嚴　鑫 王　委 劉　量

(揚州大學(xué)醫(yī)學(xué)院, 江蘇 揚州　225009)

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綬草萃取物體外抗氧化活性及其總酚含量比較

嚴鑫 王委 劉量

(揚州大學(xué)醫(yī)學(xué)院, 江蘇 揚州225009)

采用DPPH法、ABTS法測定綬草不同有機溶劑萃取物的體外抗氧化活性，并用福林酚法測定其總酚含量。結(jié)果表明：綬草各溶劑萃取物均有明顯的體外抗氧化活性，且呈劑量依賴性；各溶劑萃取物的抗氧化活性強弱及總酚含量大小順序均為：乙酸乙酯萃取物>正丁醇萃取物>石油醚萃取物。說明綬草不同萃取物體外抗氧化活性與總酚含量呈正相關(guān)，其中乙酸乙酯萃取物的清除DPPH·及ABTS+·的IC50值分別為(45.270±0.005)，(75.420±0.015) μg/mL，總酚含量為(13.861±0.002)%。

綬草；萃取物；抗氧化活性；總酚

綬草(Spiranthessinensis(Pers.)Ames)為蘭科綬草屬植物，又名盤龍參、盤龍草、清明草等，生于草叢、濕草地或山坡中，中國各地均有分布[1-2]。綬草為藥食同源植物，常用來制作藥膳，具有滋補強身的作用[3]。綬草還是涼茶植物，用來制作夏季的消暑飲品，具有滋陰清熱，化痰止咳的功效[4]。已有報道[5-7]顯示綬草主要成分為包括二氫菲類、黃酮類、苯丙素類等在內(nèi)的酚類成分，具有開發(fā)抗氧化劑的前景。但綬草不同萃取物抗氧化活性和總酚含量是否有差異還未見報道。

本研究擬采用DPPH法、ABTS法測定綬草各有機溶劑萃取物的抗氧化活性，采用福林酚法測定各萃取物的總酚含量，并比較兩者的相關(guān)性，旨在為綬草后續(xù)化學(xué)成分的深入研究及抗氧化劑開發(fā)提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1試驗原料

綬草：采購于安徽毫州，由揚州大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院金銀根教授鑒定為蘭科綬草屬植物綬草S.sinensis，藥用部位為帶根全草。

1.1.2試劑

水溶性VE(Trolox)：純度97%，美國Sigma-Aldrich公司；

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)：純度99%，美國Sigma-Aldrich公司；

2,2-聯(lián)氮-雙-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)：純度98%，美國Sigma-Aldrich公司；

福林酚試液(Folin-Ciocalteu)：1 mol/L，合肥博美生物公司；

沒食子酸對照品：純度98%，上海金穗生物科技有限公司；

甲醇、無水乙醇、碳酸鈉、二甲亞砜(DMSO)：分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.1.3主要儀器設(shè)備

萬分之一電子天平：BS124S型，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；

高速萬能粉碎機：FW80型，天津市泰斯特有限公司；

循環(huán)水式真空泵：SHZ-D(III)型，鞏義市予華儀器有限責任公司；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：RE-3000型，上海亞榮生化儀器廠；

數(shù)顯恒溫水浴鍋：HH-4型，上海江星儀器有限公司；

數(shù)控超聲波清洗器：KQ-500DE型，昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司；

多功能酶標儀：Synergy2型，美國博騰儀器有限公司；

紫外可見紅外分光光度計：U-3900型，日本日立公司；

紫外可見分光光度計：UV-9600型，北京瑞利分析儀器公司。

1.2試驗方法

1.2.1原料處理綬草干燥帶根全草650 g，粉碎，用95%乙醇于85 ℃下回流提取2 h，重復(fù)提取5次，減壓濃縮得總浸膏。將總浸膏自然揮干至無醇味，加入10倍蒸餾水分散，再分別用等體積石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，分別得石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取物，減壓濃縮并揮干試劑得相應(yīng)的粉末，備用。

