王　丹黃紫藤,4馬　越趙曉燕,4

(1.北京市農(nóng)林科學(xué)院蔬菜研究中心，北京　100097；2. 農(nóng)業(yè)部華北地區(qū)園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點實驗室，北京　100097；3. 農(nóng)業(yè)部都市農(nóng)業(yè)(北方)重點實驗室，北京　100097；4；北京農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院,北京　102206)

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藍莓花色苷對雞胚成纖維細胞系生長的影響

王丹1,2,3黃紫藤1,2,3,4馬越1,2,3趙曉燕1,2,3,4

(1.北京市農(nóng)林科學(xué)院蔬菜研究中心，北京100097；2. 農(nóng)業(yè)部華北地區(qū)園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點實驗室，北京100097；3. 農(nóng)業(yè)部都市農(nóng)業(yè)(北方)重點實驗室，北京100097；4；北京農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院,北京102206)

以花色苷含量為21.34%的藍莓花色苷粉末為原料，采用MTT法、顯微鏡觀察法，同時利用細胞計數(shù)儀測定細胞活率，3種方法共同檢測藍莓花色苷作用于雞胚成纖維細胞系的細胞毒性，以完成細胞試驗?zāi)Ｐ偷慕?。結(jié)果表明：50～100 μg/mL的藍莓花色苷可以促進雞胚成纖維細胞生長，高于100 μg/mL的藍莓花色苷，對細胞生長產(chǎn)生抑制作用。該結(jié)果可為進一步拓展花色苷功能性研究，以及以雞胚成纖維細胞為模型的生物功能性研究提供理論依據(jù)。

藍莓花色苷；雞胚成纖維細胞系；MTT法

雞胚成纖維細胞來源于East Lansing Line(ELL-0)雞胚胎，具有永生性，是一種可傳代的細胞系[1]。此細胞系缺少禽白血病病毒的相關(guān)內(nèi)源片段，并具有正常的成纖維形態(tài)，可以用于禽源病毒的增殖，用作生物制品研究與生產(chǎn)的重要材料，近些年，其安全性備受相關(guān)科研人員的關(guān)注[2-3]。

花色苷是一類廣泛存在于植物中的天然酚類化合物，主要分布在顏色鮮艷的蔬菜和水果中，如橙色、紅色和藍色等，尤其存在于漿果中。藍莓是一種杜鵑花科的越橘屬植物，漿果外觀呈現(xiàn)藍色或藍黑色，以“世界水果之王”著稱，藍莓花色苷是藍莓果實中提取出來的天然花色苷色素，呈紫黑色粉末狀，無毒、無異味，花色苷對多種疾病有很好的療效[4]，如具有抗氧化、清除自由基、降低患冠心病的風(fēng)險、改善視力、降血脂以及抗腫瘤、抗糖尿病等諸多抗病作用[5-6]。因藍莓花色苷具有諸多生理功能，故近年來此類物質(zhì)引起了科研人員的廣泛關(guān)注，對于其抗氧化、抗癌細胞增殖等作用已有很多研究。藍莓葉多酚提取物可以抑制細菌活性，表現(xiàn)出較強的抑菌性[7]。關(guān)于藍莓花色苷的抗氧化作用方面有一些報道，李穎暢等[8]認為藍莓花色苷可以降血脂并且具有抗氧化生物活性，可以降低發(fā)生動脈硬化的危險性。并且已有報道[9]證明，藍莓花色苷粉末可以顯著抑制脂質(zhì)體的過氧化。曾有人[10]用藍莓花色苷喂飼老年大鼠60 d后，老年老鼠同中年大鼠的平衡能力一樣好，可以在滾動的木棍上保持很好的平衡。在飼喂老鼠120 d后，老年老鼠的測試成績同年輕鼠的測試成績一樣好。

雞胚成纖維細胞是常用于評估藥物活性或病毒侵染的模式細胞，紫玉米、紫甘薯等花色苷對其生長的影響已有報道[6]，花色苷組分不同，功能性不同，而藍莓花色苷對此細胞的生長是否有影響，目前未有研究。本試驗擬研究不同濃度的藍莓花色苷作用于雞胚成纖維細胞，觀察細胞的形態(tài)學(xué)變化及不同濃度藍莓花色苷對細胞存活情況的影響，旨在為后期以雞胚成纖維細胞為細胞模型的試驗提供相關(guān)的濃度參數(shù)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

