑盒進(jìn)行，之后用膠回收試劑盒回收5’RACE擴(kuò)增產(chǎn)物，與pMD18-T載體連接，用DH5α感受態(tài)進(jìn)行轉(zhuǎn)化，涂板，之后挑取克隆并將篩選為陽(yáng)性的克隆進(jìn)行測(cè)序。運(yùn)用DNA測(cè)序和生物信息學(xué)分析等方法，將小鼠Prss37基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)與Ensembl數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.ensembl.org/ index.html）中已公布數(shù)據(jù)的進(jìn)行比較。

1.6小鼠Prss37啟動(dòng)子不同長(zhǎng)度片段載體的構(gòu)建

運(yùn)用生物信息學(xué)分析，在經(jīng)實(shí)驗(yàn)確認(rèn)的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)之后第一個(gè)ATG之前，分別用引物P2和P1、P3和P1以及P4和P1，以C57BL/6J成年雄鼠睪丸組織的cDNA為模板，用PrimeSTAR高保真酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增，分別獲得長(zhǎng)度約4 kb、2 kb 和1 kb的PCR產(chǎn)物，這些產(chǎn)物通過(guò)T4連接酶分別連接到pMD18-T的載體上，之后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)，挑取克隆，抽質(zhì)粒，并將所得到的質(zhì)粒進(jìn)行序列分析，將序列結(jié)果正確的質(zhì)粒經(jīng)Mlu I及Xho I雙酶切，定向克隆到pGL3-Basic載體上，構(gòu)建含有Prss37啟動(dòng)子序列和熒光素酶報(bào)告基因的重組質(zhì)粒。

1.7轉(zhuǎn)基因小鼠的制備

通過(guò)Not I和Sal I雙酶切以獲得線性化的轉(zhuǎn)基因質(zhì)粒，質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠回收純化包含Prss37啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的熒光素酶表達(dá)所需原件的片段，受精卵雄原核顯微注射建立了轉(zhuǎn)基因小鼠，受精卵供體為C57BL/6J小鼠。

1.8轉(zhuǎn)基因小鼠的繁育及基因型鑒定

各轉(zhuǎn)基因小鼠品系的繁殖始終維持在C57BL/6J背景。小鼠出生后，剪鼠尾進(jìn)行裂解及基因型鑒定，在轉(zhuǎn)基因小鼠的基因組上分別設(shè)計(jì)5’端啟動(dòng)子區(qū)域的Pre40及3’端熒光素酶基因區(qū)域的plower引物以進(jìn)行PCR鑒定。其反應(yīng)條件為：95 ℃變性4 min, 95 ℃ 30 s變性、60 ℃ 30 s退火以及72 ℃30 s延伸，擴(kuò)增34個(gè)循環(huán)后，72 ℃ 10 min。對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，陽(yáng)性小鼠應(yīng)能擴(kuò)增出612 bp大小條帶，對(duì)照小鼠應(yīng)沒(méi)有條帶出現(xiàn)。

1.9轉(zhuǎn)基因小鼠RNA水平表達(dá)分析

不同組織的總RNA采用Trizol法（Invitrogen, Carlsbad, CA）抽提，步驟按說(shuō)明書操作。所有RNA均用DNA酶處理。mRNA表達(dá)水平利用半定量和熒光定量PCR進(jìn)行研究。β-actin用作內(nèi)參。熒光定量PCR使用SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒（Takara, 大連, 中國(guó)）, 在Eppendorf的Mastercycler系統(tǒng)上操作。反應(yīng)條件設(shè)置為： 94 ℃ 30 s，60 ℃20 s，72 ℃ 20 s，運(yùn)行40 個(gè)循環(huán)，每個(gè)樣品做三個(gè)復(fù)孔。目標(biāo)產(chǎn)物與非特異擴(kuò)增產(chǎn)物的區(qū)分通過(guò)熔解曲線分析實(shí)現(xiàn)。熒光素酶基因的表達(dá)水平根據(jù)β-actin的含量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理。

1.10熒光素酶蛋白水平表達(dá)的檢測(cè)

1.10.1活體熒光素酶的化學(xué)發(fā)光檢測(cè)分析采用IVIS（In Vivo Imaging Systems）成像系統(tǒng)（Xenogen），每只待測(cè)小鼠腹部剃毛并且腹腔注射150 μL的熒光素鈉鹽（15 mg/mL，以PBS為溶劑）。小鼠用異氟烷/氧氣系統(tǒng)麻醉，熒光素鈉鹽注射12 min后，小鼠被置于成像系統(tǒng)的觀測(cè)設(shè)備中成像，小鼠在暗盒中成像3 min。圖像的熒光強(qiáng)度使用Living Image software （Xenogen）進(jìn)行分析。