1.2.2抗氧化活性試驗溶液配制

(1) DPPH溶液配制：精密稱取DPPH試劑40.0 mg，無水乙醇定容于100 mL容量瓶中，再從中吸取20 mL定容于100 mL的容量瓶中，備用。

(2) ABTS溶液配制：精密稱取ABTS試劑200.0 mg，用蒸餾水定容于50 mL容量瓶中，再精密稱取35.0 mg過硫酸鉀，用蒸餾水定容于50 mL容量瓶中，搖勻后與ABTS水溶液混合，在室溫黑暗處反應(yīng)12～16 h，產(chǎn)生ABTS陽離子自由基。從中吸取20 mL再定容于100 mL的容量瓶中，備用。

(3) 待測樣品和陽性對照溶液配制：精密稱取綬草3個萃取物粉末及水溶性VE各20.0 mg，用1 mL DMSO溶解，再加無水乙醇將樣品稀釋成終濃度為1.000，0.500，0.400，0.200，0.100，0.050，0.025 mg/mL的溶液，備用。

1.2.3抗氧化活性測定

(1) DPPH自由基清除：DPPH是以氮原子為中心的一種穩(wěn)定自由基，有強氧化性，易被抗氧化劑還原[8]。往DPPH溶液中加入抗氧化劑時，由于其自由基的清除作用，DPPH溶液顏色消退，使得吸收光譜強度隨加入的抗氧化劑的量的增加而減小，通過加入抗氧化劑前后吸光度的線性變化來計算自由基清除率[9-10]。

在96孔板中加入準備好的樣品溶液100 μL，每個樣品平行做3個，于517 nm紫外下測定吸光度Aj，再向其中加入DPPH試劑100 μL，37 ℃遮光放置反應(yīng)30 min后，測量吸光度Ai?？瞻讓φ?溶解樣品的試劑)與陽性對照測定方法相同，且需同批次測定并每批次測定一次，分別記錄。根據(jù)式(1)計算清除率：

(1)

式中：

SR——DPPH自由基清除率，%；

Ai——加入DPPH后樣品或陽性對照的吸光度；

Aj——未加入DPPH時樣品或陽性對照的吸光度；

Ac——加入DPPH后空白對照的吸光度。

由于中藥樣品在高濃度時本身具有顏色，DPPH自由基清除后顏色也為黃色，會對試驗結(jié)果產(chǎn)生一定影響，故計算中需要扣除樣品背景影響即Aj，以保證試驗結(jié)果的準確性。

(2) ABTS自由基清除：ABTS法是以ABTS為顯色劑，經(jīng)活性氧氧化后生成陽離子自由基ABTS+·，呈穩(wěn)定的藍綠色溶液；若向其中加入抗氧化物質(zhì)，則會與ABTS+·反應(yīng)而使反應(yīng)體系褪色，在734 nm處檢測溶液吸光度，以此來衡量該物質(zhì)的抗氧化能力[11]。

在96孔板的各個孔中加入準備好的樣品溶液100 μL，每個樣品平行做3個，再往里加入ABTS試劑100 μL，常溫反應(yīng)5 min后，于734 nm紫外下測定吸光度As。由于ABTS+·清除后顏色為無色，對試驗結(jié)果幾乎無影響，故此時不需要測樣品本身吸光度。根據(jù)式(2)計算清除率：

(2)

式中：

SR——ABTS自由基清除，%；

Ac——加入ABTS+·后空白對照的吸光度；

As——加入ABTS+·后樣品或陽性對照的吸光度。

1.2.4多酚含量測定溶液配制采用福林酚法。參照文獻[12]，修改如下：各稱取一定量的綬草萃取物溶于甲醇中，超聲輔助溶解，并用0.22 μm微孔濾膜過濾溶解液，得供試品溶液。

(1) 對照品溶液的配制：精密稱取沒食子酸10.0 mg，置250 mL量瓶中，以適量甲醇溶解，定容，精密量取50 mL，采用倍半稀釋法依次配制成質(zhì)量濃度為40，20，10，5，2.5，1.25，0.625，0.312 5 μg/mL的沒食子酸甲醇溶液備用。

(2) 樣品溶液的配制：精密稱取綬草3個萃取物各10.0 mg，置于100 mL量瓶中，用甲醇溶解并配制成質(zhì)量濃度分別為0.1 mg/mL的樣品溶液。

1.2.5測定條件的優(yōu)化及方法學(xué)考察

(1) 測定波長的選擇：取適量沒食子酸標準溶液于容量瓶中，加入10%福林酚試劑2.5 mL，再加入20%碳酸鈉溶液150 μL，30 ℃下反應(yīng)一段時間，在500～900 nm波長范圍內(nèi)測定吸光度。

