余　飛, 錢麗萍, 丁利軍（南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院. 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心, . 生殖醫(yī)學(xué)中心, 南京0008）

微小RNA簇miR-302s條件性基因打靶小鼠的制備和鑒定

余飛1, 錢麗萍1, 丁利軍2
（南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院1. 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心, 2. 生殖醫(yī)學(xué)中心, 南京210008）

目的制備微小RNA簇miR-302s條件性基因打靶小鼠。方法構(gòu)建miR-302s打靶載體,通過(guò)電穿孔的方法轉(zhuǎn)染胚胎干細(xì)胞（ES細(xì)胞），用正負(fù)篩選法篩選陽(yáng)性ES細(xì)胞并進(jìn)行PCR鑒定和Southern分析。利用顯微注射技術(shù)將正確同源重組的ES細(xì)胞注射至B6（Cg）-Tyr＜sup＞c-2J＜/sup＞/J小鼠囊胚腔內(nèi)，注射后的囊胚植入受體小鼠子宮。將得到的嵌合體小鼠與野生型雌鼠交配獲得miR-302s-LoxP基因打靶小鼠。結(jié)果獲得嵌合體小鼠11只, 其中4只嵌合雄鼠嵌合率＞50%。利用嵌合體小鼠進(jìn)行繁育交配，得到miR-302s基因打靶雜合子小鼠11只。結(jié)論成功建立miR-302s條件性基因打靶小鼠模型，為進(jìn)一步研究miR-302s基因功能打下基礎(chǔ)。

miR-302s； 條件性基因打靶小鼠； 胚胎干細(xì)胞； 同源重組

MicroRNAs （miRNAs）是人類新發(fā)現(xiàn)的一類長(zhǎng)約22 nt的非編碼單鏈小RNA分子，通過(guò)堿基配對(duì)原則與靶mRNA的3'UTR區(qū)結(jié)合，誘發(fā)轉(zhuǎn)錄后抑制與降解, 從而調(diào)控靶基因的表達(dá)［1］。miR-302家族有miR-302a, 302b, 302c, 302d四個(gè)高度同源的成員，合稱為miR-302s。小鼠miR-302s位于3號(hào)染色體內(nèi)串聯(lián)排列, 調(diào)節(jié)大約445個(gè)基因, 且各個(gè)miRNA所調(diào)節(jié)的靶基因基本相同, 這些基因的功能涉及早期胚胎發(fā)育相關(guān)的信號(hào)或影響干細(xì)胞分化［2-4］。miR-302s在調(diào)節(jié)基因組DNA表觀遺傳，維持干細(xì)胞特性方面具有重要作用［5,6］。本實(shí)驗(yàn)嘗試制備miR-302s條件性基因打靶小鼠模型，為進(jìn)一步研究miR-302s維持胚胎發(fā)育和干細(xì)胞分化的機(jī)制打下基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料

基因打靶所用胚胎干細(xì)胞： 源自B6/BLU雄性小鼠（毛色為黑色）, 南京大學(xué)模式動(dòng)物研究所提供, 輻照后MEF為飼養(yǎng)層, 小鼠胚胎干細(xì)胞（ES細(xì)胞）培養(yǎng)基配制參考文獻(xiàn)［7］。注射用囊胚： B6（Cg）-Tyr＜sup＞c-2J＜/sup＞/J雌鼠（毛色為白色）通過(guò)超數(shù)排卵、自然受孕和胚胎體內(nèi)發(fā)育至囊胚階段, 用于顯微注射。胚胎操作液為M2, 胚胎培養(yǎng)液為M16, 購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。假孕受體小鼠為封閉群ICR小鼠。小鼠均購(gòu)于南京大學(xué)模式動(dòng)物研究所［SCXK（蘇）2015-0001］，飼養(yǎng)于南京大學(xué)模式動(dòng)物研究所屏障環(huán)境下［SYXK（蘇）2015-0001］。生物試劑： 各種限制性內(nèi)切酶、T4DNA 連接酶、Taq酶等購(gòu)自TaKaRa 及NEB公司, DNA marker（1 kb ladder） 購(gòu)自晶美生物工程公司, 質(zhì)粒抽提試劑盒及凝膠回收試劑盒購(gòu)自Qiagen公司。細(xì)胞培養(yǎng)所需試劑為Invitrogen公司產(chǎn)品。引物合成和測(cè)序由上海英駿生物技術(shù)有限公司完成。