1.1.1材料與試劑

藍莓花色苷粉末：北京市農(nóng)林科學(xué)院蔬菜研究中心；

雞胚成纖維細胞、0.25%胰蛋白酶溶液 (1x)：武漢菲恩生物科技有限公司；

DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)：美國Gibco公司；

二甲基亞砜(DMSO)：北京索萊寶公司；

3-(4,5-二甲基噻唑-2) -2,5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)、青鏈霉素雙抗溶液(100X)：美國Sigma公司；

DMEM細胞培養(yǎng)液：美國Hyclone 公司。

1.1.2主要儀器設(shè)備

超凈工作臺：DL-CJ-1NDII型，北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；

二氧化碳細胞培養(yǎng)箱：Series 8000 DH 3543型，美國Thermo 公司；

倒置熒光顯微鏡：BDS200型，重慶OPTEC奧特光學(xué)公司；

酶標儀：SpectraMax i3型，美國Molecular Devices公司；

Countstar自動細胞計數(shù)分析儀：IC 1000型，北京五洲東方科技發(fā)展有限公司；

高速離心機：3K15型，德國Sigma公司。

1.2試驗方法

1.2.1雞胚成纖維細胞的復(fù)蘇預(yù)先配好含有15% FBS的DMEM培養(yǎng)液，加入1%青鏈霉素雙抗溶液，于37 ℃水浴中預(yù)熱30 min。從液氮中取出細胞凍存管，迅速置于37 ℃溫水中搖晃，使凍存管中的冰迅速融化，待凍存管中僅剩少量冰時拿出， 1 000 r/min離心5 min，以70%酒精噴灑凍存管表面，置于超凈臺內(nèi)吹干。棄去上層凍存液，以一次性移液管加入預(yù)熱好的培養(yǎng)基，有序地吹吸細胞，將細胞吹打分散至均勻，移至T25細胞培養(yǎng)瓶中，并補足至6 mL培養(yǎng)液。將細胞培養(yǎng)瓶置于含5% CO2的37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細胞貼壁后，即可換入新的細胞培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)，至長成單層后傳代。

1.2.2雞胚成纖維細胞的傳代培養(yǎng)待雞胚成纖維細胞鋪滿培養(yǎng)瓶壁的80%，棄去上清液，加入預(yù)熱的PBS進行清洗，立即倒出，再加入0.25%胰蛋白酶溶液，置于37 ℃培養(yǎng)箱進行消化，見細胞脫落后將細胞懸液移入到裝有FBS的離心管中，以1 300 r/min離心5 min后加入DMEM培養(yǎng)液，用吸管有序地吹打細胞至細胞分散，以1∶3傳代，加入到含5% FBS的DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)細胞，將細胞培養(yǎng)瓶置于5% CO2條件下37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天傳代。

1.2.3藍莓花色苷對雞胚成纖維細胞生長的影響參考蓋麗麗等[6]的試驗方法，用濃度為10 mmol/L的PBS緩沖液將藍莓花色苷粉稀釋成母液，母液濃度為12.5 mg/mL，用0.22 μm濾膜過濾除菌，作為儲備液可凍存于-20 ℃冰箱中，方便日后使用。將一瓶長滿的雞胚成纖維細胞消化，加入含5% FBS的DMEM細胞生長液，接種于96孔板，每孔加入200 μL的細胞懸液，鋪板時用自動細胞計數(shù)分析儀測定細胞濃度，為5.97×105mL-1。放置于5% CO2培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)至細胞長成單層，棄液，每孔換成含2% FBS的DMEM細胞維持液，同時加入50，75，100，150 μg/mL的4種濃度的藍莓花色苷溶液，每一種藍莓花色苷濃度均設(shè)置3組重復(fù)，試驗同時設(shè)置細胞對照組和重復(fù)組。在不同的時間點(12，24，48，72 h)，利用自動細胞計數(shù)儀對各孔內(nèi)的細胞進行計數(shù)，同時用倒置顯微鏡觀察細胞生長情況，根據(jù)康雪燕[11]提供判斷標準來記錄結(jié)果。

