卜文靜， 段秋虹， 杜金宇，王 毅，隋繼學(xué)

(1.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院能源與動(dòng)力工程系，河南 鄭州 450011； 2.鄭州科技學(xué)院, 河南 鄭州 450062； 3.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)機(jī)電工程學(xué)院，河南 鄭州 450002)

耐高溫釀酒酵母菌株的選育

卜文靜1， 段秋虹2， 杜金宇1，王 毅3，隋繼學(xué)1

(1.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院能源與動(dòng)力工程系，河南 鄭州 450011； 2.鄭州科技學(xué)院, 河南 鄭州 450062； 3.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)機(jī)電工程學(xué)院，河南 鄭州 450002)

以釀酒酵母L為研究對(duì)象，通過紫外誘變、高溫馴化處理的方法，選育出1株耐高溫釀酒酵母L-9a。研究結(jié)果表明：處理a在38 ℃條件下，L-9a生物量為106 mg，乙醇產(chǎn)率為53.02%，平均產(chǎn)量為1.71 mL·100 mL-1，殘還原糖含量平均為0.76 g·100 mL-1，解決了同步糖化發(fā)酵中糖化和發(fā)酵溫度不一致的問題。

生物乙醇；生物質(zhì)；釀酒酵母；耐高溫酵母

隨著全球環(huán)境的惡化及能源危機(jī)的加劇，越來越多的國家開始關(guān)注能源問題。乙醇作為一種清潔的可再生能源，可用作液體燃料替代或部分替代汽油，不但可減少汽油的用量，還可減少環(huán)境污染[1-2]。纖維素類廢棄物等轉(zhuǎn)化為燃料乙醇已成為解決世界能源危機(jī)的一條理想途徑，由于其不消耗糧食，不與糧爭(zhēng)地，受到世界各國政府支持和科研工作者的廣泛關(guān)注[3-4]。雖然很多微生物可應(yīng)用于生產(chǎn)乙醇，但釀酒酵母仍然是首選菌株[5]，它的發(fā)酵能力已經(jīng)被證明比細(xì)菌更強(qiáng)，且更加耐乙醇和木質(zhì)纖維素在水解中出現(xiàn)的抑制劑[6]。20世紀(jì)70 年代，一些學(xué)者在研究纖維素發(fā)酵產(chǎn)乙醇的過程中，為了防止糖積累和終產(chǎn)物抑制，進(jìn)而提高纖維素酶的催化水解效率, 提出了同步糖化發(fā)酵(Simultaneous Saccharification and Fermentation, SSF)模式，受到了廣泛重視[7]。然而，SSF 中一個(gè)最重要的問題就是最佳酶解溫度(45～ 50 ℃)和乙醇發(fā)酵溫度(25～35 ℃)不協(xié)調(diào)[8]，這使得酵母菌的發(fā)酵與纖維素的酶解難以同步進(jìn)行，因此選育耐高溫酵母菌是解決這一問題的關(guān)鍵[9]。釀酒酵母對(duì)生活條件的變化有較強(qiáng)的適應(yīng)能力，并且隨著外界環(huán)境的變化，其群體能迅速產(chǎn)生變異，這為耐高溫酵母的選育提供了可能[10]。田沈等[11]經(jīng)高溫馴化得到一株麥芽糖假絲酵母菌株Y8，該菌株在46 ℃下進(jìn)行纖維乙醇的同步糖化發(fā)酵，最終乙醇質(zhì)量濃度為13.93 g·L-1。徐大鵬等[12]篩選出1株耐高溫酵母，在41 ℃、初始糖質(zhì)量濃度93 g·L-1的條件下，乙醇產(chǎn)率為93%。KWON等[13]利用IssatchenkiaorientalisIPE100 在42 ℃條件下進(jìn)行甜高粱稈固態(tài)發(fā)酵，乙醇轉(zhuǎn)化率達(dá)到理論值的90.9%；發(fā)酵玉米秸稈蒸汽爆破水解液時(shí)，乙醇產(chǎn)量可以達(dá)到理論產(chǎn)值的93.8%[14]。劉秀穎等[15]通過化學(xué)誘變和遺傳重組方法獲得的重組釀酒酵母T44-2，40 ℃和43 ℃發(fā)酵時(shí)，乙醇產(chǎn)量分別達(dá)到91.2 g·L-1和69.2 g·L-1。使用耐高溫酵母不僅能降低水電的消耗，充分利用已有設(shè)備，而且可以降低染菌機(jī)率、縮短發(fā)酵周期、提高發(fā)酵率[9]，這將對(duì)提高發(fā)酵性能和降低生產(chǎn)成本具有重要意義。因此，本研究以釀酒酵母L為出發(fā)菌株，選育出1株耐高溫且發(fā)酵性能強(qiáng)的酵母菌株。

