張孝林吳研祥陸　帆何培培

(1. 安徽科技學(xué)院食品藥品學(xué)院，安徽 鳳陽　233100；2. 農(nóng)業(yè)部生物有機(jī)肥創(chuàng)制重點(diǎn)實驗室，安徽 蚌埠　233030)

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苦瓜水提物抗幽門螺桿菌作用及其浸提工藝研究

張孝林1,2吳研祥1陸帆1何培培1

(1. 安徽科技學(xué)院食品藥品學(xué)院，安徽 鳳陽233100；2. 農(nóng)業(yè)部生物有機(jī)肥創(chuàng)制重點(diǎn)實驗室，安徽 蚌埠233030)

為研究苦瓜水提物對幽門螺桿菌的抑制作用，以紙片擴(kuò)散法的抑菌圈大小為指標(biāo)，設(shè)計正交試驗優(yōu)化苦瓜水提物抗幽門螺桿菌活性的最佳浸提工藝，并進(jìn)一步探究苦瓜水提物的最小抑菌濃度(MIC)、最小殺菌濃度(MBC)和殺菌動力學(xué)。結(jié)果表明：苦瓜水提物抗幽門螺桿菌的最佳浸提工藝為浸提溫度80 ℃、料液比1∶50(g/mL)、浸提時間1.5 h。MIC為32 mg/mL；MBC為128 mg/mL；在4倍MIC下殺菌動力學(xué)時間為30 min。

苦瓜；水提物；幽門螺桿菌；抗菌

幽門螺桿菌(Helicobacterpylori, Hp)是一種廣泛定植于人胃中的微需氧革蘭氏陰性桿菌。世界上有50%以上的人被其感染,研究[1-2]證實幽門螺桿菌感染與慢性胃炎、胃潰瘍、十二指腸潰瘍和胃癌的高發(fā)率密切相關(guān)。目前臨床上治療幽門螺桿菌主要方法有三聯(lián)或四聯(lián)療法即2種或3種抗生素結(jié)合1種質(zhì)子泵抑制劑或鉍劑。因胃環(huán)境的特殊性及胃的排空導(dǎo)致幽門螺桿菌治療用藥量大、療程長、成本高、副作用大，致使病人依從性差，部分病人未達(dá)到完整的療程就停止服藥，另外，幽門螺桿菌對使用的抗生素易產(chǎn)生耐藥性，甚至出現(xiàn)了對6種抗生素的耐藥菌株[3]，幽門螺桿菌還容易重新感染。因此，根治幽門螺桿菌感染已成為醫(yī)學(xué)難題。中藥復(fù)方制劑治療幽門螺桿菌雖然具有很好的療效，但其成分不清、療程長、服用不便且成本較西藥更高。

苦瓜(MomordicacharantiaL.)是一種藥食兩用植物，其提取物具有廣譜抗菌活性[4]，對革蘭氏陽性桿菌、球菌具有抑制作用，同時對革蘭氏陰性桿菌也具有較強(qiáng)的抑制效果。但目前還未見關(guān)于苦瓜提取物抗幽門螺桿菌的報道。

苦瓜的提取物抗菌活性與提取溶劑相關(guān)，張雅靜等[5]研究苦瓜不同溶劑提取物對金黃色葡萄球菌、枯草桿菌和大腸桿菌的抑菌效果時發(fā)現(xiàn)，苦瓜水提物對金黃色葡萄球菌的抑菌效果最強(qiáng)，70%乙醇的提取物對枯草桿菌的抑菌效果最強(qiáng)，乙酸乙酯的提取物對大腸桿菌的抑菌效果最強(qiáng)。其他研究證實苦瓜含有多種抑菌物質(zhì)，包括苦瓜黃酮[6]、苦瓜皂苷[7-8]、苦瓜多糖[8-9]、苦瓜多酚[10]、苦瓜精油[11]和苦瓜蛋白[12-13]等活性成分。本研究采用水作為提取溶劑探究苦瓜提取物抗幽門螺桿菌活性。研究[14]證實苦瓜水提物的抗菌活性與浸提溫度、浸提時間和料液比有一定關(guān)系。本研究擬采用正交試驗，以紙片法抑菌圈大小為指標(biāo)，研究苦瓜水提物抗幽門螺桿菌活性的最佳浸提工藝，以倍比稀釋法確定苦瓜水提物的最小抑菌濃度(MIC)和殺菌濃度(MBC)，以4倍MIC濃度的苦瓜水提物濃度檢測苦瓜水提物抗幽門螺桿菌的殺菌動力學(xué)，旨在將苦瓜開發(fā)為抗幽門螺桿菌同時具有保健功能的食品或飲品提供理論依據(jù)和技術(shù)方法。