1.10.2體外熒光素酶活性的檢測(cè)小鼠斷頸處死后，取50～100 mg各待檢測(cè)組織，加入500 mL的裂解液（Promega）勻漿，4 ℃，12 000 r/min，離心15 min, 取上清即為蛋白樣品。使用 Luciferase Assay System試劑盒（Promega），用化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀Luminometer TD-20/20（Lumat LB9507）檢測(cè)熒光強(qiáng)度。組織蛋白濃度采用BCA法測(cè)定（Pierce），定量后將測(cè)得的熒光數(shù)值用蛋白濃度來(lái)標(biāo)準(zhǔn)化，得到每毫克蛋白的熒光值。

1.11統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

定量結(jié)果（平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差）以圖形方式呈現(xiàn)。觀察到的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異使用One-way ANOVA（方差分析）檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.15’RACE分析Prss37基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)

采用5’RACE技術(shù)，成功鑒定了Prss37基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)。5’RACE結(jié)果顯示Prss37基因轉(zhuǎn)錄本的起始位點(diǎn)比現(xiàn)有N C B I數(shù)據(jù)庫(kù)中（NM_026317.2）公布的位置向前推移了40 bp, 即現(xiàn)已公布的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)位于實(shí)際的+40的位置（圖1）。新發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)被設(shè)定為新的+1，在以下的研究中涉及到的位置信息均在此基礎(chǔ)上編號(hào)。

2.2Prss37啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)熒光素酶基因表達(dá)的小鼠的構(gòu)建

本實(shí)驗(yàn)室前期研究結(jié)果［8］表明，Prss37基因在小鼠睪丸中的精子塑形過(guò)程中特異性表達(dá)，在其它組織和其它時(shí)相均未見(jiàn)其表達(dá)。由于沒(méi)能找到內(nèi)源性表達(dá)該基因的細(xì)胞系，及該基因?yàn)榫铀苄芜^(guò)程中表達(dá)的特點(diǎn)，因此在睪丸原代培養(yǎng)的情況下，不論是表達(dá)該基因的精子細(xì)胞數(shù)目還是轉(zhuǎn)染效率，均無(wú)法在體外篩選該基因啟動(dòng)子的序列?；谏鲜銮闆r，并結(jié)合以往對(duì)啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)的認(rèn)知，作者分別選取了不同長(zhǎng)度的啟動(dòng)子序列擬構(gòu)建帶有熒光素酶報(bào)告基因的載體，以期獲得轉(zhuǎn)基因小鼠，并通過(guò)所能觀察到的轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性小鼠體內(nèi)熒光素酶的時(shí)空特異性表達(dá)情況來(lái)分析Prss37啟動(dòng)子的具體長(zhǎng)度及其可能的機(jī)制

PCR結(jié)合測(cè)序技術(shù)獲得大約1 kb、2 kb、4 kb 的Prss37啟動(dòng)子序列，并將其克隆到pGL3-Basic vector上，構(gòu)建由Prss37啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的熒光素酶（Luciferase）報(bào)告基因載體，三種啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)基因質(zhì)粒結(jié)構(gòu)圖見(jiàn)圖2。酶切鑒定及DNA測(cè)序正確后，用Not I和Sal I進(jìn)行線性化，將所獲得的DNA片段用于外源基因的受精卵（C57BL/6J背景）雄原核顯微注射，所獲得的小鼠進(jìn)行PCR檢測(cè)，陽(yáng)性小鼠即為首建鼠。

三種啟動(dòng)子序列均獲得轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性鼠（表1）。三種啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)基因首建鼠的基因型鑒定結(jié)果詳見(jiàn)圖3。

圖1　Prss37基因的啟動(dòng)子序列

表1　三種轉(zhuǎn)基因小鼠顯微注射結(jié)果

2.3轉(zhuǎn)基因小鼠的繁育及活體熒光素酶基因表達(dá)的檢測(cè)

