陳永衡，李建明

1.長沙醫(yī)學(xué)院臨床學(xué)院，湖南長沙 410219；2.長沙醫(yī)學(xué)院研究中心，湖南長沙 410219

AD大鼠模型腦血管淀粉樣變性的病理學(xué)改變研究

陳永衡1，李建明2

1.長沙醫(yī)學(xué)院臨床學(xué)院，湖南長沙 410219；2.長沙醫(yī)學(xué)院研究中心，湖南長沙 410219

目的 研究建立阿爾茨海默氏病（AD）豚鼠模式的腦血管淀粉樣變性的病理學(xué)改變特征。方法 于2016年3月在長沙醫(yī)學(xué)院選取50只成年豚鼠（以下簡稱大鼠）作為該次實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，隨機(jī)均分為對照組與AD組，對照組20只，AD組30只；將AD組30只大鼠建立阿爾茨海默氏病模型；采取水迷宮試驗(yàn)觀察AD組大鼠高級認(rèn)知功能的改變情況；采取剛果紅染色法及HE染色法觀察淀粉樣蛋白于阿爾茨海默氏病大鼠腦內(nèi)的沉積情況及淀粉樣變性的腦血管病理改變情況。結(jié)果 AD組12周時(shí)大鼠找到安全平臺(tái)的用時(shí)為（20.09±7.16）s，顯著長于 4周時(shí)（12.31±2.17）s的所用時(shí)間，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.01；4、12周時(shí)AD組大鼠找到安全平臺(tái)的用時(shí)分別為（12.31±2.17）s及（20.09±7.16）s均顯著長于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.01。AD組大鼠12周探索安全平臺(tái)（1.87±0.62）次明顯少于該組4周時(shí)（2.41±0.73）次，P＜0.05；4、12周AD組大鼠探索平臺(tái)的次數(shù)分別為（2.41±0.73）次及（1.87±0.62）次均顯著少于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.01。染色試驗(yàn)AD組海馬區(qū)的顆粒細(xì)胞明顯減少，細(xì)胞可見變性，膠質(zhì)細(xì)胞明顯異常增殖，海馬內(nèi)的小血管壁發(fā)生變性。剛果紅染色試驗(yàn)可見Aβ纖維于小血管壁處逐漸沉積，管壁顯示增厚，小血管發(fā)生狹窄、閉塞。結(jié)論 腦血管的淀粉樣變性是AD的主要病理改變，在無干預(yù)的前提下淀粉樣變性所致病理改變隨之時(shí)間延長而加重，AD模型的認(rèn)知功能隨之降低。

阿爾茨海默氏病；動(dòng)物模型；淀粉樣變性

阿爾茨海默氏?。ˋD）是一種以進(jìn)行性的認(rèn)知功能降低及行為功能障礙為主要特點(diǎn)的中樞神經(jīng)功能退行性病理改變。其病理特征表現(xiàn)為大腦皮層及海馬組織可見β淀粉樣蛋白（Aβ）匯聚組成老年斑（SP）[1-3]。目前，淀粉樣變性的腦血管病變（CAA）被認(rèn)為是AD的典型性病理特征，在AD的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著關(guān)鍵性作用。由于AD的發(fā)病機(jī)制尚不完全明確，因此研究CAA的病理變化機(jī)制對于了解AD的發(fā)生及進(jìn)展具有重要作用，可為AD的預(yù)防及早期診斷治療提供新的靶向性指導(dǎo)。該次研究于2016年3月選擇能產(chǎn)生與人類等同的淀粉蛋白的自然動(dòng)物豚鼠30只，以立體定向性雙側(cè)海馬組織內(nèi)注射Aβ纖維的方法建立AD動(dòng)物模型，力求以最為接近人類的模型，研究淀粉樣蛋白沉積在腦組織中的規(guī)律及對認(rèn)識(shí)功能的改變。

1 資料與方法

1.1 一般資料

于2016年3月選取50只成年健康雄性豚鼠（下簡稱大鼠）作為該次研究用動(dòng)物。將全部大鼠隨機(jī)分對照組與AD組，對照組20只，AD組30只；體重均為350～420 g；兩組大鼠一般資料差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

