胡文娟, 方　天, 劉　彪, 梁　磊, 趙志剛, 賈春梅, 陳　莉, 許龍祥, 惲?xí)r鋒（南京軍區(qū)南京總醫(yī)院比較醫(yī)學(xué)科, 全軍實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科普與倫理教育基地, 全國(guó)科普教育基地, 南京 210002）

綠色熒光裸小鼠睪丸組織學(xué)觀察及精子質(zhì)量檢查

胡文娟, 方天, 劉彪, 梁磊, 趙志剛, 賈春梅, 陳莉, 許龍祥, 惲?xí)r鋒
（南京軍區(qū)南京總醫(yī)院比較醫(yī)學(xué)科, 全軍實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科普與倫理教育基地, 全國(guó)科普教育基地, 南京 210002）

目的探討綠色熒光裸小鼠繁殖率低下的原因。方法對(duì)綠色熒光裸小鼠的睪丸及附睪進(jìn)行組織病理學(xué)及精子質(zhì)量檢查。比較雄性綠色熒光裸小鼠與BALB/c裸小鼠的睪丸、附睪臟器系數(shù)和精子濃度、精子活力、活率及精子畸形率； 觀察睪丸及附睪組織病理學(xué)變化。結(jié)果雄性綠色熒光裸小鼠及BALB/c裸小鼠的睪丸、附睪臟器系數(shù)、精子濃度及組織結(jié)構(gòu)并無(wú)顯著差異（P＞0.05）； 但精子活力（直線運(yùn)動(dòng)和原地轉(zhuǎn)動(dòng)及靜止不動(dòng)）的構(gòu)成比、活精子率及畸形率間均具有顯著差異（P＜0.05）。結(jié)論雄性綠色熒光裸小鼠精子質(zhì)量（活力、活率及畸形率等方面）略為低下可能是影響綠色熒光裸小鼠繁殖性能的原因之一。

綠色熒光； 精子濃度； 精子質(zhì)量； 繁殖性能

綠色熒光裸小鼠是本科室將綠色熒光蛋白GFP）基因?qū)隑ALB/c 裸小鼠而得來(lái)。GFP現(xiàn)已成為細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)中應(yīng)用最廣泛的分子標(biāo)記之一。綠色熒光裸小鼠因自身含有標(biāo)記蛋白與普通裸小鼠相比而具有明顯的優(yōu)勢(shì)。但在日常繁育中, 發(fā)現(xiàn)綠色熒光裸小鼠與普通裸小鼠相比較, 繁殖性能較為低下，平均生產(chǎn)胎次及窩產(chǎn)仔數(shù)均低于普通裸小鼠。為查明其繁殖性能低下的原因, 作者對(duì)雄性綠色熒光裸小鼠與BALB/c裸小鼠的睪丸及附睪組織、精子質(zhì)量進(jìn)行檢測(cè)與比較，結(jié)果如下。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

分別取8～10周齡SPF級(jí)雄性綠色熒光裸小鼠及普通BALB/c裸小鼠各10只，綠色熒光裸小鼠由本科室提供［SCXK（蘇）2012-0014］, BALB/c裸小鼠購(gòu)自常州卡文斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司［SCXK（蘇）2011-0003］），實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均置于無(wú)菌條件下飼養(yǎng), 自由飲食, 物品嚴(yán)格滅菌處理, 保持一定的溫度與濕度。

1.2方法

1.2.1睪丸、附睪的臟器系數(shù)測(cè)定取動(dòng)物稱體質(zhì)量后，用水合氯醛（4%）進(jìn)行麻醉，以0.2 mL/20 g腹腔注射，常規(guī)解剖后分離睪丸、附睪，及時(shí)稱重并記錄，并計(jì)算臟器系數(shù)［臟器質(zhì)量（mg）/體質(zhì)量（g）］。

1.2.2精子計(jì)數(shù)取一側(cè)附睪置于含生理鹽水的小燒杯中剪開(kāi)，用鑷子輕輕攪動(dòng)，使精子游離，用擦鏡紙過(guò)濾后加入3 mL生理鹽水（經(jīng)37 ℃水浴鍋預(yù)溫）制成精子懸液。吸取二次稀釋的精子懸液，滴加于計(jì)數(shù)板與蓋玻片接觸處，使精液自然流入計(jì)數(shù)室中，按紅細(xì)胞計(jì)數(shù)法，進(jìn)行精子計(jì)數(shù)。