1.2方法

1.2.1miR-302s條件性基因打靶載體的構(gòu)建和鑒定以含有neo-tk基因的pLoxPneo載體為基本骨架, 用涵蓋8個(gè)miRNAs的mir-302基因簇 （miR-302b*-b-c*-c-a*-a-d-367）片段為構(gòu)建載體的重組DNA片段，引入LoxP，建立miR-302s的條件性打靶載體（圖1）。終載體構(gòu)建完成后經(jīng)PCR、酶切等方法進(jìn)行驗(yàn)證。PCR引物為miR-302s-loxptF： 5'-CCTCCTTTACTTTAACATGGAGG-3'； miR-302s-loxptR： 5'-CTCTACTGAGGAGGAGAAGGAGA-3'。PCR產(chǎn)物大小379 bp。圖2為最終載體圖譜, 并對(duì)載體進(jìn)行測(cè)序。

圖1　miR-302s 基因打靶小鼠打靶載體構(gòu)建策略

圖2　miR-302s 基因打靶載體質(zhì)粒圖譜

1.2.2miR-302s條件性基因打靶載體的線性化將測(cè)序正確的100 μg miR-302s條件性基因打靶載體質(zhì)粒NotⅠ（酶用量： 300 IU） 酶切線性化，酶切體積300 μL，37 ℃消化過(guò)夜。等體積苯酚-三氯甲烷、三氯甲烷處理后，無(wú)水乙醇沉淀，100 μL無(wú)菌PBS重懸備用。

1.2.3ES細(xì)胞打靶及篩選基因打靶所用胚胎干細(xì)胞為來(lái)源于B6/BLU雄性小鼠的ES細(xì)胞。使用線性化的miR-302s基因打靶載體DNA 30 μg進(jìn)行電穿孔轉(zhuǎn)染，電穿孔條件為電壓240 V，電容500 μF；實(shí)際通電時(shí)間9.6 ms，實(shí)際電壓256 V。打靶后克隆用300 μg /mL G418 和 2 μmol /L羥甲基無(wú)環(huán)鳥苷（Gancyclovir）篩選8 d后獲得雙藥抗性ES細(xì)胞。克隆后抽提基因組DNA, 通過(guò)PCR、Southern雜交等方法鑒定2條同源臂并測(cè)序，確定成功同源重組的ES細(xì)胞克隆，以構(gòu)建的重組載體作為陽(yáng)性對(duì)照?？?'或3'臂和插入片段的長(zhǎng)鏈PCR鑒定引物如下。位于同源臂5'臂PCR引物miR-302s-5F1：5'-GTCAGAACCACTGAAATTTTG-3', Neo-5R：5'-GGCTGGACGTAAACTCCTC-3', 目的片段為5.4 kb, PCR 反應(yīng)條件為： 95 ℃ 5 min； 95 ℃ 30 s, 64 ℃ 390 s, 40 個(gè)循環(huán)； 64 ℃ 10 min。位于同源臂3' 臂PCR引物為 ES-2F4： GCATCGCATTGTCTGAGTAGGTG，miR-302s-3R2： CTCTGCTTTAGATCTAGTGG, 目的片段為5.4 kb，PCR 反應(yīng)條件為： 95 ℃ 5 min； 95 ℃30 s，64 ℃ 390 s，40個(gè)循環(huán)； 64 ℃ 10 min。兩套Southern探針（分別位于5'臂外側(cè)和3'臂外側(cè)）引物，miR-302s-P5F： 5'-CTCAGTCATACTCAGAGAAACGGAT-3'，miR-302s-P5R： 5'-AAGGGTCTCACACCATTTAGTCT-3', 產(chǎn)物長(zhǎng)度447 bp, 陽(yáng)性重組ES細(xì)胞的目的條帶7.5 kb； mir-302s-P3F： 5'-GGAACAAGTTACAGACCAAACAGAA-3', mir-302s-P3R： 5'-CACAGAAATGAGAAAA-CTTCCAGAC-3', 產(chǎn)物長(zhǎng)度414 bp, 陽(yáng)性重組ES細(xì)胞的目的條帶5.0 kb。鑒定完畢后選擇狀態(tài)良好的陽(yáng)性細(xì)胞留作受體小鼠（毛色呈現(xiàn)白色）囊胚腔內(nèi)注射。

