司杰

（信陽師范學(xué)院華銳學(xué)院，河南信陽464000）

金葉女貞黑斑病菌分生孢子萌發(fā)條件及形態(tài)觀察

司杰

（信陽師范學(xué)院華銳學(xué)院，河南信陽464000）

金葉女貞葉斑病造成植物大量落葉，是一類重要病害。本實驗應(yīng)用紙環(huán)法誘導(dǎo)葉斑病病原菌分生孢子萌發(fā)，探討碳源、氮源、基質(zhì)酸堿度等生態(tài)條件對分生孢子萌發(fā)的影響。結(jié)果表明，供試的4種碳源中蔗糖、葡萄糖、麥芽糖均能促進分生孢子萌發(fā)，蔗糖效果相對較明顯，而可溶性淀粉可抑制分生孢子萌發(fā)；供試的4種氮源中牛肉膏、蛋白胨、硝酸銨均能促進分生孢子萌發(fā)，其中2種有機氮源效果更明顯，而硫酸銨可抑制分生孢子萌發(fā)。pH值在3～11范圍內(nèi)該病原菌分生孢子均可萌發(fā)，最適pH為7，分生孢子在中性及偏微堿性環(huán)境中萌發(fā)率較高。

金葉女貞；黑斑??；分生孢子；萌發(fā)率

金葉女貞（Ligustrum vicaryi f.）[1]為雜交種。我國1984年從德國和美國引種金葉女貞，枝葉茂密，耐修剪，宜栽培成矮綠籬，多和杜鵑、月季等組成色彩鮮艷豐富的花壇被大量栽種[2,3]。但當(dāng)植株栽植密，通風(fēng)透光差時，葉斑病發(fā)生嚴重。發(fā)病時，葉片大量脫落，嚴重影響景觀效果[4]。金葉女貞黑斑病的發(fā)生和發(fā)展，與病原菌的生長和分生孢子的萌發(fā)直接相關(guān)。本實驗的研究可說明，該病原菌分生孢子萌發(fā)的幾種條件，對于此病的防治有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種來源

由信陽師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院植物微生態(tài)實驗室提供金葉女貞黑斑病病原菌菌種。

1.1.2 培養(yǎng)基

PDA固體及液體培養(yǎng)基：馬鈴薯200g，蔗糖20g，瓊脂20g,水1 000g；碳源及氮源液體培養(yǎng)基：稱取蔗糖、可溶性淀粉、麥芽糖、葡萄糖、牛肉膏、硝酸銨、蛋白胨和硫酸銨，分別配制1%的水溶液，滅菌后作為分生孢子的氮源和氮源培養(yǎng)液。

1.2 方法

1.2.1 金葉女貞黑斑病病原菌分生孢子的培養(yǎng)

取該病原菌的菌種，接種到PDA固體培養(yǎng)平板上，25℃培養(yǎng)9d。待病原菌菌落覆蓋皿底2/3時，用無菌水沖洗新鮮的金葉女貞葉子，并用灼燒過的解剖針在葉子上扎4～6孔，最后將處理過的金葉女貞葉子接種到菌落表面，3～4片每皿。25℃繼續(xù)培養(yǎng)一周誘導(dǎo)產(chǎn)孢。

1.2.2 碳源對分生孢子萌發(fā)的影響

采用紙環(huán)法孢子萌發(fā)。取培養(yǎng)皿5個，在培養(yǎng)皿及皿蓋中放入滅菌后的濾紙片，加無菌水潤濕濾紙，放入滅菌載玻片。在每個載玻片上放置3個濾紙環(huán)，分別滴加1%的蔗糖、可溶性淀粉、麥芽糖、葡萄糖溶液，無菌水作對照組。用牙簽挑取分生孢子接種于濾紙環(huán)，25℃保濕培養(yǎng)，每2h鏡檢一次，統(tǒng)計孢子萌發(fā)率，連續(xù)觀察8h，拍照記錄孢子萌發(fā)形態(tài)。

1.2.3 氮源對分生孢子萌發(fā)影響

方法同1.2.2，滴加溶液為1%的牛肉膏、硝酸銨、蛋白胨、硫酸銨溶液。

1.2.4 酸堿度對分生孢子萌發(fā)的影響

用10%的NaOH溶液和HCl溶液，調(diào)節(jié)PDA培養(yǎng)液pH值分別為3、5、7、9、11。按1.2.2方法將分生孢子接種于濾紙環(huán)后，25℃保濕培養(yǎng)。