(2) 穩(wěn)定性試驗：取適量沒食子酸標準品，于上述條件下操作，在最佳檢測波長處測定反應(yīng)后不同時間點(0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5，4.0 h)的吸光度。

(3) 精密度試驗：精確吸取2.5 mL的對照品溶液，在最佳檢測波長處測定其吸光度，重復(fù)6次，計算變異系數(shù)(RSD)，評價該方法的精密度。

(4) 重復(fù)性試驗：稱取綬草乙醇總提取物適量，按供試品溶液的配制方法，平行配制6份供試品溶液，于上述條件下操作，在最佳檢測波長處測定吸光度。

(5) 加樣回收率試驗：分別稱取綬草乙醇總提取物6份，每份精確加入一定量的沒食子酸溶液，按上述條件操作，在最佳檢測波長處測定吸光度，計算沒食子酸回收率。

1.2.6標準曲線的建立精密量取各濃度沒食子酸對照品溶液適量，按1.2.5優(yōu)化的條件操作，在最佳檢測波長處測定吸光度，以沒食子酸溶液濃度(μg/mL)為橫坐標，吸光度為縱坐標，按濃度與吸光度相關(guān)關(guān)系求回歸方程。

1.2.7樣品總酚含量的測定精密量取樣品溶液2.5 mL，按1.2.5優(yōu)化的條件操作，在最佳檢測波長處測定吸光度，重復(fù)3次，再根據(jù)標準曲線，計算出樣品溶液中總酚含量。

1.2.8數(shù)據(jù)分析采用SPSS 16.0、Microsoft Excel 2013進行數(shù)據(jù)處理，并運用GraphPad Prism 5 繪制圖表，計算IC50值。

2　結(jié)果與討論

2.1抗氧化活性測定

本試驗以水溶性VE(Trolox)為陽性對照，分析綬草乙醇提取物各萃取物對DPPH、ABTS自由基的清除能力，以IC50值評價其抗氧化活性，IC50值越小，其抗氧化活性越強。由圖1、2可知，綬草的石油醚、乙酸乙酯及正丁醇萃取物均具有清除DPPH和ABTS自由基的能力。各萃取物在濃度0.025～1.000 mg/mL時，清除DPPH及ABTS自由基的能力隨濃度增加而增大；在相同濃度下，各萃取物清除DPPH自由基的能力較ABTS自由基強。

圖1　綬草不同萃取物對DPPH自由基的清除能力

圖2　綬草不同萃取物對ABTS自由基的清除能力

由表1可知，乙酸乙酯萃取物清除兩種自由基的IC50值最低，其次為正丁醇萃取物，石油醚萃取物IC50值最大，表明綬草不同萃取物體外氧化活性由強到弱依次為：乙酸乙酯萃取物>正丁醇萃取物>石油醚萃取物。乙酸乙酯萃取物抗氧化活性略弱于陽性對照VE。

表1　綬草不同萃取物抗氧化活性

2.2多酚含量的測定

2.2.1測定波長的選擇由圖3可知，在500～900 nm波長范圍內(nèi)，沒食子酸的最大吸收波長為765 nm，因此選定765 nm作為檢測波長。

2.2.2穩(wěn)定性試驗由圖4可知，溶液在2 h后吸光度基本維持穩(wěn)定，考慮到試驗的效率，選擇反應(yīng)2 h后測定溶液的吸光度。

圖3　沒食子酸紫外吸收光譜圖

圖4　反應(yīng)時間對吸光度的影響

2.2.3精密度試驗按1.2.5的條件操作，在765 nm波長下，對福林酚法測定一定濃度的沒食子酸對照品溶液進行精密度試驗，重復(fù)6次，求得吸光度平均值為0.125，RSD為0.53%，表明儀器精密度良好。