1.2.4MTT法檢測藍莓花色苷對雞胚成纖維細胞生長的作用用0.25%胰蛋白酶溶液消化處理雞胚成纖維細胞，加入含5% FBS的DMEM細胞生長液，用一次性移液槍吹散細胞制備細胞懸液，然后用八通道一體移液器將細胞懸液接種于96孔板，鋪板時的細胞濃度為1.14×105mL-1。鋪板時每孔200 μL，將96孔板置于含5% CO2培養(yǎng)箱中于37 ℃培養(yǎng)至細胞單層長滿80%，棄去每孔內(nèi)的細胞上清液，加入藍莓花色苷，用含2% FBS的DMEM培養(yǎng)液調(diào)節(jié)花色苷的終濃度分別為50，75，100，150 μg/mL，每一種藍莓花色苷濃度設(shè)3組重復(fù)，試驗同時設(shè)置空白對照組和陰性對照組。同時接種4塊96孔板，注意無菌操作。然后將其置于5% CO2培養(yǎng)箱中于37 ℃過夜培養(yǎng)，分別于第12、24、48、72小時取出一塊96孔細胞培養(yǎng)板，棄去每孔中的上清液，向每孔中加入10 μL的MTT溶液，置于37 ℃培養(yǎng)孵育4 h后，棄去孔內(nèi)液體，向每孔中加入170 μL二甲基亞砜(DMSO)溶液，為使形成的甲躦完全溶解，酶標儀設(shè)置讀數(shù)前震蕩600 s，于490 nm處測定吸光值。

2　結(jié)果與分析

2.1藍莓花色苷對雞胚成纖維細胞生長的影響檢測結(jié)果

在對雞胚成纖維細胞生長影響的試驗中，隨著藍莓花色苷濃度增加和時間的延長，細胞的生長存活情況也會隨之改變，結(jié)果見表1。結(jié)合倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)(結(jié)果見圖1)，記錄細胞生長狀態(tài)，可以找到相應(yīng)的最適合雞胚成纖維細胞生長的藍莓花色苷的終濃度。與對照組相比，細胞生長至72 h時，濃度為50，75，100 μg/mL的藍莓花色苷沒有影響雞胚成纖維細胞的生長，用倒置顯微鏡觀察細胞的生長形態(tài)，觀察到細胞生長狀態(tài)良好，生長形成單層，且基本未出現(xiàn)空隙，細胞形態(tài)飽滿、透亮且完整，濃度為150 μg/mL的藍莓花色苷處理組表現(xiàn)出對細胞生長的輕微抑制，未形成緊密的單層，出現(xiàn)空隙。隨著時間的增加，120 h后，對照組的細胞還可以正常生長，而濃度為150 μg/mL的藍莓花色苷處理對雞胚成纖維細胞生長產(chǎn)生抑制作用，影響細胞生長，表現(xiàn)為出現(xiàn)凋亡小體。根據(jù)觀察細胞生長形勢以及數(shù)據(jù)，可得出藍莓花色苷的最適終濃度為100 μg/mL。

由圖1可知，72 h時細胞仍能夠正常生長，且從形態(tài)上觀察具有比較明顯的差異。圖1(a)是未加藍莓花色苷的雞胚成纖維細胞對照組，細胞生長良好，形成單層，基本無空隙。圖1(b)和(c)是藍莓花色苷濃度為50 μg/mL和100 μg/mL?的試驗組，生長狀態(tài)與對照組相同。圖1(d)是藍莓花色苷濃度為150 μg/mL的試驗組，細胞形態(tài)不如對照組的完整，細胞單層出現(xiàn)空隙。所以最適合于雞胚成纖維細胞生長的濃度100 μg/mL，當濃度高于100 μg/mL時，藍莓花色苷會對雞胚成纖維細胞生長產(chǎn)生抑制作用。

表1藍莓花色苷對雞胚成纖維細胞生長的影響?

Table 1Effect of different concentrations of blueberry anthocyanins on primary chicken embryonic fibroblast growth

培養(yǎng)時間/h對照50μg/mL75μg/mL100μg/mL150μg/mL12***********************24***********************36*******************48********************60********************72*******************96**************120********144**--*-

*****表示細胞具有良好的折光性，生長成完整的單層，細胞之間未形成空隙；****表示細胞狀態(tài)良好，生長形成單層，并且基本未形成空隙；***表示細胞生長狀態(tài)一般，未生長形成單層，細胞極少，且細胞之間產(chǎn)生較多的空隙；**表示細胞生長狀態(tài)較差，細胞極少且細胞間產(chǎn)生大量空隙；*表示細胞生長狀態(tài)很差，貼壁細胞數(shù)量很少，并且無基本的細胞形態(tài)；-表示細胞生長狀態(tài)極差，全部細胞均破碎、細胞不完整或細胞基本輪廓不清晰。

