劉存芳 史　娟 張　強(qiáng)

(陜西理工大學(xué)化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，陜西 漢中　723000)

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橘皮多糖超聲輔助提取工藝優(yōu)化及其抗氧化活性研究

劉存芳 史娟 張強(qiáng)

(陜西理工大學(xué)化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，陜西 漢中723000)

以橘皮為原料，脫除脂溶性物質(zhì)后采用超聲波輔助法提取其中的水溶性多糖，以提取溫度、提取時(shí)間、提取功率、料液比為自變量，多糖提取率為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)進(jìn)行優(yōu)化，確定最佳提取工藝條件。并利用Fenton反應(yīng)測(cè)試橘皮多糖的抗氧化活性。結(jié)果表明：在提取溫度70 ℃、提取時(shí)間50 min、超聲波功率280 W、料液比1∶25(g/mL)的條件下橘皮多糖的提取率可高達(dá)28.86%，提取效果顯著。體外抗氧化試驗(yàn)表明，橘皮多糖對(duì)羥基自由基具有清除作用且存在量效關(guān)系。

橘皮；多糖；超聲波；提??；抗氧化

橘皮是蕓香科(Rutaceae)植物橘子的果皮，中藥上稱為陳皮[1]，可食藥兩用，具有健脾開胃、理氣寬中、降逆止嘔、燥濕行氣、止咳化痰等功效[2-4]。橘皮中含有果膠[2]、黃酮[3]、揮發(fā)油[4-5]、色素、礦物元素、多糖等多種活性物質(zhì)[6]，其中多糖含量較為可觀。活性多糖是醛糖或酮糖以糖甙鍵由20多個(gè)以上單糖鍵合起來的大分子聚合物，存在于植物、動(dòng)物以及微生物細(xì)胞壁中，其中植物性多糖一般有抑制纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和脂多糖誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)的作用[6]，能預(yù)防腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，可調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力，有抗凝血、抗病毒、抗氧化、抗腫瘤等生物活性[7]。目前關(guān)于植物性多糖提取方法及抗氧化活性的研究報(bào)道[7-8]較多，橘皮多糖提取方法有水浴加熱法[9]、微波輔助法[10]、星點(diǎn)設(shè)計(jì)—效應(yīng)面法[11]等，水浴加熱法一般需2 h或更長(zhǎng)提取時(shí)間，微波輔助法只需10～20 min，但微波輔助法不易形成規(guī)?；a(chǎn)，超聲輔助提取法有耗時(shí)較少、設(shè)備簡(jiǎn)單、操作方便等特點(diǎn)，且超聲輔助提取橘皮多糖的研究報(bào)道還尚少。超聲輔助提取橘皮多糖可節(jié)能降耗，克服提取過程中時(shí)間長(zhǎng)、加熱溫度高的不足，對(duì)超聲輔助提取橘皮多糖的工藝進(jìn)行優(yōu)化，探索規(guī)?；a(chǎn)的提取技術(shù)。

本研究擬采用超聲波輔助提取橘皮中的多糖，用正交試驗(yàn)優(yōu)化橘皮多糖的提取工藝，并測(cè)試橘皮多糖體外羥基自由基清除效果，旨在為橘皮的綜合利用以及橘皮多糖的開發(fā)提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

橘皮：在2013年10月下旬收集于陜西南部秦巴山區(qū)，由陜西理工學(xué)院植物學(xué)分類專家趙樺教授鑒定，確認(rèn)為成熟橘子(CitrusreticulateBlanco)的外皮，經(jīng)低溫下烘干，粉碎、過篩，密封保存?zhèn)溆茫?/p>

濃硫酸、葡萄糖、苯酚、乙醚、無水乙醇、正丁醇、鄰二氮菲、丙酮、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、硫酸亞鐵、過氧化氫(30%)等：分析純，西安化學(xué)試劑廠；

超純水：二次蒸餾水，自制；

0.15 mol/L pH 7.4的PBS緩沖液配制：準(zhǔn)確稱取磷酸氫二鈉(含結(jié)晶水)7.164 g和磷酸二氫鈉(含結(jié)晶水)3.121 g，分別定容于100 mL容量瓶中，吸取磷酸氫二鈉81.0 mL和磷酸二氫鈉19.0 mL，定容于150 mL的容量瓶中，備用。

