侯俊明　任占良　侯杰軍　楊得振　董　明　魏　輝　賈　奇　任小朋　賈　勇

陜西中醫(yī)藥大學(xué)(咸陽 712000)

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莪黃湯保留灌腸對人結(jié)腸癌SW480移植瘤生長及VEGF表達的影響*

侯俊明任占良▲侯杰軍△◇楊得振△董明△魏輝△賈奇△任小朋△賈勇△

陜西中醫(yī)藥大學(xué)(咸陽 712000)

目的：研究莪黃湯對人結(jié)腸癌SW480移植瘤生長及VEGF的影響。方法：選健康SPF級BALB/c小鼠2只，雌性，年齡4～6周，體重18～22g；健康SD大鼠40只，體重200±15g。造模后，40只SD大鼠隨機分為模型組、對照組、陽性對照組、莪黃湯高劑量組、莪黃湯低劑量組，每組10只,接種后1周開始給藥治療。四組均給予飼料、自由飲用水，分別用相應(yīng)藥物干預(yù)處理2周。觀察莪黃湯對人結(jié)腸癌SW480移植瘤生長及抑瘤作用的影響，運用S-P免疫組化法分析移植瘤內(nèi)血管內(nèi)皮生長因子的表達。結(jié)果：莪黃湯對SW480移植瘤大鼠瘤體生長有抑制作用，但弱于5-FU；該藥等促進大鼠胸腺、脾臟的生長，提升了機體的免疫力及抗腫瘤能力；陽性對照組與藥物組對SW480移植瘤大鼠VEGF表達的影響相近；可抑制腫瘤細胞的生長，促進腫瘤細胞的凋亡。結(jié)論：莪黃湯對SW480移植瘤細胞的生長有明顯抑制作用，減少SW480移植瘤表達VEGF，促進腫瘤細胞凋亡。

主題詞結(jié)腸腫瘤灌腸@莪黃湯動物，實驗

中醫(yī)藥抗腫瘤治療既能扶正、增強機體免疫功能，又能殺滅腫瘤細胞，還能活血并改善高黏高凝狀態(tài)，在腫瘤治療過程中發(fā)揮著重要的作用[1]。本次實驗通過對SW480荷瘤大鼠免疫功能影響的研究，探討了莪黃湯對人結(jié)腸癌移植瘤的抑瘤作用及對VEGF表達的影響。

1材料1.1實驗材料健康SPF級BALB/c雌性小鼠2只，鼠齡4～6周，體重20±2g；健康SD大鼠40只，體重200±15g；以上動物均購自第四軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心，其中健康SPF級BALB/c小鼠代養(yǎng)在第四軍醫(yī)大學(xué)動物實驗中心SPF條件下的超凈層流籠中；人結(jié)腸癌SW480細胞株購自第四軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心。莪黃湯組方：莪術(shù)、大黃、昆布、薏苡仁。陽性對照藥物：5-FU購自陜西中醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院。(批準(zhǔn)文號：國藥準(zhǔn)字H31020593，規(guī)格0.25g/支)。實驗試劑盒：鼠抗人VEGF免疫組化試劑(產(chǎn)品貨號：A003-3)。

2實驗方法2.1造模及分組灌腸將莪黃湯生藥80g，煎湯濃縮為生藥含量為4g/ml冷藏備用(陜西中醫(yī)學(xué)院藥理實驗中心制備)，用前稀釋至所需濃度。選健康SPF級BALB/c小鼠2只，雌性，年齡4～6周，體重18～22g；健康SD大鼠40只，體重200±15g。在健康SPF級BALB/c小鼠背部種植人結(jié)腸癌SW480細胞，制成實體瘤模，觀察兩周后成瘤率100%[2]。成瘤后即處死瘤鼠，消毒皮膚，切下瘤塊，選用合適部位于生理鹽水中剪成直徑2mm的瘤塊備用。40只SD大鼠經(jīng)適應(yīng)性喂養(yǎng)3d后進行瘤體種植手術(shù)；術(shù)前禁食12 h，以10%水合氯醛(300mg/kg)腹腔注射麻醉，常規(guī)安爾碘消毒腹部皮膚，選擇下腹正中切口，打開腹腔，將制備好的瘤塊植入距回盲部約5cm處腸系膜側(cè)的漿膜面凹龕中[3]。術(shù)后所有大鼠暫時分籠飼養(yǎng)至完全清醒后給予正常飲食。以《藥理學(xué)實驗》給藥方法，莪黃湯組結(jié)腸給藥，按低劑量組4g/kg/d，高劑量組40g/(kg·d)[4]。5-FU結(jié)合臨床用藥原則，按公式計算，每只大鼠腹腔注射50mg/kg，隔日。