1　材料與方法

1.1材料和試劑

苦瓜：鳳陽華佗大藥房(經(jīng)安徽科技學(xué)院藥學(xué)系時維靜教授鑒定為正品)，在50 ℃烘箱干燥12 h后，用粉碎機(jī)粉碎后，過40目篩，4 ℃干燥保存?zhèn)溆茫?/p>

幽門螺桿菌液體培養(yǎng)基、固體培養(yǎng)基、培養(yǎng)劑(復(fù)合抗生素)：青島海博生物技術(shù)公司；

胎牛血清：上海生物工程有限公司；

無纖維綿羊血：鄭州九龍生物技術(shù)公司；

微需氧產(chǎn)氣袋(日本三菱瓦斯MGC)：上海寶曼生物科技有限公司。

1.2儀器

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：RE-3000型，上海亞榮生化儀器廠；

真空冷凍干燥機(jī)：ALPHA1-2 LD plus型，德國Martin Christ公司；

高壓蒸汽滅菌鍋：LDZX-30KBS型，三強(qiáng)醫(yī)療器械有限公司；

培養(yǎng)箱：SPX-8OB型，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；

恒溫水浴鍋：DK-8D型，上海一恒儀器有限公司；

超凈工作臺：SW-CJ-2FD型，蘇州凈化設(shè)備廠；

恒溫振蕩器：ZWYR-D2402型，上海志誠儀器有限公司。

1.3供試菌種

幽門螺桿菌臨床株：安徽科技學(xué)院細(xì)胞與分子生物學(xué)實驗中心保存。

1.4試驗方法

1.4.1幽門螺桿菌培養(yǎng)及藥物抑菌試驗培養(yǎng)基的配制按照說明書進(jìn)行。供試菌種接種于幽門螺桿菌液體培養(yǎng)基試管內(nèi)，在放有微需氧產(chǎn)氣袋的密閉培養(yǎng)罐中37 ℃震蕩培養(yǎng)36 h，將各菌種轉(zhuǎn)移至幽門螺桿菌固體培養(yǎng)基進(jìn)一步活化，用刮鏟刮下菌苔用生理鹽水制成0.5麥?zhǔn)瞎芗?xì)菌懸濁液，相當(dāng)于菌的濃度為108CFU/mL，在超凈工作臺上用無菌移液槍吸取100 μL菌液均勻涂到固體培養(yǎng)皿制成平板。同時把浸泡在藥液中的紙片小心貼在培養(yǎng)皿的適當(dāng)位置。在微需氧條件下37 ℃培養(yǎng)48 h，用游標(biāo)卡尺測量抑菌圈大小，每個抑菌圈從不同角度測量3次求平均值，單位為mm。

1.4.2單因素試驗參照文獻(xiàn)[15]的方法分別從料液比、浸提溫度和浸提時間3個因素考察苦瓜浸提物的最佳單因素條件。

(1) 料液比考察：稱取5份5 g苦瓜的粉碎物，分別以料液比1∶20，1∶30，1∶40，1∶50，1∶60(g/mL)，在60 ℃水浴回流提取2次，每次2 h，將提取液合并后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，用真空冷凍干燥機(jī)冷凍干燥，稱取適量水提物配制成100 mg/mL水溶液，分別用紙片法測抑菌圈大小，確定最佳料液比。

(2) 浸提溫度考察：稱取5份5 g苦瓜的粉碎物，以料液比1∶40(g/mL)，分別在50，60，70，80，90 ℃水浴回流提取2次，每次2 h，按1.4.2(1)操作，分別用紙片法測抑菌圈大小，確定最佳提取溫度。

(3) 浸提時間考察：稱取5份5 g苦瓜的粉碎物，分別以料液比1∶40(g/mL)，浸提溫度80 ℃，在1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 h水浴回流提取2次，按1.4.2(1)操作，分別用紙片法測抑菌圈大小，確定最佳提取時間。