1.2.4陽(yáng)性ES細(xì)胞顯微注射取4周齡B6（Cg）-Tyr ＜sup＞c-2J＜/sup＞/J雌鼠，48 h間隔注射孕馬血清促性腺激素（PMSG） 10 IU 和人絨毛膜促性腺激素（hCG） 10 IU促排卵。與B6（Cg）-Tyr＜sup＞c-2J＜/ sup＞/J雄鼠合籠后次日早晨檢查陰栓，記為0.5 dpc （day post coitum）。2.5 dpc取胚胎，培養(yǎng)過(guò)夜后用于顯微注射。每個(gè)囊胚腔注射12～15個(gè)ES細(xì)胞。顯微注射后的囊胚培養(yǎng)2 h后移植。

1.2.5基因打靶小鼠的獲得和鑒定嵌合體小鼠出生后，將嵌合率＞50%的成熟雄性小鼠與野生型雌性小鼠進(jìn)行交配，后代小鼠經(jīng)提取尾基因組DNA進(jìn)行PCR鑒定，得到重組雜合子小鼠。

PCR引物為miR-302s-loxptF（P1）： 5'-CCTCCTTTACTTTAACATGGAGG-3'； miR-302s-loxptR（P2）：5'-CTCTACTGAGGAGGAGAAGGAGA-3', 片段長(zhǎng)度為： wt/wt=337 bp, wt/fln=337 bp/379 bp, fln/fln=379 bp；miR-302s-frttF（P3）： 5'-AGGCATATGTTTACA-TTATTTG-3'； Neo-5R（P4）： 5'-GGCTGGACGTAAACTCCTC-3', 片段長(zhǎng)度為： wt/wt=0, wt/fln=0/287 bp, fln/fln=287 bp。miR-302s-frttR（P5）： 5'-AGCTGTTTGAAGATACATCTAC； ZMK-2F4（P6）： 5'-GCATCGCATTGTCTGAGTAGGTG-3', 片段長(zhǎng)度為： wt/wt=0, wt/fln=0/437 bp, fln/fln=437 bp。

每只小鼠均用3套引物檢測(cè), 反應(yīng)條件為： 95 ℃30 s, 58 ℃ 30 s, 72 ℃ 60 s, 40 個(gè)循環(huán)； 72 ℃ 5 min。

圖3　miR-302s打靶載體的PCR驗(yàn)證

2　結(jié)果

2.1miR-302s條件性基因打靶載體鑒定

構(gòu)建的miR-302s打靶載體質(zhì)粒經(jīng)PCR鑒定結(jié)果如圖3所示，PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度379 bp。以31#基因打靶載體質(zhì)粒為模板，經(jīng)ApaLⅠ、ScaⅠ酶切，可以釋放出陽(yáng)性片段miR-302s，鑒定結(jié)果如圖4。

圖4　miR-302s條件性基因打靶載體質(zhì)粒DNA 的ApaL I ScaI酶切鑒定

2.2陽(yáng)性胚胎干細(xì)胞的鑒定

電穿孔轉(zhuǎn)染后得到藥物抗性ES細(xì)胞克隆共93個(gè)，經(jīng)PCR鑒定，其中10個(gè)ES細(xì)胞克?。–4, F4, G4, H4, A5, F5, G6, D8, B9, E10）發(fā)生雙臂同源重組（圖5、6）。

圖5　打靶載體電穿孔轉(zhuǎn)染ES細(xì)胞后5’臂PCR結(jié)果

進(jìn)一步抽提ES細(xì)胞DNA5'臂經(jīng)Bgll1酶切、3'臂經(jīng)EcoRV酶切，經(jīng)過(guò)Southern-blot分析，確定其中6個(gè)ES克隆（G4，H4，A5，F(xiàn)5，G6和B9）為陽(yáng)性（圖7）。

2.3基因打靶小鼠的鑒定

取篩選出的6個(gè)ES陽(yáng)性細(xì)胞克隆中的2個(gè)（G4、F5）進(jìn)行顯微注射, 共注射158枚胚胎, 存活140枚, 注射后的囊胚移植8只ICR受體。受體妊娠7只, 共出生存活小鼠34只, 嵌合體小鼠11只, 其中4只嵌合雄鼠嵌合率＞50%。利用嵌合體小鼠進(jìn)行繁育交配, 已經(jīng)獲得miR-302s-loxp重組雜合子小鼠11只（4#, 6#, 9#, 10#, 11#, 14#, 15#, 16#, 30#, 31#,32#），毛色為黑色，PCR鑒定結(jié)果如圖8。