2 結(jié)果分析

2.1 金葉女貞黑斑病分生孢子及萌發(fā)后的形態(tài)觀察

金葉女貞黑斑病病原菌分生孢子單生，淡褐色或褐色，圓柱狀，直立或彎曲，并有數(shù)量不等的隔膜[5，6]。孢子萌發(fā)時可在孢子的頂端或側(cè)端等不同位置伸出淺色呈透明狀的芽管，芽呈細絲狀，隨培養(yǎng)時間而增長，有些還會出現(xiàn)分支，如圖1所示。

圖1 金葉女貞黑斑病菌分生孢子萌發(fā)形態(tài)

2.2 碳源對分生孢子萌發(fā)的影響

經(jīng)過2h培養(yǎng)后，病原菌分生孢子在培養(yǎng)液中均可萌發(fā)，結(jié)果如表1所示。

從表1可見，在蔗糖中的萌發(fā)率最高已超過50%，在葡萄糖中的萌發(fā)率低于無菌水；4h時分生孢子在葡萄糖、麥芽糖、無菌水中的萌發(fā)率均迅速上升，達50%以上，說明孢子萌發(fā)與培養(yǎng)時間正相關(guān)。在可溶性淀粉中的萌發(fā)率增長幅度僅8%左右，并落后于無菌水54.4%；6～8h時蔗糖、麥芽糖、葡萄糖中孢子萌發(fā)率均已超過90%，高于無菌水，但可溶性淀粉仍低于無菌水。

表1 碳源對分生孢子萌發(fā)的影響

實驗結(jié)果表明，2h時蔗糖中的萌發(fā)率最高，說明孢子最容易利用蔗糖，這可能是因為蔗糖參與的代謝途徑更多。由于分生孢子本身儲存一定的營養(yǎng)物質(zhì)，且實驗中營養(yǎng)液量少，所以除蔗糖外，其他外源碳源所起作用相差不大。4h后葡萄糖中萌發(fā)率增長顯著，說明在溶液充足時單糖也可明顯促進孢子萌發(fā)。4～8h，可溶性淀粉低于無菌水，推斷可溶性淀粉溶液可抑制該病原菌分生孢子萌發(fā)。由以上可知，金葉女貞黑斑病病原菌分生孢子更易容易利用單糖和雙糖，不易利用多糖。

2.3 氮源對分生孢子萌發(fā)的影響

在培養(yǎng)2h后，各種培養(yǎng)液中孢子均可萌發(fā)，實驗結(jié)果見表2。

表2 氮源對分生孢子萌發(fā)的影響

從表3可知，蛋白胨中的孢子萌發(fā)率43.6%最高，硝酸銨、硫酸銨、牛肉膏中的孢子萌發(fā)率與無菌水中的相近，其中硝酸銨培養(yǎng)液萌發(fā)率19.8%最低；4h后除硫酸銨中萌發(fā)率增長較慢外，其他幾組均迅速增加，其中牛肉膏、蛋白胨兩組有機氮源中的孢子萌發(fā)率較高，硝酸銨次之，硫酸銨反比無菌水低；6～8h間，萌發(fā)率增長趨勢與4h時一致。

結(jié)果表明，有機和無機氮源均能促進孢子萌發(fā)。其中有機氮源是金葉女貞黑斑病病原菌分生孢子最易利用的氮源。無機氮源中，硝酸銨高于硫酸銨，且硫酸銨低于對照組無菌水，說明銨態(tài)氮不易被分生孢子利用，可能會抑制分生孢子萌發(fā)。硝態(tài)氮中的萌發(fā)率初始也比無菌水低，4、6h時高于無菌水，推測開始時硝態(tài)氮的代謝途徑未被啟動，抑或是溶液的量過少不能滿足孢子萌發(fā)需要。

2.4 酸堿度對分生孢子萌發(fā)的影響

通過2h培養(yǎng)后，分生孢子萌發(fā)實驗結(jié)果如表3所示。

表3 不同pH值對分生孢子萌發(fā)的影響

從表3可見，在pH=5、7、9、11的培養(yǎng)液均有孢子萌發(fā)，pH=3的培養(yǎng)液中幾乎無孢子萌發(fā)，pH=9的萌發(fā)率最高，為9.32%；4h后pH=3中出現(xiàn)少量萌發(fā)的孢子，其他溶液中孢子萌發(fā)增多，其中pH=9、11的增長幅度大于pH=3、5；4～8h間pH=3中萌發(fā)率最低，且增長幅度很小，8h后才達5.88%，pH=7萌發(fā)率已達84.0%，此時間段萌發(fā)率的大小順序均為（pH=3）＜（pH=5）＜（pH=11）＜（pH=9）＜（pH=7）。