1.2主要儀器設(shè)備

紫外可見分光光度計(jì)：UV-6300PC型，上海美譜達(dá)有限公司；

超聲波清洗機(jī)：SB-4200DTD型，寧波新芝生物科技有限公司；

恒溫水浴鍋：HH型，河北省黃驊市渤海電器廠；

循環(huán)水式多用真空泵：SHB-III型，鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；

電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：DHG-9070A型，上海祁欣科學(xué)儀器有限公司；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：RE2000E型，上?？粕齼x器有限公司；

中草藥粉碎機(jī)：FW177型，天津市泰斯特儀器有限公司；

電子天平：BSA224S-CW型，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；

索氏提取器：200～500 mL，天津化玻儀器廠。

1.3方法

1.3.1橘皮脫除脂溶性物質(zhì)準(zhǔn)確稱取橘皮粉末，以乙醚為溶劑在索氏提取器中回流提取至無色，蒸餾回收乙醚，再換用體積比為95.5%的乙醇回流提取8 h，蒸餾回收乙醇，以脫除橘皮中的脂溶性物質(zhì)。

1.3.2葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作精確稱取250.00 mg葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品定容于50 mL容量瓶中，移取1 mL 5 mg/mL 的葡萄糖溶液到另一個(gè)50 mL 容量瓶中，加水稀釋至刻度配成0.1 mg/mL 的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。準(zhǔn)確量取0.0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4 mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液于各比色管中，分別加蒸餾水補(bǔ)足2.0 mL，各加入5.0%苯酚溶液1 mL和濃硫酸5 mL搖勻，沸水浴15 min，取出后迅速冷卻至室溫，在波長(zhǎng)490 nm處測(cè)定各吸光度，用空白試劑作參比。

1.3.3橘皮多糖的提取和測(cè)定將索氏提取后的橘皮粉末，以水為提取溶劑，在不同提取溫度、提取時(shí)間、提取功率、料液比條件下從橘皮粉末提取多糖，重復(fù)提取兩次，合并提取液，經(jīng)過濾，脫色，定容，用苯酚硫酸比色法測(cè)定橘皮多糖的含量[7]。

1.3.4橘皮多糖提取的單因素試驗(yàn)及正交試驗(yàn)

(1) 提取時(shí)間：在超聲波功率280 W，料液比1∶20(g/mL)，提取溫度70 ℃時(shí)，提取時(shí)間分別為30，40，50，60，70 min條件下，測(cè)定橘皮多糖提取率。

(2) 提取溫度：在料液比1∶20(g/mL)，提取時(shí)間50 min，超聲波功率280 W時(shí)，提取溫度為40，50，60，70，80 ℃條件下，測(cè)定橘皮多糖提取率。

(3) 超聲波功率：在料液比1∶20(g/mL)，提取時(shí)間50 min，提取溫度70 ℃時(shí)，超聲波功率為160，220，280，340，400 W條件下，測(cè)定橘皮多糖提取率。

(4) 料液比：在提取時(shí)間50 min，提取溫度70 ℃，超聲波功率280 W時(shí)，料液比為1∶10，1∶20，1∶30，1∶40，1∶50(g/mL)條件下，測(cè)定橘皮多糖提取率。

(5) 正交試驗(yàn)：在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上以提取溫度、料液比、提取時(shí)間、超聲波功率為試驗(yàn)因素，以橘皮多糖提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，設(shè)計(jì)L9(34)正交試驗(yàn)優(yōu)化橘皮多糖的提取工藝條件。

1.3.5橘皮多糖的精制及抗氧化活性測(cè)試在優(yōu)化的橘皮多糖提取工藝條件下，提取橘皮粗多糖，用Sevage 法除蛋白質(zhì)后再加入體積5～6倍的無水乙醇，多糖呈絮狀沉淀析出，靜置12 h后，高速離心(3 500 r / min，40 s)傾倒出乙醇，用無水乙醇、丙酮依次洗滌沉淀3次，得到橘皮精制多糖，低溫下干燥。用Fenton反應(yīng)檢測(cè)橘皮多糖的抗氧化活性，過氧化氫在亞鐵離子作用下有氧化多種有機(jī)物的能力，過氧化氫與亞鐵離子的溶液即為Fenton試劑，其中亞鐵離子為同質(zhì)催化劑，過氧化氫起氧化作用。準(zhǔn)確稱取50.00 mg橘皮精制多糖在25 mL容量瓶中定容，配成2 mg/mL多糖待測(cè)液，取8支15 mL比色管，編號(hào)，分別加入1 .0 mL 0.75 mmol/L鄰二氮菲，1.5 mL pH為7.4的PBS緩沖液和1.0 mL 0.75 mmol/L的硫酸亞鐵溶液，混合均勻，向6支比色管中分別加入0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6 mL多糖待測(cè)液，充分搖勻后，加入1 mL新配置的0.01%的過氧化氫溶液；另2支比色管中一個(gè)為損傷管，一個(gè)為未損傷管，不加多糖待測(cè)液，在損傷管中加入1 mL新配置的0.01%的過氧化氫溶液，未損傷管不加過氧化氫溶液，用超純水將8支比色管的溶液體積補(bǔ)至15 mL，搖勻，置于37 ℃恒溫水浴中保溫60 min，用紫外可見分光光度計(jì)在波長(zhǎng)λ=510 nm處，測(cè)量各溶液的吸光度A。羥基自由基的清除率按式(1)計(jì)算：