1.2 方法

1.2.1 建立動(dòng)物模型 制備Aβ纖維，將Aβ粉末充分溶解于完全滅菌的PBS溶液當(dāng)中，按1 μg/μL比例配備為混懸液，將配制完成的Aβ混懸液置于37℃的水浴恒溫?fù)u床上，持續(xù)振蕩水浴7 d，熟化為Aβ纖維。建立動(dòng)物模型，將AD組大鼠以10%的水合氯醛（20090922）3 mL/kg，行腹腔注射麻醉；將大鼠固定于定位儀上。于大鼠的頭頂部常規(guī)備皮、消毒。沿頭頂部的正中線作一3 cm手術(shù)切口，以雙氧水（國藥準(zhǔn)字H13022648）對骨膜進(jìn)行腐蝕。以前囟后2.5 mm、深3.2 mm為靶點(diǎn)，于靶點(diǎn)兩側(cè)各開2 mm。使用10 μL的微量注射器依1 μL/min的速度向靶點(diǎn)內(nèi)緩慢推注Aβ纖維，5 μL/側(cè)，留針靜置10 min，緩慢拔除注射針。逐層縫合，消毒、抗感染。兩組大鼠給予同樣的飼養(yǎng)方式，包括活動(dòng)、飲食等。

1.2.2 Morris水迷宮試驗(yàn) 建模手術(shù)4周后，觀察30只手術(shù)大鼠恢復(fù)情況，選取20只恢復(fù)情況最佳的大鼠納入AD組行水迷宮試驗(yàn)，其余10只AD組大鼠分別于建模后1、2、4周及12周時(shí)制作腦組織切片，觀察AD病理改變過程。兩組大鼠均于建模4周后及12周后進(jìn)行水迷宮試驗(yàn)，試驗(yàn)第1～5天對兩組大鼠進(jìn)行安全相關(guān)內(nèi)容的訓(xùn)練，將依次從4個(gè)象限放入水中，引導(dǎo)大鼠找到位于水下的平臺(tái)，并記錄尋找過程的時(shí)間；以4個(gè)象限為1個(gè)訓(xùn)練單位，每只大鼠每日訓(xùn)練4個(gè)單位。定位航行試驗(yàn)，第6天時(shí)將大鼠從訓(xùn)練過的某一個(gè)固定象限放入水中，記錄大鼠找到水下平臺(tái)的用時(shí)，試驗(yàn)規(guī)定時(shí)間為120 s，如在規(guī)定時(shí)間內(nèi)未能找到平臺(tái)則將結(jié)果記為120 s，連續(xù)測試4次，每次均選擇不同固定象限，取4次試驗(yàn)均值?？臻g探索試驗(yàn)，于定位航行試驗(yàn)結(jié)束后，次日將水下安全平臺(tái)移除，將大鼠從訓(xùn)練過的某一固定象限放入水中，記錄大鼠在120 s內(nèi)正確的探索平臺(tái)次數(shù)。

1.2.3 腦組織觀察 全部大鼠完成試驗(yàn)后，以冰凍的多聚甲醛 （20130805）4%溶液及生理鹽水經(jīng)心臟進(jìn)行灌注，切下大鼠頭顱取腦組織，以4%的多聚甲醛溶液固定24 h。以梯度蔗糖溶液進(jìn)行脫水，液氮速凍后使用冰凍切片機(jī)按6 μm厚度行連續(xù)切片。以梯度酒精進(jìn)行脫水，行HE常規(guī)染色，經(jīng)二甲苯做透明化處理后使用中性樹膠將切片封片。以蘇木素行1 min染色用自來反復(fù)水沖洗1 min，使用1%的醋酸酒精行n秒分化，再用自來反復(fù)水沖洗1min，自來水至60℃返藍(lán)30 min，使用甲醇剛果紅行染色25 min，0.1%的堿性酒精行n秒分化，以梯度酒精進(jìn)行脫水，二甲苯行透明處理后以中性樹膠進(jìn)行封片。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法

將水迷宮試驗(yàn)結(jié)果使用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。進(jìn)行對比分析，計(jì)量資料采取均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采取t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用[n(%)]表示，采取χ2檢測；雙側(cè)檢驗(yàn)值為α=0.05，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 水迷宮定位航行試驗(yàn)

對照組4周時(shí)與12周時(shí)大鼠找到安全平臺(tái)的用時(shí)無明顯變化，P＞0.05。AD組12周時(shí)大鼠找到安全平臺(tái)的用時(shí)為（20.09±7.16）s，顯著長于4周時(shí)（12.31±2.17）s的所用時(shí)間，P＜0.01；4、12周時(shí)AD組大鼠找到安全平臺(tái)的用時(shí)分別為（12.31±2.17）s及（20.09±7.16）s均顯著長于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。具體數(shù)據(jù)見表1。