1.4.3正交試驗優(yōu)化在單因素試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，以水提物對幽門螺桿菌的抑菌圈大小為指標(biāo)，做料液比、浸提溫度和浸提時間的3因素3水平的正交試驗設(shè)計，并對試驗結(jié)果進(jìn)行分析驗證，最終得出苦瓜水提物抗幽門螺桿菌活性的最佳浸提工藝條件。

1.4.4最小抑菌濃度和最小殺菌濃度試驗取24支無菌的試管向每個試管加滅菌的幽門螺桿菌液體培養(yǎng)基1 mL，分成3組，每組8支試管，用倍比稀釋法，將苦瓜浸提物依次稀釋為最終藥液濃度分別為256，128，64，32，16，8，4，2 mg/mL。向每支1 mL含不同藥液濃度試管中加入108CFU/mL的幽門螺桿菌菌液10 μL保證每支試管含幽門螺桿菌數(shù)為106CFU/mL，按照1.4.1幽門螺桿菌的培養(yǎng)方法培養(yǎng)36 h，觀察試管渾濁狀態(tài)，出現(xiàn)渾濁前的試管中苦瓜浸提物的濃度即為最小抑菌濃度(MIC)。將取5 μL澄清試管中的培養(yǎng)物接種于固體培養(yǎng)基，在微需氧37 ℃培養(yǎng)36 h，無菌落出現(xiàn)前一試管中的苦瓜浸提物的濃度即為最小殺菌濃度(MBC)。

1.4.5殺菌動力學(xué)試驗在4倍MIC濃度的苦瓜浸提物液體培養(yǎng)基中，加入幽門螺桿菌至菌數(shù)為106CFU/mL，充分混合后，采用在微需氧條件下，37 ℃，200 r/min震蕩培養(yǎng)，分別在5，20，30，45，60，90 min時取5 μL混合物(每個取3份)，至固體培養(yǎng)基在微需氧條件，37 ℃培養(yǎng)36 h，觀察和計算菌落生長狀況。

2　結(jié)果與分析

2.1單因素試驗結(jié)果

2.1.1料液比對苦瓜水提物抗幽門螺桿菌活性的影響由圖1可知，起初，隨著溶劑量的增加，苦瓜水提物的抗幽門螺桿菌活性先增加，當(dāng)料液比達(dá)到1∶40(g/mL)后，苦瓜水提物抗幽門螺桿菌活性不再增加，考慮水提物的濃縮和干燥，溶劑量大會增加成本，因此，選擇料液比1∶40(g/mL)作為苦瓜最佳提取水平。

圖1　料液比對水提物抑菌活性的影響

2.1.2提取溫度對苦瓜水提物抗幽門螺桿菌活性的影響由圖2可知，起初，隨著溫度的增加苦瓜水提物的抗菌活性增加，到80 ℃達(dá)到最大，抑菌圈為8.8 mm，之后抑菌活性有所減小。說明溫度過高時，苦瓜水提物的抗菌活性成分被破壞，因此，選擇80 ℃作為苦瓜最佳提取水平。

圖2　溫度對水提物抑菌活性的影響

2.1.3提取時間對苦瓜水提物抗幽門螺桿菌活性的影響由圖3可知，起初，隨著提取時間的延長，苦瓜水提物的抗菌活性增加，1.5 h時達(dá)到最大，抑菌圈為9.0 mm，之后抗菌活性逐漸減小，可能是提取物長時間處在較高的溫度下，抗菌活性物質(zhì)受到破壞，進(jìn)一步說明苦瓜抗菌活性物質(zhì)存在熱不穩(wěn)定性，因此，選擇1.5 h為苦瓜最佳提取水平。

2.2正交試驗優(yōu)化結(jié)果

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，設(shè)計的3因素和3水平正交試驗見表1。

由表2可知：浸提物對幽門螺桿菌抑制作用的影響順序為A>C>B；最佳浸提條件組合是A2B3C2，即提取溫度80 ℃，料液比1∶50(g/mL)，浸提時間1.5 h。但A2B3C2條件不在正交試驗表中，因此，在A2B3C2條件下進(jìn)行3次驗證實驗，其提取物對幽門螺桿菌的抑菌圈大小平均值為9.5 mm，大于正交試驗表中的最大值9.3 mm，故苦瓜最佳浸提條件為A2B3C2。