1.2.3精子活力檢測(cè)參照文獻(xiàn)［1］方法，在光學(xué)顯微鏡下觀察懸液中精子的活動(dòng)度, 連續(xù)計(jì)數(shù)200個(gè)精子。精子活動(dòng)分3級(jí)（直線向前運(yùn)動(dòng)、原地轉(zhuǎn)動(dòng)和靜止不動(dòng)）。檢測(cè)并計(jì)算精子活力。

1.2.4精子畸變率檢測(cè)將精子懸液涂片，自然干燥, 體積分?jǐn)?shù)4%甲醇固定，2%伊紅染液染色1 h,沖洗晾干。高倍鏡下作精子形態(tài)分析，每只小鼠涂片3次，每次500個(gè)精子，統(tǒng)計(jì)出其所含的畸形精子數(shù)，計(jì)算畸形率。

1.2.5睪丸及附睪病理組織學(xué)觀察取一側(cè)睪丸及附睪經(jīng)常規(guī)HE染色制成病理標(biāo)本片，在光學(xué)顯微鏡下觀察組織病理學(xué)變化。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2　結(jié)果

2.1睪丸及附睪臟器系數(shù)

兩組雄性綠色熒光裸小鼠及BALB/c裸小鼠睪丸、附睪的臟器系數(shù)無(wú)顯著差異（P＞0.05）（表1）。

2.2精子計(jì)數(shù)、精子活力及畸形率

由表2可知，與BALB/c裸小鼠比較，綠色熒光裸小鼠的精子濃度略有降低（P＞0.05）； 直線運(yùn)動(dòng)和原地轉(zhuǎn)動(dòng)的構(gòu)成比下降，而靜止不動(dòng)的構(gòu)成比上升（P＜0.05）； 兩組裸小鼠的活精子率和畸形率均具有明顯差異（P＜0.05）。綠色熒光裸小鼠與BALB/c裸小鼠精子畸形觀察見(jiàn)圖1、2。

2.3睪丸及附睪組織病理學(xué)觀察

光學(xué)顯微鏡下可見(jiàn)，綠色熒光裸小鼠睪丸曲細(xì)精管排列致密有序，結(jié)構(gòu)完整，曲細(xì)精管直徑與生精小管上皮的厚度正常，支持細(xì)胞與各級(jí)生精細(xì)胞形態(tài)及數(shù)量未見(jiàn)明顯異常，精原細(xì)胞近圓形,胞核較大, 管腔內(nèi)可見(jiàn)精子, 睪丸被膜正常（圖3A）。BALB/c裸小鼠睪丸曲細(xì)精管生長(zhǎng)良好, 生精細(xì)胞排列整齊, 層次清楚, 結(jié)構(gòu)正常, 有明顯管腔, 細(xì)胞數(shù)量多，細(xì)胞形態(tài)未見(jiàn)異常（圖3B）。綠色熒光裸小鼠附睪上皮細(xì)胞排列緊密，主細(xì)胞胞質(zhì)飽滿, 管腔內(nèi)有大量精子, 未見(jiàn)異常（圖3C）。BALB/c裸小鼠附睪上皮細(xì)胞排列有序, 管腔面有細(xì)長(zhǎng)靜纖毛, 腔內(nèi)可見(jiàn)大量精子（圖3D）。由此可見(jiàn), 綠色熒光裸小鼠睪丸及附睪組織結(jié)構(gòu)并未發(fā)生病理變化, 與BALB/c裸小鼠的睪丸及附睪組織結(jié)構(gòu)相似, 并未查見(jiàn)明顯改變。

表1　綠色熒光裸小鼠睪丸系數(shù)、附睪系數(shù)檢測(cè)

表2　綠色熒光裸小鼠附睪精子密度和精子質(zhì)量的檢測(cè)