所有SD大鼠全部蘇醒，按根據(jù)隨機數(shù)字表分組的方法分為4組，模型對照組[用蒸餾水按10ml∕(kg·d)體重灌腸]；陽性對照組(腹腔注射5-FU，給藥劑量為50mg/kg,隔日)；莪黃湯高劑量組[2ml(8g)/(d·只)]；莪黃湯低劑量組[2ml(0.8g)/(d·只)]，每組10只。接種后1周開始給藥治療，均給予飼料、自由飲用水，分別用相應(yīng)藥物干預(yù)處理2周。觀察SD大鼠一般情況；各組SD大鼠體重的變化；SW480移植瘤的生長狀況。計算抑瘤率抑瘤率(%)=[(模型組平均瘤重-用藥組平均瘤重)/模型組平均瘤重×100%]及脾臟(胸腺)指數(shù)脾臟(胸腺)指數(shù)=[脾臟(胸腺)重量(mg)/大鼠體重(g)]。S-P免疫組化分析法測定各組VEGF的表達。

2.2統(tǒng)計學(xué)方法實驗數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，數(shù)據(jù)采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，P<0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。

3結(jié)果3.1SD大鼠生活狀況觀察造模前所有大鼠生活狀況良好。接種后1周內(nèi)，未見異常，各組大鼠均成瘤成功，成瘤率為100%。給藥2周以后，體重變化情況模型組較其它組均有減輕，進食及飲水量明顯減少，體毛雜亂暗淡無光。陽性對照組明顯出現(xiàn)脫毛、體毛雜亂、無光澤，較模型組體重明顯減輕。莪黃湯各組大鼠體重明顯增長，日進食、水量增加，活動好。模型組1只大鼠因全身衰竭死亡。

3.2給藥前后對各組大鼠體重的影響SD大鼠接種第7天與用藥后第15天體重比較，用藥后體重與模型組比較陽性對照組降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.01)，與模型組比較莪黃湯組均升高，升高程度統(tǒng)計學(xué)差異顯著(P<0.01)；莪黃湯組體重均高于陽性對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見表1。

表1　給藥前后SD大鼠體重變化比較(g)

3.3藥物對大鼠瘤體重量及抑瘤率的影響對實驗大鼠進行藥物灌腸，灌腸后2周，嚴格稱取SD大鼠體重，瘤體重量及抑瘤率分析結(jié)果見表2。從結(jié)果來看，實驗鼠的體重兩組存在顯著差異，與陽性對照組的大鼠體重比較比較，莪黃湯組的大鼠體重均較高(P<0.05)。

表2　藥物對SW480移植瘤大鼠瘤體重量及抑瘤率的影響

3.4藥物對SW480移植瘤大鼠免疫器官指數(shù)的影響與模型組比較，陽性對照組指數(shù)均降低(P<0.05)，與陽性對照組比較，莪黃湯組均較高(P<0.05)，見表3。

表3　藥物對SW480移植瘤大鼠脾臟、胸腺指數(shù)的影響(mg/g)

3.5藥物對SW480移植瘤大鼠瘤組織中VEGF的影響與模型對照組比較，陽性對照組、莪黃湯高劑量組表達VEGF明顯下降，莪黃湯低劑量組VEGF表達有所下降；莪黃湯高劑量組與陽性對照組比較無明顯差異，說明莪黃湯與5-FU對SW480移植瘤大鼠VEGF的表達影響相近，見表4。

表4　藥物對SW480移植瘤大鼠瘤組織中VEGF的影響

4討論運用莪黃湯保留灌腸，在改善結(jié)直腸癌術(shù)后患者排便功能、圍放療期患者的臨床表現(xiàn)，改善腫瘤周圍組織手術(shù)條件，增強新輔助治療效果，縮短了新輔助治療的時間，提高患者的生活質(zhì)量方面取得了一定的療效[5]。莪黃湯聯(lián)合化療能在一定程度上下調(diào)患者結(jié)直腸癌組織中VEGF的表達，上調(diào)E-Cadherin的表達，抑制腫瘤新生血管生成，從而抑制腫瘤的復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移[6]。

以往的研究中發(fā)現(xiàn)益氣活血類中藥可通過影響SDF-1/CXCR4通路等,調(diào)節(jié)血管生成,從而治療血管生成異常的疾??；而從莪術(shù)中提取莪術(shù)醇和β—欖香烯的抗腫瘤作用尤其突出[7]。李傳偉等[8]探討了莪術(shù)油對小鼠結(jié)腸癌抑制作用及機制。馮剛等[9]通過實驗證明莪術(shù)油對腫瘤血管形成有明顯抑制作用。大黃素抗腫瘤、抗炎癥等多種生物學(xué)作用已經(jīng)有報道[10]。 王庭欣等[11]認為昆布多糖是通過細胞免疫和非特異性免疫而實現(xiàn)對小鼠的抑瘤作用。馮剛等[12]發(fā)現(xiàn)薏苡仁具有明顯抑制S180肉瘤生長的功效。