同時，使用自動細胞計數(shù)儀在不同時間點測定各濃度花色苷對雞胚成纖維細胞的細胞活率，相應(yīng)的結(jié)果見表2。觀察數(shù)據(jù)可知，在24 h時各個試驗組的細胞活率均高于細胞對照組，說明在24 h時4種濃度的藍莓花色苷均可以促進細胞生長。在48 h時，對照組的細胞活率94.77%，濃度為50 μg/mL的藍莓花色苷處理組的細胞活率與對照組相當，濃度為75，100 μg/mL的處理組的細胞活率高于對照組，只有濃度為150 μg/mL的花色苷處理組的細胞活率略低于對照組。72 h后，濃度為100 μg/mL的藍莓花色苷最適合雞胚成纖維細胞生長。其中在120 h時，對照組的細胞活率為84.62%，100 μg/mL藍莓花色苷組的細胞活率為94.12%，差異顯著(P<0.05)。通過對比數(shù)據(jù)可以找出最適合雞胚成纖維細胞生長的濃度，在不同時間點測得，藍莓花色苷濃度為100 μg/mL時，細胞活率均最大，當花色苷濃度高于100 μg/mL時細胞活率明顯下降，所以藍莓花色苷對雞胚成纖維單層細胞生長無影響的最大安全濃度為100 μg/mL。

圖1　各試驗組處理72 h的雞胚成纖維細胞形態(tài)

Figure 1Effect of anthocyanins on morphology of primary chicken embryonic fibroblast under microscope (×200)

2.2MTT法檢測結(jié)果

由圖2可知，藍莓花色苷對于雞胚成纖維細胞的生長有良好的促進作用，與對照組相比，濃度低于100 μg/mL對細胞的單層生長無毒性作用，50，75，100 μg/mL的藍莓花色苷均可以促進細胞生長，隨著藍莓花色苷濃度的增加，細胞的活性也在增加，當濃度高于100 μg/mL時細胞活性便受到損傷，較對照組相比490 nm處的吸光值明顯降低。所以，藍莓花色苷促進細胞生長的最大安全濃度為100 μg/mL。

3　結(jié)論

藍莓花色苷對雞胚成纖維細胞的生長具有影響，藍莓花色苷濃度為50～100 μg/mL時促進雞胚成纖維細胞的生長，濃度高于100 μg/mL時對雞胚成纖維細胞生長產(chǎn)生抑制作用。本試驗結(jié)果可為藍莓花色苷抗以雞胚成纖維細胞為模型的病毒研究提供了理論依據(jù)，但有關(guān)藍莓花色苷促進及破壞雞胚成纖維細胞生長的機制還有待進一步研究。

表2　　　　雞胚成纖維細胞在4種不同濃度藍莓花色苷作用下的細胞活率

圖2　藍莓花色苷對雞胚成纖維細胞單層生長的影響

Figure 2Effect of blueberry anthocyanins for primary chicken embryonic fibroblast growth by MTT assay

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Effect of anthocyanins from blueberry on primary chicken embryonic fibroblast

WANG Dan1,2,3HUANGZi-teng1,2,3,4MAYue1,2,3ZHAOXiao-yan1,2,3,4

(1.BeijingVegetableResearchCenter,BeijingAcademyofAgricultureandForestryScience,Beijing100097,China;2.KeyLaboratoryofBiologyandGeneticImprovementofHorticulturalCrops(NorthChina) ,MinistryofAgriculture,P.R.China,Beijing100097,China; 3.KeyLaboratoryofUrbanAgriculture(North) ,MinistryofAgriculture,Beijing100097,China; 4.FoodScienceandEngineeringCollege,BeijingUniversityofAgriculture,Beijing, 102206,China)

The effect of blueberry anthocyanins on the growth of primary chicken embryonic was investigated fibroblast in this study. 21.34% of anthocyanins was used to The situation of cell growth was evaluate by optical microscope, cell counter, and MTT assays. We observed that 50-100 μg/mL was the optimal concentration, which had no cytotoxicity to primary chicken embryonic fibroblast. It would inhibit cell growth when the concentration was more than 100 μg/mL. The results of this study may provide the basis for further development of anthocyanins functional studies and give helpful information for preventing the virus which used primary chicken embryonic fibroblast as cell model.

blueberry anthocyanins; primary chicken embryonic fibroblast; MTT assay

北京市科技新星計劃(編號：Z131105000413023)；現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項資金資助(編號：CARS-25)

王丹，女，北京市農(nóng)林科學(xué)院副研究員。

趙曉燕(1969—)，女，北京市農(nóng)林科學(xué)院研究員。

E-mail: zhaoxiaoyan@nercv.org

2016-05-04

10.13652/j.issn.1003-5788.2016.08.004