表1 定位航行試驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)計(jì)對比表[(±s),秒]

表1 定位航行試驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)計(jì)對比表[(±s),秒]

組別 4周 12周 t P對照組（n=20）AD組（n=30）0.444 4.650＞0.05＜0.01 tP 7.97±2.52 12.31±2.17 5.836＜0.01 7.62±2.47 20.09±7.16 7.363＜0.01

2.2 水迷宮空間探索試驗(yàn)

對照組大鼠4、12周時(shí)探索安全平臺(tái)的次數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＞0.05。AD組大鼠 12周探索安全平臺(tái)（1.87±0.62）次明顯少于該組 4周時(shí)（2.41±0.73）次，P＜0.05；4、12周AD組大鼠探索平臺(tái)的次數(shù)分別為（2.41± 0.73）次及（1.87±0.62）次均顯著少于對照組，P＜0.01，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。具體數(shù)據(jù)見表2。

表2 空間探索試驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)計(jì)對比表[(±s),次]

表2 空間探索試驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)計(jì)對比表[(±s),次]

組別 4周 12周 t P對照組（n=20）AD組（n=30）＞0.05＜0.05 3.51±0.71 1.87±0.62 7.781＜0.01 3.97±1.02 2.41±0.73 5.562＜0.01 1.655 2.521 tP

2.3 HE腦組織染色

HE染色后AD組大鼠的腦組織切片海馬區(qū)的顆粒細(xì)胞、錐體細(xì)胞明顯減少，神經(jīng)元病變，膠質(zhì)細(xì)胞可見異常增殖，海馬內(nèi)的小血管壁病變，典型表現(xiàn)見圖1；HE染色后對照組無明顯變性見圖2。

2.4 剛果紅腦組織染色

剛果紅染色后，于顯微鏡下可見AD組大鼠腦的組織內(nèi)、腦血管壁處均可見橘紅色的無結(jié)構(gòu)均一性淀粉樣物質(zhì)沉淀，典型表現(xiàn)見圖3；于偏振光型顯微鏡下其呈果綠色的雙折光成像，典型表現(xiàn)見圖4；對照組的剛果紅染色無此類病變發(fā)生。剛果紅染色AD組大鼠建模后1周時(shí)腦組織內(nèi)未見明顯的淀粉樣物質(zhì)沉積，2周時(shí)于海馬小血管的周圍腦組織處可見淀粉樣物質(zhì)沉積，4周時(shí)于小血管周圍處可見淀粉樣物質(zhì)沉積，12周時(shí)可見大量的淀粉樣物質(zhì)沉積于小血管壁處，管壁明顯增厚，小血管可見狹窄或者阻塞，典型表現(xiàn)見圖5。

圖1 AD組大鼠腦組織HE染色切片

圖2 對照組大鼠腦組織HE染色切片

圖3 顯微鏡下AD組淀粉樣物質(zhì)沉淀

圖4 偏振光下AD組淀粉樣物質(zhì)沉淀

圖5 AD組大鼠隨時(shí)間推移淀粉樣物質(zhì)沉積演進(jìn)過程（從左至右為建模手術(shù)后1、2、4、12周）

3 討論

Aβ是含有39～43個(gè)氨基酸的一種可溶性多肽，在病理狀況中Aβ多肽可以以多肽鏈中的β片狀折疊的方式匯聚成為不溶性的Aβ纖維，極易于腦組織中沉淀積聚為淀粉樣的斑塊，這種病理改變過程被認(rèn)為是AD發(fā)生的一項(xiàng)主要誘因[4-6]。AD的病理改變特征主要可見Aβ積聚組成的SP、Tau蛋白的異常積聚導(dǎo)致的神經(jīng)元丟失、纖維糾纏結(jié)以及突觸減少，另外CAA已被認(rèn)為是AD病理學(xué)改變另一主要特征。約有94%左右的AD患者于腦毛細(xì)血管壁處見有Aβ纖維的異常沉積所構(gòu)成的CAA病變[7-9]。在無AD的同齡人群當(dāng)中CAA改變的發(fā)生率僅為10%～40%左右。因此CAA可以視為AD患者腦組織中Aβ纖維異常沉積所致的腦組織嚴(yán)重性局部病理改變，可導(dǎo)致腦組織中微小血管通透性升高，最終致使腦血管壁發(fā)生纖維蛋白性壞死、狹窄，腦的血流量因此顯著降低，形成癡呆癥狀的發(fā)生。