本實驗提示莪黃湯對SW480移植瘤大鼠瘤體的生長有抑制，但弱于5-FU。與模型對照組比較，莪黃湯各劑量組可增強SD大鼠免疫力，具有顯著性差異；與陽性對照組比較，莪黃湯各劑量組SD大鼠胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)顯著升高；與模型組相比，5-FU組SD大鼠免疫力明顯降低，顯示了5-FU對大鼠的脾臟和胸腺較強的損傷作用。莪黃湯各劑量組與陽性對照組相比較，莪黃湯能夠促使大鼠的胸腺、脾臟生長，能改善機體的免疫功能，增強抗腫瘤的能力。

目前眾多研究證實，當(dāng)腫瘤體積大于2mm3時，就需要新生血管來為腫瘤細胞的生長提供養(yǎng)分。大腸癌的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移同樣依賴新生血管的形成。宋寄春等[13]發(fā)現(xiàn)半枝蓮阻滯了腫瘤細胞由S期向GZ/M期的轉(zhuǎn)變過程，從而引起腫瘤細胞凋亡。崔映宇等[14]發(fā)現(xiàn)馬尾松樹皮提取物抑制人結(jié)直腸癌細胞的生長，誘導(dǎo)其凋亡是通過上調(diào)P53、P21，下調(diào)Bel-2來表達。呂盈盈等[15]發(fā)現(xiàn)大黃素通過抑制VEGFR酪氨酸激酶活性來抑制結(jié)腸癌細胞的生長。

[1]王建美,章永紅.章永紅教授治療腸癌經(jīng)驗探要[J] 陜西中醫(yī),2016,37(1)：95-96.

[2]Liu L.Zhang QL.Zhang YF，Lentivirus-mediated silencing of tiam1 gene influences multiple functions of a human colorectal cancer cell line[J].Neoplasia，2006,8(11):917-924.

[3]張國鋒，王元和，王強．人結(jié)腸癌裸鼠原位種植癌及轉(zhuǎn)移模型的建立[J].中國普通外科雜志，2003,12(11):823-826．

[4]譚毓治，馮冰虹.藥理學(xué)實驗[M].北京：人民衛(wèi)生出版社,2008：142-143.

[5]侯俊明,魏輝,田博.直腸灌注莪黃湯在低位直腸癌新輔助放療期的臨床應(yīng)用[J].現(xiàn)代中醫(yī)藥,2011,31(5):34-35.

[6]侯俊明,王磊.莪黃湯聯(lián)合化療治療直腸癌前切除術(shù)后綜合征療效觀察[J].西部中醫(yī)藥,2012,25(11)：85-87.

[7]鄧嶸，陳濟民，姚崇舜，等.莪術(shù)醇的研究進展[J].遼寧藥物與臨床,2001,4(1)：37.

[8]李傳偉，徐萸萍，苗芳，等．莪術(shù)油抗小鼠結(jié)腸癌效應(yīng)的實驗研究[J]．泰山醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2005,26(2):89-91．

[9]馮剛，黃濤，盧宏達，等．莪術(shù)油注射液對小鼠移植性s180肉瘤血管形成的抑制作用[J].腫瘤研究與臨床，2005,17(4):233-235．

[10]丁艷，黃志華.大黃素的抗腫瘤作用研究進展[J]．時珍國醫(yī)國藥，2008，19(5)：1272-1273．

[11]王庭欣，蔣東升，馬曉彤，等．海帶多糖對小鼠H22實體瘤的抑制作用[J]．衛(wèi)生毒理學(xué)雜志，2000,14(4):242.

[12]馮剛，孔志慶，黃冬生，等．腫瘤防治研究[J]．腫瘤，2004,31(4):31-32．

[13]宋寄春，譚詩云，陳明揩.半枝蓮對人大腸癌細胞增殖抑制及誘導(dǎo)凋亡的作用[J].咸寧學(xué)院學(xué)報(醫(yī)學(xué)版)，2007,21(2):106-108.

[14]崔映宇，王宏斌，謝衡，等.馬尾松樹皮提取物體外抑制人大腸癌細胞生長機理初探[J].中國農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2007,12(4):7-14.

[15]呂盈盈，錢家鳴，邱輝忠，等.大黃素對結(jié)腸癌血管內(nèi)皮生長因子受體的影響及對結(jié)腸癌抑制作用的研究[J].中國中西醫(yī)結(jié)合消化雜志，2005,13(5):310-313.

(收稿2016-05-07；修回2016-06-20)

*陜西省社會發(fā)展科技攻關(guān)項目(2012SF2-11-3)

▲陜西戶縣森工醫(yī)院(戶縣710300)

△陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院(咸陽 712000)

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10.3969/j.issn.1000-7369.2016.09.074