(1)

式中：

I——清除率，%；

A2——橘皮多糖溶液的吸光度；

A1——未損傷溶液的吸光度；

A0——損傷溶液的吸光度。

2　結(jié)果與分析

2.1葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

以葡萄糖為對(duì)照品，苯酚硫酸法測(cè)定含量，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖1，曲線方程為Y=7.442 9X+0.009 3(R2=0.999)，線性關(guān)系良好。

2.2橘皮多糖提取的單因素試驗(yàn)

2.2.1提取時(shí)間對(duì)橘皮多糖提取率的影響由圖2可知，在30～50 min時(shí)多糖提取率隨著時(shí)間增加而增加，這是因?yàn)殡S著超聲波時(shí)間的增加，橘皮粉末內(nèi)的多糖充分溶出。在50～70 min時(shí)多糖提取率隨時(shí)間增加而減少，可能是長(zhǎng)時(shí)間的超聲波和加熱會(huì)使部分多糖鏈斷裂造成損失從而影響橘皮多糖提取率。因此最佳提取時(shí)間應(yīng)選擇50 min。

2.2.2提取溫度對(duì)橘皮多糖提取率的影響由圖3可知，在40～60 ℃時(shí)橘皮多糖提取率隨著溫度的升高而升高，到達(dá)70 ℃后，橘皮多糖提取率開始下降?？赡苁菧囟壬呒铀偃軇┓肿拥倪\(yùn)動(dòng)速度，橘皮粉末變形和軟化，使橘皮多糖從橘皮細(xì)胞壁中脫離出來，當(dāng)溫度超過70 ℃后在溫度和超聲波雙重作用下，出現(xiàn)多糖的熱不穩(wěn)定性和降解現(xiàn)象，使橘皮多糖的提取率下降。因此最佳提取溫度選擇70 ℃。

圖1　葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖2　提取時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響

圖3　提取溫度對(duì)多糖提取率的影響

2.2.3超聲波功率對(duì)橘皮多糖提取率的影響由圖4可知，超聲波功率為160～280 W時(shí)橘皮多糖的提取率逐漸升高，當(dāng)超聲波功率超過280 W時(shí)多糖提取率開始下降，可能是當(dāng)超聲波功率較小時(shí)，空化作用小，對(duì)多糖溶入溶劑中的速率影響小，提取率低，隨著超聲波功率的增大，超聲波空化作用也隨之加強(qiáng)，加速了多糖溶入溶劑；當(dāng)超聲波功率過大時(shí)，超聲作用可能使局部升溫過熱而破壞多糖分子結(jié)構(gòu)，從而降低多糖提取率。因此選擇超聲功率為280 W。

圖4　超聲波功率對(duì)多糖提取率的影響

2.2.4料液比對(duì)橘皮多糖提取率的影響由圖5可知，當(dāng)料液比為1∶20 (g/mL)時(shí)，多糖提取率最大，而料液比超過1∶30 (g/mL)后，多糖的提取率降低。溶劑較少時(shí)，多糖擴(kuò)散阻力較大，多糖的溶出率小，隨著溶劑用量的增加，橘皮中多糖更容易溶入溶劑中，多糖提取率隨之增加；當(dāng)溶劑用量過大時(shí)，溶劑會(huì)損耗過多的超聲波能量，不利于多糖溶出，而且不利于后續(xù)的減壓濃縮，增加提取成本。因此選擇料液比為1∶20 (g/mL)。