結(jié)果表明，金葉女貞黑斑病病原菌分生孢子在酸堿度為3～11的范圍內(nèi)均能萌發(fā)，其中pH=3時萌發(fā)率最低，pH=7時萌發(fā)率最高，即該病原菌分生孢子喜好中性或偏微堿性環(huán)境，酸性環(huán)境可抑制孢子萌發(fā)。

3 結(jié)論

金葉女貞黑斑病病原菌分生孢子萌發(fā)實驗表明，8種供試溶液中，在萌發(fā)早期，蔗糖與蛋白胨最易被利用。隨著培養(yǎng)時間的增加，單糖葡萄糖、雙糖麥芽糖都可促進孢子萌發(fā)，而多糖類可溶性淀粉可在一定程度上抑制孢子萌發(fā)；有機氮源牛肉膏、蛋白胨都可較明顯地促進金葉女貞黑斑病病原菌分生孢子萌發(fā)，硝態(tài)氮次之；銨態(tài)氮可在一定程度上抑制孢子萌發(fā)；對比碳源和氮源培養(yǎng)液中的萌發(fā)率，碳源比氮源對金葉女貞黑斑病病原菌分生孢子的萌發(fā)更有利；病原菌分生孢子在酸堿度為3～11的培養(yǎng)液中均可萌發(fā)，最適pH=7，喜好中性或偏微堿性環(huán)境，強酸性環(huán)境可抑制萌發(fā)。

花生黑斑病原菌分生孢子在葡萄糖、果糖、蔗糖、木糖中都可以萌發(fā)，其中1%蔗糖和木糖萌發(fā)效果較好；淀粉營養(yǎng)液卻使孢子萌發(fā)率比對照（水）低[7]，這些與金葉女貞黑斑病的分生孢子特性相似，但金葉女貞黑斑病的分生孢子喜好中性和偏微堿性的特性與花生黑斑病原菌喜好偏酸性環(huán)境[7]的特性相反。番茄早疫病菌分生孢子萌發(fā)最適pH=7[8]，與金葉女貞分生孢子特性相似。以上比較結(jié)果說明病原菌不同，分生孢子萌發(fā)最適碳源、氮源、pH會有差異，但濕度是影響多數(shù)病原菌孢子萌發(fā)的必要條件[9,10]，溫度一般最適為25℃，最適酸堿度接近中性。

由本實驗得出的結(jié)論可對金葉女貞黑斑病的防治提供一些理論依據(jù)，比如可以在病害發(fā)生時噴施酸性或含有NH4+的殺蟲劑，也許可有效抑制病原菌分生孢子的萌發(fā)；建立苗圃時可優(yōu)先考慮選擇偏酸性地塊，加強管理，從而有效防止該病害發(fā)生。由于時間和條件有限，病原菌分生孢子萌發(fā)所需要的其他環(huán)境因子如溫度、濕度、光照等所帶來的影響還有待進一步深入研究。

[1]觀賞園藝卷編輯委員會.中國農(nóng)業(yè)百科全書，觀賞園藝卷[M].北京:農(nóng)業(yè)出版社,1976.

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Ligustrum Alternaria Spores Germination Conditions and Morphology

Si Jie
(Xinyang Normal University Huarui College, Henan Xinyang 464000)

Ligustrum leaf spot caused by a large number of plant leaves, are an important class of diseases. In this study, paper ring leaf spot pathogen spore germination was induced to explore carbon, nitrogen, matrix pH and other ecological conditions on spore germination. The results showed that the tested four carbon sources, sucrose, glucose, maltose could promote spore germination, sucrose effect was relatively obvious, while soluble starch inhibit spore germination; four nitrogen sources tested beef extract peptone, ammonium nitrate could promote spore germination, two of which organic nitrogen was more effective, and ammonium sulfate inhibits spore germination.pH value in the range of 3～11 the pathogen spores could germinate the optimum pH of 7, conidia in neutral and slightly alkaline environment of high germination rate.

Ligustrum; Melasma; Spores; Germination rate

S436.6

A

2096-0387（2016）02-0031-03

司杰（1988-），女，河南信陽人，碩士研究生，助教，研究方向：微生物學(xué)。