孫亮

（遼寧師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，遼寧大連116081）

5，7，3’，4’-四甲氧基黃酮對(duì)囊性纖維化跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)節(jié)因子的激活作用

孫亮

（遼寧師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，遼寧大連116081）

囊性纖維化跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)節(jié)因子（CFTR），是一種受cAMP依賴的氯離子通道蛋白。CFTR在哺乳動(dòng)物呼吸道和胃腸道粘膜等多種與分泌和吸收相關(guān)的上皮細(xì)胞內(nèi)廣泛表達(dá)，對(duì)上皮細(xì)胞的液體轉(zhuǎn)運(yùn)、鹽類運(yùn)輸和離子濃度調(diào)節(jié)等具有重要的作用。CFTR功能障礙可能會(huì)引起諸如習(xí)慣性便秘等多種疾病。本實(shí)驗(yàn)利用細(xì)胞熒光淬滅方法測(cè)定了小分子黃酮類化合物5，7，3’，4’-四甲氧基黃酮對(duì)CFTR具有激活作用，為以CFTR作為分子靶標(biāo)，用5,7,3’,4’-四甲氧基黃酮治療CFTR相關(guān)疾病奠定了理論基礎(chǔ)。

CFTR；5，7，3’，4’-四甲氧基黃酮；激活劑；便秘

5，7，3’，4’-四甲氧基黃酮（5，7，3’，4’-Tetramethoxyflavone，TMF）屬于黃酮類化合物。黃酮類化合物廣泛存在于自然植物中，有抗腫瘤、抗炎等生物活性[1]。近年來發(fā)現(xiàn)，許多天然小分子黃酮類化合物能夠用來治療CFTR功能障礙引起的多種疾病。囊性纖維化跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)節(jié)因子（CFTR）在人和動(dòng)物中均有表達(dá)，尤其在具有分泌與吸收功能的組織中表達(dá)并扮演重要功能，如腸道、呼吸道等[2]。該實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)染了野生型CFTR和鹵族元素敏感熒光蛋白的大鼠甲狀腺上皮細(xì)胞對(duì)囊性纖維化跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)節(jié)因子的激活作用。

1 TMF對(duì)CFTR激活作用

1.1 TMF對(duì)CFTR氯離子通道具有激活作用

首先利用細(xì)胞熒光淬滅模型測(cè)定了TMF對(duì)野生型CFTR氯離子激活作用。實(shí)驗(yàn)時(shí)，先用100nM的Forskolin（FSK）使細(xì)胞內(nèi)的cAMP濃度達(dá)到正常生理水平，然后加入50μL不同濃度的待測(cè)化合物，利用Fluostar熒光儀進(jìn)行細(xì)胞熒光檢測(cè)，結(jié)果如圖1所示。

圖1 細(xì)胞熒光檢測(cè)結(jié)果

圖1表明，TMF能夠以劑量依賴的方式激活野生型CFTR氯離子通道，最大激活濃度為200μM。

1.2 TMF對(duì)CFTR氯離子通道激活作用的特異性分析

已有研究表明，CFTRinh-172和GlyH-101是CFTR的特異性抑制劑。因此，檢測(cè)在不同梯度的CFTRinh-172和GlyH-101存在下，TMF對(duì)野生型CFTR氯離子通道活性的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示。

圖2 TMF對(duì)野生型CFTR氯離子通道活性的影響

由圖2可見，兩種抑制劑均能夠有效抑制TMF對(duì)野生型CFTR氯離子通道的激活作用,且TMF對(duì)CFTR的激活作用與特異性抑制劑的濃度成正相關(guān)。

1.3 TMF對(duì)CFTR氯離子通道激活作用的動(dòng)力學(xué)和可逆性分析

動(dòng)力學(xué)和可逆性分析通過Fluostar間斷的時(shí)間測(cè)定，來判斷TMF發(fā)揮藥效及通道開放與時(shí)間的關(guān)系。動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)中，待細(xì)胞長滿后，棄掉培養(yǎng)基，用含鈣鎂離子的PBS清洗3次，馬上加入TMF，使其終濃度達(dá)到最大激活濃度200μM，不需要孵育，直接設(shè)置特定時(shí)間檢測(cè)點(diǎn)進(jìn)行測(cè)定，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示。

圖3 TMF對(duì)CFTR氯離子通道激活作用的動(dòng)力學(xué)和可逆性的影響

圖3表明，TMF對(duì)CFTR氯離子通道的激活作用具有時(shí)間依賴性，10min后能達(dá)到最大激活效果。可逆性分析實(shí)驗(yàn)中，加入藥物后將細(xì)胞在培養(yǎng)箱中孵育15min，將溶液甩掉加入含鈣鎂離子的PBS后，立刻測(cè)定，結(jié)果表明，在洗脫30min后，TMF對(duì)CFTR通道的激活作用完全消失。以上所有實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明，TMF對(duì)CFTR通道的激活作用具有快速、可逆的特點(diǎn)。