圖6　打靶載體電轉(zhuǎn)ES細(xì)胞后3’臂PCR結(jié)果

圖7　ES細(xì)胞DNA的Southern分析

圖8　miR-302s基因打靶小鼠PCR檢測(cè)

3　討論

miRNAs廣泛分布于真核細(xì)胞內(nèi)。miRNAs通過(guò)與靶基因互補(bǔ)位點(diǎn)配對(duì)結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄后水平負(fù)性調(diào)控靶基因的表達(dá)，參與生長(zhǎng)發(fā)育、細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞分化等生命過(guò)程。Lin等［8,9］研究表明，miR-302s高表達(dá)于人ES細(xì)胞，隨細(xì)胞的分化其含量迅速減少, miR-302s是維持ES細(xì)胞自我更新和多潛能性的重要因子。當(dāng)人腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)入miR-302s（轉(zhuǎn)入后為mirPS細(xì)胞）, mirPS細(xì)胞不僅表達(dá)ES細(xì)胞的表面標(biāo)志物如Oct3/4、SSEA-3、SSEA-4、Sox2和Nanog等，而且基因組高度去甲基化。最近研究［10, 11］顯示，利用miR-302b轉(zhuǎn)染人成纖維細(xì)胞可以重編程為誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞（iPSCs），提示其在維持干細(xì)胞全能性中的重要作用。本實(shí)驗(yàn)室預(yù)研究表明，miR-302s可能抑制腫瘤細(xì)胞子宮內(nèi)膜癌Ishikawa和HEC-1-B細(xì)胞的增殖和遷移。此外，將Ishikawa細(xì)胞移植至免疫缺陷小鼠顯示miR-302s可抑制腫瘤生長(zhǎng)［12］。作者近期的研究表明，miR-302s可能參與早期胚胎基因組的低甲基化水平的維持（未發(fā)表資料），但其調(diào)節(jié)早期胚胎發(fā)育表觀遺傳的機(jī)制尚不清楚。

基因敲除小鼠是研究基因功能的重要?jiǎng)游锬Ｐ停瑸榱烁玫匮芯縨iR-302s的功能和作用機(jī)制，本研究制備了miR-302s條件性基因打靶小鼠，為進(jìn)一步研究該基因提供了良好的平臺(tái)。本研究中重組載體的構(gòu)建策略是將loxp位點(diǎn)插入到miR-302d和miR-367之間（這段距離為43 bp）的位置，并導(dǎo)入neo基因作為正篩選基因。通過(guò)電穿孔轉(zhuǎn)染和正負(fù)篩選得到陽(yáng)性ES細(xì)胞并經(jīng)顯微注射到B6（Cg）-Tyr＜sup＞c-2J＜/sup＞/J小鼠的囊胚中，再移植到假孕受體小鼠子宮后得到嵌合體小鼠。嵌合體小鼠與野生型小鼠交配獲得miR-302s-LoxP基因打靶小鼠。獲得的miR-302s-LoxP基因打靶小鼠可以與各種Cre小鼠交配，獲得在不同發(fā)育階段、不同組織部位miR-302s缺失的條件性基因敲除小鼠。

在獲得miR-302s-LoxP基因打靶小鼠后，作者已嘗試將其與卵母細(xì)胞特異表達(dá)的Zp3-Cre小鼠交配以獲得miR-302s基因敲除小鼠, 但繁育實(shí)驗(yàn)顯示獲得的陽(yáng)性純合子小鼠在胚胎種植后不久即退化或出生后因腦積水而死亡（未發(fā)表資料）, 提示miR-302s在胚胎植入前后的發(fā)育過(guò)程和腦發(fā)育中可能具有重要作用，有待進(jìn)一步研究。

［1］ Bartel DP. MicroRNAs： genomics, biogenesis, mechanism, and function［J］. Cell, 2004, 116（2）：281-297.

［2］ Barroso-del Jesus A, Lucena-Aguilar G, Menendez P. The miR-302-367 cluster as a potential stemness regulator in ESCs［J］. Cell Cycle, 2009, 8（3）：394-398.