該研究中，通過進(jìn)行水迷宮試驗(yàn)證明，AD大鼠4周時(shí)與12周時(shí)的認(rèn)知功能出現(xiàn)顯著變化，4周時(shí)找到安全平臺(tái)的用時(shí)為 （12.31±2.17）s，探索安全平臺(tái)的次數(shù)為（2.41±0.73）次；12周時(shí)找到安全平臺(tái)的用時(shí)為 （20.09± 7.16）s，探索安全平臺(tái)的次數(shù)為（1.87±0.62）次；說明12周時(shí)AD大鼠的認(rèn)識(shí)功能顯著降低。呂田明[10]的定位航行試驗(yàn)結(jié)果為AD大鼠4周時(shí)找到安全平臺(tái)的用時(shí)為（12.28± 2.09）s，12周時(shí)找到安全平臺(tái)的用時(shí)為 （20.08±7.18）s，與該次研究結(jié)果近似。通過對AD大鼠進(jìn)行腦組織切片染色我們發(fā)現(xiàn)，AD大鼠腦組織中淀粉樣蛋白的積聚是一個(gè)慢性進(jìn)展過程，提示對于AD患者盡早診斷盡早治療對于阻止或延緩患者認(rèn)識(shí)功能障礙的發(fā)生及程度具有關(guān)鍵性作用。

綜上所述，腦組織中的淀粉樣蛋白變性是AD的重要病理改變癥狀，這一病理改變過程是一項(xiàng)緩慢的演進(jìn)過程，因此對AD患者于疾病早期給予有效治療可有效減輕AD導(dǎo)致的認(rèn)知功能障礙，對于預(yù)防或減輕老年癡呆具有重要意義。提示臨床上應(yīng)在高危老年群體中開展AD篩查以提高該病的早期診斷率。從理論上說，阻斷Aβ纖維異常沉積形成CAA的過程能夠成為阻斷癡呆發(fā)生的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，這一點(diǎn)有待于開展進(jìn)一步相關(guān)研究加以論證。

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Pathological Changes of Cerebral Vascular Amyloidosis in AD Rat Model

CHEN Yong-heng1,LI Jian-ming2
1.Changsha Medical College Institute of Clinical,Changsha,Hunan Province,410219 China 2.Changsha Medical College Research Center,Changsha,Hunan Province,410219 China

Objective Develop alzheimer's disease(AD),guinea pig model of cerebrovascular pathological change characteristic of amyloidosis.Methods In March 2016 in changsha medical school select 50 guinea pigs (hereinafter referred to as"rats")as the experimental animals,randomly divided into control group and theAD group and the control group of 20,30 AD group;The AD group and 30 alzheimer's disease model in rats;Take the water maze test to observe the AD group rats high-level cognitive function;in the case of a change Take Congo red staining and HE staining observation of amyloid protein in alzheimer's disease in rats of deposition and cerebrovascular pathological changes of amyloidosis.Results AD group 12 weeks to find a safe platform for the time of （20.09± 7.16）seconds,significantly longer than 4 weeks of（12.31±2.17）seconds of time,P＜0.01;4,12 weeks when the AD group to find a safe platform with time Respectively,（12.31±2.17）seconds and（20.09±7.16）seconds were significantly longer than the controlgroup,P＜0.01.Group AD rats 12 weeks to explore the security platform of（1.87±0.62）times significantly less than the group for 4 weeks at（2.41±0.73）times,P＜0.05.and that of AD group was（2.41±0.73）times,P＜0.05；（1.87±0.62）times were significantly less than the control group,P＜0.01.staining test of AD group in hippocampus decreased significantly visible,cell degeneration,glial cell abnormal proliferation,vascular wall degeneration in the hippocampus.Congo red staining test showed A beta fibers in the wall of small vessels gradually deposited,wall thickened,small vascular stenosis and occlusion.Conclusions Cerebrovascular amyloidosis is the main pathological change in AD.Under the premise of no intervention by amyloidosis

Alzheimer's disease;Animal model;Amyloidosis

R749.16

A doi 10.11966/j.issn.2095-994X.2016.02.04.05

2016-10-11；

2016-11-05

湖南省科技計(jì)劃項(xiàng)目（2015JC3059）。

陳永衡（1979.10-），男，湖南衡陽人，碩士，副教授,研究方向：診斷學(xué)教學(xué)、心血管疾病治療。

李建明（1975.9-），男，湖南漣源人，博士，副教授，研究方向：血管病變與神經(jīng)退變，E-mail:ljming0901@sina.com。