三種轉(zhuǎn)基因首建鼠與C57BL/6J小鼠交配，經(jīng)繁育1 kb 啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)基因小鼠有6只首建鼠成功建系, 后代小鼠經(jīng)活體成像分析僅49#首建鼠的后代觀察到熒光素酶的表達(dá)（圖4A），后續(xù)僅對(duì)49系小鼠進(jìn)行繁殖；2 kb 和4 kb 啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)基因小鼠分別有4只和7只首建鼠成功建系，后代均未檢測(cè)到熒光素酶的表達(dá)。

在49系首建鼠的傳代過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)16只F1代小鼠中有11只為陽(yáng)性鼠，明顯高于后代中應(yīng)有50%陽(yáng)性鼠的理論值（8只），此現(xiàn)象可能歸因于普通轉(zhuǎn)基因技術(shù)的多位點(diǎn)、多拷貝插入的特點(diǎn)。

取1 kb-49系F2代的小鼠通過(guò)小動(dòng)物活體成像系統(tǒng)進(jìn)行活體熒光的采集，結(jié)果顯示由不同的F1代小鼠繁育出的F2代陽(yáng)性雄鼠的發(fā)光情況并不相同，推測(cè)與插入片段的整合位點(diǎn)有關(guān)。

圖2　三種啟動(dòng)子-熒光素酶轉(zhuǎn)基因質(zhì)粒結(jié)構(gòu)圖

圖3　三種轉(zhuǎn)基因首建鼠的PCR

2.4轉(zhuǎn)基因小鼠熒光素酶基因表達(dá)的組織特異性為了確定熒光素酶基因的組織表達(dá)譜, 取轉(zhuǎn)基因雄鼠的10個(gè)不同組織［腦（Briain）、唾腺（Salivary gland）、胸腺（Thymus）］、心臟（Heart）、肺（Lung）、肝臟（Liver）、脾臟（Spleen）、腎（Kidney）、睪丸（Testis）、附睪（Epididymis）進(jìn)行RNA的抽提及反轉(zhuǎn)錄，并通過(guò)RT-PCR檢測(cè)，結(jié)果顯示熒光素酶基因在各檢測(cè)組織中皆有一定量的表達(dá), 其中, 腦, 睪丸和附睪組織中高表達(dá)（圖4 B）。

同時(shí)抽提上述10種組織的蛋白，通過(guò)化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀Luminometer TD-20/20 （Lumat LB9507）檢測(cè)，顯示熒光素酶基因在轉(zhuǎn)基因小鼠中的表達(dá)譜與RNA水平的相同（圖4 C）。

圖4　啟動(dòng)子-1 kb轉(zhuǎn)基因鼠熒光素酶基因表達(dá)檢測(cè)

2.5轉(zhuǎn)基因小鼠熒光素酶基因表達(dá)時(shí)空特異性

通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)基因鼠睪丸及附睪組織蛋白的體內(nèi)、體外熒光素酶活性的檢測(cè)，表明睪丸組織中熒光素酶從第一周就開(kāi)始有表達(dá)，到第二周之后表達(dá)量趨于穩(wěn)定。而在附睪中則從第二周開(kāi)始有表達(dá)，并逐漸升高, 到第6周最高, 到第八周開(kāi)始又有所下降圖5）。以上結(jié)果提示, 1 kb啟動(dòng)子可能不是決定Prss37基因組織特異性和時(shí)空特異性的關(guān)鍵區(qū)域。

3　討論

課題組以往的研究證實(shí)了Prss37基因的缺失會(huì)導(dǎo)致雄性不育，且與精子在輸卵管中的遷移和精卵結(jié)合密切相關(guān)，并在不明原因男性不育病人的精子中發(fā)現(xiàn)了該基因的表達(dá)下降（相關(guān)內(nèi)容將在另一篇文章中發(fā)表），表明該基因的表達(dá)與人類男性不育相關(guān)，有臨床應(yīng)用價(jià)值。