1.4 TMF對(duì)CFTR氯離子通道激活作用的機(jī)制分析

機(jī)制分析實(shí)驗(yàn)中用到了幾種CFTR特異性激活劑。為了探討其激活機(jī)制，檢測(cè)了在不同濃度FSK存在條件下，TMF對(duì)CFTR氯離子通道的作用，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示。

圖4 TMF對(duì)CFTR氯離子通道的作用影響

從圖4實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，TMF對(duì)CFTR氯離子通道的激活作用依賴于FSK。隨著FSK濃度的增加，激活作用增強(qiáng)；在不存在FSK情況下，高濃度的TMF仍能激活該通道。

相加效應(yīng)實(shí)驗(yàn)中用到了IBMX和FSK，并設(shè)置了陰、陽性對(duì)照。結(jié)果表明，F(xiàn)SK和IBMX最大限度地激活該通道時(shí)，TMF仍能進(jìn)一步促進(jìn)CFTR氯離子通道開放，即TMF對(duì)該氯離子通道的激活與FSK和IBMX存在顯著的相加作用。

同時(shí)，分析TMF與GEN的協(xié)同作用。在5μM FSK和50μM GEN同時(shí)存在時(shí)，TMF不能進(jìn)一步激活CFTR氯離子通道的開放，以及不存在協(xié)同作用。以上所有實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，TMF是通過提高CFTR磷酸化水平和直接與CFTR蛋白作用改變其構(gòu)像兩種途徑發(fā)揮激活作用的。

1.5 TMF對(duì)小鼠結(jié)腸短路電流分析

TMF對(duì)CFTR小鼠結(jié)腸短路電流實(shí)驗(yàn)中，用到了吲哚美辛和阿米洛利。吲哚美辛主要是為了抑制前列腺合成酶活性；阿米多利主要是抑制鈉離子通道的影響，防止鈉離子轉(zhuǎn)運(yùn)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。當(dāng)電流達(dá)到穩(wěn)定后，分別于結(jié)腸粘膜側(cè)和漿膜側(cè)按濃度梯度加入TMF，當(dāng)電流達(dá)峰值后，于粘膜側(cè)加入CFTRinh-172。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，無論是在粘膜側(cè)還是漿膜側(cè)，TMF均能顯著促進(jìn)跨小鼠結(jié)腸粘膜的短路電流，且這種激活作用呈現(xiàn)劑量依賴的關(guān)系。當(dāng)加入CFTR特異性抑制劑CFTRinh-172后，粘膜側(cè)和漿膜側(cè)被激活的短路電流均能被完全抑制。

2 結(jié)論

CFTR廣泛存在于與吸收和分泌相關(guān)組織的上皮細(xì)胞頂膜上，如消化道。CFTR氯離子通道的功能障礙能夠引起多種疾病。有研究表明，上皮細(xì)胞氯離子轉(zhuǎn)運(yùn)障礙可以導(dǎo)致腸液粘稠，水及電解質(zhì)會(huì)被過渡吸收，致使糞便中水分含量減少進(jìn)而引起習(xí)慣性便秘，激活CFTR氯離子通道能夠促進(jìn)腸道液體的分泌進(jìn)而能夠治療習(xí)慣性便秘。本研究中的黃酮類化合物TMF在離體實(shí)驗(yàn)中顯示，能夠刺激小鼠結(jié)腸粘膜短路電流的提升，也就是說能夠刺激腸道氯離子跨CFTR通道轉(zhuǎn)運(yùn)。因此，CFTR也可能是TMF黃酮類化合物治療習(xí)慣性便秘的靶點(diǎn)。

5，7，3'，4'-tetramethoxy-flavonoid on the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Activation Factor

Sun Liang
(College of Life Science, Liaoning Normal University, Liaoning Dalian 116081)

Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR), is a cAMP-dependent chloride ion channel protein, CFTR is widely expressed in the epithelial cells of the respiratory tract, gastrointestinal tract and other secretory and absorptive cells, it has an important role in the liquid transport, salt transport and ion concentration regulation of epithelial cells. CFTR dysfunction may cause a variety of diseases, such as habitual constipation. This experiment using cell fluorescence quenching quenching method for the determination of small molecules of flavonoid compounds 5, 7, 3 ', 4' - tetramethoxy flavone on CFTR has activation, to CFTR as target molecules. 5,7,3 ', 4' - tetramethoxy flavone for CFTR related diseases has laid a theoretical basis.

CFTR; 5,7,3 ', 4'- tetramethoxysilane flavonoids; Activator; Constipation

X173

A

2096-0387（2016）02-0017-03

孫亮（1990-），男，遼寧葫蘆島人，碩士研究生，研究方向：氯離子通道化學(xué)生物學(xué)。

[1]王曉,吳龍火,黃曉平,等.黃酮類化合物的抗癌機(jī)制[J].中國民族民間醫(yī)藥,2009,18(22):1-3.

[2]Vergani Paola, Lockless Steve W, Nairn Angus C, et al. CFTR channel opening by ATP-driven tight dimerization of its nucleotide-binding domains[J]. Nature, 2005, 433(7028):876-880.