圖5　料液比對(duì)多糖提取率的影響

2.3正交試驗(yàn)優(yōu)化橘皮多糖提取工藝

結(jié)合單因素最佳條件設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)因素水平表L9(34) (見表1)。以橘皮多糖提取率為考察指標(biāo)進(jìn)行極差和均值分析確定超聲波輔助熱浸提橘皮多糖的最佳提取工藝見表2。由表2可知，影響橘皮多糖提取工藝的因素為：提取溫度>料液比>超聲波功率>提取時(shí)間，最佳提取工藝為提取溫度70 ℃、料液比1∶25(g/mL)、超聲波功率280 W、提取時(shí)間50 min。

經(jīng)3次平行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，在提取溫度70 ℃、提取時(shí)間50 min、超聲波功率280 W、料液比1∶25(g/mL)的條件下提取橘皮多糖，橘皮多糖提取率可高達(dá)28.86%。該工藝條件符合實(shí)際生產(chǎn)，提取中料液比取值偏小，可減少長(zhǎng)時(shí)間加熱溶劑蒸發(fā)的影響。

表1　正交試驗(yàn)因素水平表L9 (34)

表2　正交試驗(yàn)結(jié)果

2.4橘皮多糖的抗氧化活性

用Fenton反應(yīng)體系來測(cè)試橘皮多糖清除羥基自由基的作用，考察其抗氧化活性效果。由圖6可知，橘皮多糖對(duì)亞鐵—過氧化氫體系經(jīng)Fenton反應(yīng)產(chǎn)生的羥基自由基有明顯的清除作用，且隨著多糖濃度的增加清除作用增強(qiáng)。說明橘皮多糖具有抗氧化活性。

3　結(jié)論

用超聲波輔助法提取橘子皮多糖，考察了提取溫度、提取時(shí)間、超聲波功率、料液比等單因素試驗(yàn)，并設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)得到了最佳工藝條件：提取溫度70 ℃、提取時(shí)間50 min、超聲波功率280 W、料液比1∶25(g/mL)，在該條件下橘皮多糖的提取率可高達(dá)28.86%，與水浴加熱法[9]相比提取率顯著提高，能省工省時(shí)，提取時(shí)料液比稍偏小可避免溶劑蒸發(fā)的影響，在多糖提取生產(chǎn)中有參考價(jià)值。橘皮多糖對(duì)Fenton反應(yīng)產(chǎn)生羥基自由基有明顯的清除作用，說明橘皮多糖有抗氧化活性，但橘皮多糖的結(jié)構(gòu)、構(gòu)效關(guān)系以及其他生理活性有待進(jìn)一步研究。

圖6　橘皮多糖清除羥自由基的作用

Figure 6Clearing hydroxy free base with the polysaccharide ofCitrusreticulatepeel

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Study on ultrasonic extraction and anti-oxidation activity of polysaccharide obtained from Citrus reticulate peel

LIU Cun-fangSHIJuanZHANGQiang

(SchoolofChemical&EnvironmentalSciences,ShaanxiUniversityofTechnology,Hanzhong,Shaanxi723000,China)

The extraction process ofCitrusreticulatepeel polysaccharide was studied by single factor experiment which controlled extraction temperature, extraction time, ultrasonic power and liquid ratio. The orthogonal experiment was texted and based on single factor experiments, then determined the best extraction process by experimental data. The oxidation resistance ofCitrusreticulatepeel polysaccharide was determined by Fenton reaction. The results showed that the extraction rate ofCitrusreticulatepeel polysaccharide could reach 28.86% when the extraction temperature was 70 ℃, extraction time 50 min, ultrasonic power 280 W, solid-liquid ratio 1∶25(g/mL). The hydroxyl radicals were cleared byCitrusreticulatepeel polysaccharide which showedCitrusreticulatepeel polysaccharide had oxidation resistance, then Polysaccharides and hydroxyl free radical clearance existed concentration-response relationship.

Citrusreticulatepeel; polysaccharide; ultrasonic； extraction; anti-oxidant activity

陜西省科技廳社會(huì)發(fā)展科技攻關(guān)項(xiàng)目(編號(hào)：2015SF270)；陜西省教育廳服務(wù)地方專項(xiàng)項(xiàng)目(編號(hào)：15JF013)

劉存芳(1971—)，女，陜西理工學(xué)院副教授，碩士生導(dǎo)師。E-mail：liucf@snut.edu.cn

2015—12—26

10.13652/j.issn.1003-5788.2016.08.036