［3］ Rosa A, Spagnoli FM, Brivanlou AH. The miR-430/427/302 family controls mesendodermal fate specification via species-specific target selection［J］. Dev Cell, 2009, 16（4）：517-527.

［4］ Parchem RJ, Moore N, Fish JL, et al. miR-302 is required for timing of neural differentiation, neural tube glosure, and embryonic viability［J］. Cell Rep, 2015, 12（5）：760-773.

［5］ Wade SL, Langer LF, Ward JM, et al. MiRNA-mediated regulation of the SWI/SNF chromatin remodeling complex controls pluripotency and endodermal differentiation in human ESCs［J］. Stem Cells, 2015, 33（10）：2925-2935.

［6］ Lu Y, Loh YH, Li H, et al. Alternative splicing of MBD2 supports self-renewal in human pluripotent stem cells［J］. Cell Stem Cell, 2014, 15（1）：92-101.

［7］ 王宏, 田海濱, 陳娟, 等. Knockout血清替代品可提高C57BL/6J小鼠胚胎干細(xì)胞建系效率［J］. 細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志, 2007, 23（3）：269-276.

［8］ Lin SL, Chang DC, Chang-Lin S, et al. Mir-302 reprograms human skin cancer cells into a pluripotent ES-cell-like state［J］. RNA, 2008, 14（10）：2115-2124.

［9］ Lin SL, Chang DC, Lin CH, et al. Regulation of somatic cell reprogramming through inducible mir-302 expression［J］. Nucleic Acids Res, 2011, 39（3）：1054-1065.

［10］ Subramanyam D, Lamouille S, Judson RL, et al. Multiple targets of miR-302 and miR-372 promote reprogramming of human fibroblasts to induced pluripotent stem cells［J］. Nat Biotechnol, 2011, 29（5）：443-448.

［11］ Hu S, Wilson KD, Ghosh Z, et al. MicroRNA-302 increases reprogramming efficiency via repression of NR2F2［J］. Stem Cells, 2013, 31（2）：259-268.

［12］ Yan GJ, Yu F, Wang B, et al. MicroRNA miR-302 inhibits the tumorigenicity of endometrial cancer cells by suppression of Cyclin D1 and CDK1［J］. Cancer Lett, 2014, 345（1）：39-47.

Generation and Identification of miR-302s Conditional Gene Targeting Mice

YU Fei1, QIAN Li-ping1, DING Li-jun2
（1. Experimental Animal Center； 2. Reproductive Medicine Center， Nangjing Drum Tower Hospital The Affiliated Hospital of Nanjing University Medical School， Nanjing 210008， China）

ObjectiveTo generate microRNA miR-302s gene targeting mice. MethodsThe conditional gene targeting vector were generated by molecular cloning, and then the electroporation of embryonic stem （ES） cells were carried out. The targeted ES cells were screened by positive-negative selection and identified by PCR and Southern blot, and then the correct targeted ES cells were microinjected into blastula of B6（Cg）-Tyr＜sup＞c-2J＜/sup＞/J mice. Chimerical mice were generated after transplantation of the injected blastula into the host mice, and the miR-302s-LoxP gene recombinat mice were obtained after breeding. ResultsEleven miR-302s chimeric mice were obtained including four male chimeras with a higher than 50% chimeric ratio. Eleven miR-302s heterozygous gene recombinat mice were generated after outbred and inbred. ConclusionThe miR-302s conditional gene targeting mice were successfully obtained. This animal model provided the foundation for further study of miR-302s in vivo.

miR-302s； Conditional gene targeting mice； Embryonic stem （ES） cell；Homologous recombination

R-33 Q95-33

A

1674-5817（2016）02-0087-06

10.3969/j.issn.1674-5817.2016.02.002

2015-10-22

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（30900847）, 中央高校苗圃項(xiàng)目 （20620140707）, 南京市衛(wèi)生杰出青年人才項(xiàng)目（JQ2014004）

余飛（1982-）, 女, 碩士, 助理研究員, 主要研究方向： 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)。E-mail： yufei0802@yeah.net

丁利軍（1981-）, 男, 博士, 副研究員, 主要研究方向：生殖醫(yī)學(xué)。E-mail： xmljding@163.com