小鼠Prss37基因特異性地表達(dá)于睪丸組織中，且在小鼠出生后23 d開(kāi)始轉(zhuǎn)錄，28 日齡開(kāi)始可檢測(cè)到的蛋白的表達(dá)［8］，提示Prss37基因的轉(zhuǎn)錄受到嚴(yán)格的調(diào)控。課題組通過(guò)5’RACE技術(shù)確定了該基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，為尋找體外研究該基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控的細(xì)胞系, 對(duì)兩個(gè)小鼠生精細(xì)胞系GC-1 spg 和GC-2 spd中該基因的內(nèi)源性表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，均未發(fā)現(xiàn)該基因的表達(dá)，該基因表達(dá)的特殊性致使無(wú)法在體外開(kāi)展啟動(dòng)子活性的研究。為此，課題組分別選取不同長(zhǎng)度（1 kb、2 kb、4 kb）的啟動(dòng)子序列構(gòu)建帶有熒光素酶基因的載體，并通過(guò)受精卵雄原核顯微注射構(gòu)建轉(zhuǎn)基因小鼠，然而在轉(zhuǎn)基因小鼠的后續(xù)繁育及表達(dá)檢測(cè)過(guò)程中僅1 kb啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)基因小鼠（49系）檢測(cè)到熒光素酶基因的表達(dá)，但未能實(shí)現(xiàn)睪丸特異性表達(dá)； 同時(shí)在49系小鼠傳代過(guò)程中,發(fā)現(xiàn)16只F1代小鼠中有11只為轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性鼠, 明顯高于后代中應(yīng)有50%陽(yáng)性鼠的理論值（8只）, 且在F2代轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性小鼠中也有熒光素酶基因不表達(dá)的情況，推測(cè)該系小鼠的轉(zhuǎn)基因片段存在多位點(diǎn)插入的可能, 詳細(xì)的分子機(jī)制有待進(jìn)一步研究?，F(xiàn)有的研究結(jié)果［12］已經(jīng)證明, 雄原核顯微注射獲得的轉(zhuǎn)基因小鼠存在外源片段隨機(jī)整合、多拷貝串聯(lián)、多位點(diǎn)整合的可能性，位置效應(yīng)直接影響外源基因的表達(dá)，故上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果并不能說(shuō)明所獲得的啟動(dòng)子序列不能實(shí)現(xiàn)外源基因表達(dá)的組織和時(shí)空特異性，課題組將通過(guò)同源重組技術(shù)將上述轉(zhuǎn)基因片段敲入小鼠rosa26基因位點(diǎn), 進(jìn)一步驗(yàn)證啟動(dòng)子片段的活性。

該研究獲得的轉(zhuǎn)基因小鼠模型中熒光素酶基因的表達(dá)未能完全模擬體內(nèi)Prss37基因的表達(dá)，為此課題組將通過(guò)同源重組技術(shù)將熒光素酶基因定點(diǎn)插入小鼠Prss37基因啟動(dòng)子下游，以期獲得治療男性不育藥物和節(jié)育藥物篩選的理想動(dòng)物模型。

圖5　熒光素酶基因表達(dá)時(shí)空特異性分析

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Identification of Mouse Prss37 Transcription Initiation Site and Preliminary Analysis of Its Transcription Regulation

WANG Jin-jin1, KUANG Fang-zhe1, ZHUANG Hua1, LU Cui-jie3, KUANG Ying2
（1. Shanghai Biomodel Organism Science & Technology Development Company， Shanghai 201203， China；2. Shanghai Research Center for Biomodel Organisms， Shanghai 201203， China；3. School of Life Science and Technology， Tongji University， Shanghai 200092， China）

ObjectiveTo determine the transcription initiation site of mouse Prss37 gene, and verify the tissue specificity of the promoter in vivo using transgenic technology. MethodsThe transcription initiation site was identified by 5' rapid amplification of cDNA ends （5' RACE ） used to analyze the mRNA of testis from C57BL/6J mice . The plasmids including different lengths of promoter （1kb, 4kb, and 6kb）and luciferase gene were constructed. Then, these plasmids were injected into male pronucleus by microinjection technique to obtain luciferase positive transgenic mice. ResultsThe transcription start site of Prss37 gene was located at the 40bp site upstream of the predicted site reported in GeneBankTM （NM_026317.2）. Moreover, three kinds of transgenic mice were successfully established, but the expression of luciferase gene was only detectable in transgenic mice driven by 1kb promoter. The higher expression level of luciferase was found in brain, testis and epididymis tissues. ConclusionThe transgenic mice expressing luciferase in testis and epididymis tissues were successfully established, which laid a foundation for further research on the transcriptional regulation of Prss37 gene.

Prss37 gene； Transcription； Transgenic mice； Luciferase gene

Q95-33

A

1674-5817（2016）02-0093-08

10.3969/j.issn.1674-5817.2016.02.003

2015-12-08

上海市科委項(xiàng)目資助（13140901400, 14140900400, 13DZ2280600）

王津津（1983-）, 博士, 女, 助理研究員。E-mail： jinjin.wang@shmo.com.cn

匡穎（1965-）, 女, 碩士, 研究員。E-mail： ying.kuang@shmo.com.cn