2.2.4重復(fù)性試驗重復(fù)6次測定一定量綬草乙醇提取物中多酚的含量，求得平均含量為6.83%，RSD為0.79%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.5加樣回收率試驗由表2可知，用福林酚法測得沒食子酸的加樣回收率為95.05%～108.91%，平均回收率為100.99%，RSD為6.23%，上述試驗結(jié)果說明該方法具有較高的準確性，可用于綬草不同萃取物多酚含量的測定。

表2　沒食子酸加樣回收率結(jié)果

2.3標準曲線的建立

根據(jù)不同濃度的沒食子酸在765 nm波長下測定的吸光度，繪制標準曲線(見圖5)，得到線性回歸方程為Y=0.048 7x+0.010 3，相關(guān)系數(shù)(r)為0.999 8。表明沒食子酸標準品溶液在0.312 5～40.000 0 μg/mL范圍內(nèi)與吸光度呈良好的線性關(guān)系。

圖5　沒食子酸濃度與吸光度的標準曲線

2.4綬草不同萃取物總酚含量測定

用上述建立的方法，測定綬草3個不同萃取物的總酚含量。由圖6可知，總酚含量分別為石油醚萃取物(5.67±0.005)%，乙酸乙酯萃取物(13.861±0.002)%；正丁醇萃取物(13.717±0.002)%。說明乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物總酚含量相當，都高于石油醚萃取物；三者總酚含量由高到低依次為：乙酸乙酯萃取物>正丁醇萃取物>石油醚萃取物。結(jié)合2.1抗氧化活性結(jié)果，表明綬草不同萃取物抗氧化活性與總酚含量呈正相關(guān)。

圖6　綬草不同萃取物總酚含量

3　結(jié)論

本研究通過DPPH法、ABTS法評價了綬草不同萃取物體外抗氧化活性；建立了綬草不同萃取物總酚含量的測定方法，并經(jīng)過了方法學(xué)考察。結(jié)果表明，綬草不同萃取物體外抗氧化活性與總酚含量呈正相關(guān)?；谇叭薣5-7]關(guān)于綬草化學(xué)成分的研究結(jié)果，推測綬草乙酸乙酯萃取物總酚含量較高、抗氧化活性較強可能與其中含有較多的菲類、黃酮類等酚類成分有關(guān)。提示在后續(xù)進行化學(xué)成分研究時，可將重點鎖定在乙酸乙酯萃取物；通過活性導(dǎo)向分離的方法，實現(xiàn)該萃取物中抗氧化成分的快速靶向分離，并通過對分離所得單體成分的抗氧化活性評價，進一步闡明綬草抗氧化物質(zhì)基礎(chǔ)，為從綬草中尋找天然來源的抗氧化劑的深入研究提供一定的理論依據(jù)。

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Comparisons of antioxidant activities and contents of total phenols of different extraction parts from Spiranthes sinensis

YAN XinWANGWeiLIULiang

(SchoolofMedicine,YangzhouUniversity,Yangzhou,Jiangsu225009,China)

Theinvitroantioxidant activities of different extractions ofSpiranthessinensis(Pers.)Ames were evaluated through DPPH and ABTS assays, and the total phenols contents were determined by Folin-Ciocalteu method. It was shown that all the different extraction parts ofS.sinensishad significantinvitroantioxidant activities in a dose-dependent manner; The antioxidant activities and total phenols contents were both ordered as follows: ethyl acetate extraction>n-butanol extraction> petroleum ether extraction. The results showed that theinvitroantioxidant activities were positively correlated with the total phenols contents of different extraction parts ofS.sinensis, theIC50values of scavenging DPPH· and ABTS+· of ethyl acetate extraction part were (45.270±0.005) and (75.420±0.015) μg/mL, respectively, its total phenols content was (13.861±0.002)%.

Spiranthessinensis(Pers.)Ames; extraction; antioxidant activity; total phenols content

揚州市自然科學(xué)基金青年科技人才項目(編號：YZ2014022)；揚州大學(xué)大學(xué)生學(xué)術(shù)科技創(chuàng)新基金項目(編號：x2016790)

嚴鑫，男，揚州大學(xué)醫(yī)學(xué)院在讀碩士研究生。

劉量(1980-)，女，揚州大學(xué)醫(yī)學(xué)院講師，博士。

E-mail: enjoyyz@163.com

2015-12-15

10.13652/j.issn.1003-5788.2016.08.035