圖3　時間對水提物抑菌活性的影響

水平A浸提溫度/℃B料液比(g/mL)C浸提時間/h1701︰301.02801︰401.53901︰502.0

表2　抑菌作用正交試驗結(jié)果

2.3苦瓜浸提物對幽門螺桿菌的最小抑菌濃度和最小殺菌濃度

苦瓜浸提物的最小抑菌試驗發(fā)現(xiàn)第5支試管開始出現(xiàn)渾濁，說明第4試管的藥物濃度為苦瓜提取物的最小抑菌濃度(32 mg/mL)。將前4支試管培養(yǎng)液接種于瓊脂培養(yǎng)基在微需氧，37 ℃培養(yǎng)36 h后觀察菌落生長狀況，發(fā)現(xiàn)第3和第4支試管接種的培養(yǎng)基有菌落生長，第1和第2支試管的無，說明第2支試管的藥物濃度為最小殺菌濃度(128 mg/mL)。試驗證明：苦瓜提取物對幽門螺桿菌不但有抑制作用，同時有殺滅作用。

2.4苦瓜浸提物對幽門螺桿菌的殺菌動力學(xué)

用4倍MIC濃度即128 mg/mL濃度的苦瓜浸提物進(jìn)行殺菌動力學(xué)試驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在5 min和20 min取得的混合物培養(yǎng)基均有細(xì)菌菌落生長，30 min及之后的混合物培養(yǎng)基均無細(xì)菌菌落生長，證明在4倍MIC濃度下苦瓜浸提物的最小殺菌時間為30 min。說明苦瓜浸提物有較好的殺菌動力學(xué)效果。

3　結(jié)論

本研究證明苦瓜水提物具有抗幽門螺桿菌作用，但不同條件下的水提物對幽門螺桿菌的抑制活性存在差異。通過正交試驗確定了苦瓜浸提物抗幽門螺桿菌活性的最佳浸提工藝為浸提溫度80 ℃，料液比1∶50(g/mL)，浸提時間1.5 h。本研究還發(fā)現(xiàn)苦瓜水提物的抗幽門螺桿菌活性與浸提溫度有較大關(guān)系，在80 ℃溫度下所得浸提物抗菌活性最強(qiáng)，浸提時間對浸提物的抗幽門螺桿菌活性也有一定的影響，高溫和浸提時間過長對苦瓜抗菌活性成分都會造成破壞。

本研究還證明苦瓜在最佳浸提工藝條件下所得的苦瓜水提物對幽門螺桿菌具有抑制作用，最小抑菌濃度是32 mg/mL，這是一個比較低的抑菌濃度?？喙纤嵛镌诟邼舛葧r對幽門螺桿菌還具有殺滅作用，其殺菌濃度為128 mg/mL。同時在128 mg/mL濃度條件下進(jìn)行殺菌動力學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)苦瓜水提物具有快速殺滅幽門螺桿菌作用，最小殺菌動力學(xué)時間為30 min。這表明苦瓜水提物在胃中能快速殺滅幽門螺桿菌作用，因此，苦瓜水提物用于對幽門螺桿菌感染的防治具有重大的醫(yī)學(xué)應(yīng)用價值。

本研究只研究了苦瓜的水提物抗幽門螺桿菌作用。不同的溶劑提取所得的苦瓜浸提物活性成分存在差異，其抑菌活性也存在差異性。苦瓜用不同的溶劑提取時可以得到不同的抑菌成分，抑制幽門螺桿菌的活性會存在差異，用什么溶劑提取所得的提取物對幽門螺桿菌的抗菌活性最強(qiáng)有待進(jìn)一步研究。

[1] LAMB A, CHEN L F. Role of theHelicobacterpylori-induced inflammatory response in the development of gastric cancer[J]. J. Cell Biochem., 2013, 114(3): 491-497.

[2] 康利. Hp感染與胃癌相關(guān)性的臨床研究[J]. 內(nèi)蒙古醫(yī)學(xué)雜志, 2015, 47(9): 1 115-1 117.

[3] 田擁軍, 張正茂, 劉慎沛, 等. 幽門螺桿菌對6種抗生素的耐藥性及其機(jī)制研究[J]. 中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志, 2008, 18(7): 922-925.