圖1　BALB/c裸小鼠精子畸形（HE×200）　

圖2　綠色熒光裸小鼠精子畸形（HE×200）

3　討論

綠色熒光蛋白小鼠的啟動(dòng)子為β-actin, 它在維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)、細(xì)胞分裂等細(xì)胞生理活動(dòng)方面發(fā)揮著重要作用，因而綠色熒光蛋白也可以隨著細(xì)胞的分裂而表達(dá)［2］。肖紅衛(wèi)等［3］研究表明，綠色熒光蛋白并未隨綠色熒光蛋白小鼠的傳代而發(fā)生明顯消退。李甫強(qiáng)等［4］研究表明，在綠色熒光蛋白小鼠的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）原代培養(yǎng)中，當(dāng)BMSCs傳5代時(shí)在熒光顯微鏡下仍帶有綠色熒光表達(dá)，說(shuō)明在傳代過(guò)程中綠色熒光蛋白基因能穩(wěn)定表達(dá)。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)雄性綠色熒光蛋白裸小鼠與BALB/c裸小鼠的精子, 精子發(fā)生部位（睪丸）, 以及精子發(fā)育、成熟部位（附睪）進(jìn)行了觀察與相關(guān)檢測(cè)。結(jié)果顯示,雄性綠色熒光蛋白裸小鼠及BALB/c裸小鼠的睪丸、附睪臟器系數(shù)并無(wú)顯著差異（P＞0.05）； 雄性BALB/c裸小鼠精子濃度比綠色熒光蛋白雄性裸小鼠略高, 但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）； 雄性綠色熒光蛋白裸小鼠精子的直線運(yùn)動(dòng)和原地轉(zhuǎn)動(dòng)的構(gòu)成比較BALB/c裸小鼠均有所下降, 而靜止不動(dòng)的構(gòu)成比略有上升, 數(shù)據(jù)之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）； 雄性綠色熒光蛋白裸小鼠的活精子率明顯低于雄性BALB/c裸小鼠的活精子率（P＜0.05）； 雄性綠色熒光蛋白裸小鼠精子畸形率較高，與雄性BALB/c裸小鼠差異明顯P＜0.05）。光鏡下可見(jiàn), 綠色熒光蛋白裸小鼠與BALB/c裸小鼠的睪丸及附睪組織結(jié)構(gòu)并無(wú)明顯差異。由檢測(cè)數(shù)據(jù)分析, 顯示雄性綠色熒光蛋白裸小鼠的睪丸、附睪臟器系數(shù)及睪丸、附睪的組織結(jié)構(gòu)并未對(duì)其繁殖性能造成顯著的影響, 其精子活力、活率及畸形率等方面水平低下更有可能影響了綠色熒光蛋白裸小鼠的繁殖性能, 從而使其繁殖性能下降。研究表明，日常繁育中綠色熒光蛋白裸小鼠的繁殖率較BALB/c裸小鼠低下，可能是由于雄性綠色熒光蛋白裸小鼠的精子質(zhì)量（活力、活率及畸形率等方面）有所下降，影響了其生殖功能。

圖3　裸小鼠睪丸及附睪組織病理學(xué)觀察

［1］余同輝, 吳人亮, 甘亞平, 等. 三苯氧胺對(duì)小鼠精子的毒性作用［J］. 華中科技大學(xué)學(xué)報(bào)： 醫(yī)學(xué)版, 2006, 35（1）：107-109.

［2］夏來(lái)新, 程漢華, 郭一清, 等. 黃鱔β-actin基因的克隆及其在魚類中的系統(tǒng)發(fā)生分析［J］. 遺傳學(xué)報(bào), 2005, 32（7）：689-695.

［3］肖紅衛(wèi), 鄭新, 劉中華, 等. 綠色熒光蛋白基因轉(zhuǎn)基因小鼠傳代中的生物學(xué)觀察［C］. 第15次全國(guó)動(dòng)物遺傳育種學(xué)術(shù)討論會(huì)論文集.陜西楊凌： 中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì), 1999：209.

［4］李甫強(qiáng), 周鴻鷹, 羊惠君, 等. 差速貼壁法純化分離綠色熒光轉(zhuǎn)基因小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞［J］. 四川大學(xué)學(xué)報(bào)： 醫(yī)學(xué)版, 2006, 37（2）：301-304.

Q95-33

A

1674-5817（2016）02-0126-03

10.3969/j.issn.1674-5817.2016.02.009

2015-10-12

胡文娟（1990-）, 女, 技師, 從事裸小鼠的育種與科研。E-mail： 452665670@qq.com

惲?xí)r鋒（1965-）, 男, 教授, 從事醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)。E-mail： yunshifeng1@163.com