[4] 張緒忠, 陳清山. 苦瓜抑菌防腐作用的實驗研究[J]. 預(yù)防醫(yī)學(xué)情報雜志, 1996, 12(1): 17-20.

[5] 張雅靜, 文良娟, 王嬌, 等. 苦瓜的抑菌作用研究[J]. 食品工業(yè)科技, 2013, 34(18): 132-136.

[6] 何愛麗, 肖付剛, 魏珂. 苦瓜黃酮提取及抑菌性研究[J]. 農(nóng)業(yè)機(jī)械, 2012, 30(10): 102-104.

[7] 姚毅. 苦瓜皂甙的提取純化工藝及抑菌功效研究[D]. 無錫: 江南大學(xué), 2006: 48-52.

[8] 張平平, 劉金福, 王昌祿, 等. 苦瓜提取物的抑菌活性研究[J]. 天然產(chǎn)物研究與開發(fā), 2008, 20(4): 721-724.

[9] 何新益, 劉仲華. 苦瓜多糖的改良苯酚—硫酸法測定和提取工藝[J]. 食品與機(jī)械, 2007, 23(4): 72-75.

[10] 張元春. 苦瓜活性物質(zhì)的提取及其抑菌活力的研究[D]. 南寧: 廣西大學(xué)輕工學(xué)院, 2009: 24-27.

[11] BRACA A, SICILIANO T D, ARRIGO M, et al. Chemical composition and antimicrobial activity of Momordica charantia seed essential oil[J]. Fitoterapia, 2008, 79(2): 123-125.

[12] 王貽蓮, 陳燕平, 黃偉. 苦瓜活性組分物質(zhì)抑菌活性測定[J]. 植物保護(hù), 2008, 34(2): 67-70.

[13] MAHMOOD A, RAJA G K, MAHMOOD T, et al. Isolation and characterization of antimicrobial activity conferring component(s)from seeds of bitter gourd(Momordica charantia)[J]. Journal of Medicinal Plants Research, 2012, 6: 566-573.

[14] 張雁, 池建偉, 唐小俊, 等. 苦瓜水提物的抑菌活性及其穩(wěn)定性研究[J]. 食品科學(xué), 2008, 29(4): 121-123.

[15] 趙靜, 王燕. 辣椒粕分離蛋白酶解工藝條件的優(yōu)化[J]. 食品與機(jī)械, 2016, 32(1): 162-166.

Anti-bacterial effects on helicobacter pylori of aqueous extracts from bitter melon and its ptimum extraction process

ZHANG Xiao-lin1WUYan-xiang1LUFan1HEPei-pei1

(1.CollegeofFoodandDrug,AnhuiScienceandTechnologyUniversity,Fengyang,Anhui233100,China;2.TheMinistryofAgricultureKeyLaboratoryofMicrobialOrganicFertilizer,Bengbu,Anhui233030,China)

In order to study the anti-Helicobacter pylori activities of aqueous extracts from bitter melon， the extraction processes were optimized by orthogonal array design with respect to inhibitory zone size of bacteria using paper disc diffusion method. The minimum inhibitory concentration (MIC), minimum bactericidal concentration (MBC) and bactericidal kinetics on aqueous extracts of bitter melon were further investigated. The results showed that the best anti-Helicobacter pylori effects of aqueous extracts from bitter melon were the water extraction condition with the temperature at 80 ℃，the ratio of material to liquid at 1∶50， for 1.5 h. Its MIC and MBC againstHelicobacterpyloriwere 32 mg/mL and 128 mg/mL, respectively. The kinetics of fourfold anti-bactericidal activity againstHelicobacterpylori was 30 min.

bitter melon; aqueous extracts;Helicobacterpylori; antibacterial

安徽省自然科學(xué)基金一般項目(編號：1308085MC43)；安徽省教育廳重點(diǎn)和重大項目(編號：KJ2013A078，KJ2016SD16)；安徽科技學(xué)院自然科學(xué)基金(編號：ZRC2014404)；安徽省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目(編號：AH201410879058)

張孝林(1968—)，安徽科技學(xué)院副教授，博士。

E-mail: zhangxiaolin8@126.com

2016—01—04

10.13652/j.issn.1003-5788.2016.08.033