1 材料與方法

1.1酵母菌種

釀酒酵母(Saccharomycescerevisae)由沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)生物環(huán)境與能源工程試驗(yàn)室提供，該酵母最適生長(zhǎng)溫度為30 ℃，最適發(fā)酵溫度為32 ℃。

1.2培養(yǎng)基及其相關(guān)溶液

1.2.1 YPD液體培養(yǎng)基 20 g·L-1葡萄糖，5 g·L-1酵母提取物，1 g·L-1KH2PO4，0.3 g·L-1NH4Cl，2 g·L-1MgSO4·7H2O。

1.2.2 YPD固體培養(yǎng)基 20 g·L-1葡萄糖，20 g·L-1瓊脂，5 g·L-1蛋白胨，5 g·L-1MgSO4·7H2O。

1.2.3 葡萄糖馴化培養(yǎng)基 50 g·L-1葡萄糖糖，5 g·L-1酵母提取物，1 g·L-1KH2PO4，0.3 g· L-1NH4Cl，2 g·L-1MgSO4·7H2O。

1.2.4 發(fā)酵培養(yǎng)基 50 g·L-1葡萄糖，5 g·L-1蛋白胨，5 g·L-1酵母提取物，1 g·L-1KH2PO4，0.3 g·L-1NH4Cl，2 g·L-1MgSO4·7H2O，pH值5.0，于121 ℃滅菌30 min，備用。

0.9%的NaCl溶液，2%的二水合檸檬酸鈉次甲基藍(lán)溶液：0.01 g的次甲基藍(lán)、2 g的二水合檸檬酸三鈉，加蒸餾水，定容至100 mL。

1.3誘變與篩選

1.3.1 菌體前期處理 在50 mL液體培養(yǎng)基中接入活化斜面上的酵母L，在30 ℃條件下振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。取10 mL細(xì)胞培養(yǎng)液，3 500 r·min-1條件下離心10 min后，棄上清液，用10 mL無菌水離心洗滌2次去除雜質(zhì)后，再用生理鹽水將其制成2×107個(gè)·mL-1的細(xì)胞懸液備用。

1.3.2 紫外誘變 取上述處理后得到的細(xì)胞菌懸液，分別倒入預(yù)先滅菌的直徑90 mm的8個(gè)培養(yǎng)皿中，每皿5 mL，分別照射10、20、30、40、50、60、70、80 s，每組做3個(gè)平行試驗(yàn)，依次蓋上皿蓋，測(cè)定出紫外照射時(shí)間與酵母細(xì)胞致死率之間的關(guān)系，確定適當(dāng)照射時(shí)間。在獲得照射時(shí)間的基礎(chǔ)上，用無菌吸管吸取1 mL菌懸液用生理鹽水稀釋至10倍，取2.5 mL涂于YPD固體培養(yǎng)基平板上，誘變后的培養(yǎng)皿放于30 ℃的電熱恒溫培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)3 d，備用。

1.3.3 篩選 挑取紫外誘變后生長(zhǎng)良好，且直徑較大的菌落，接種于YPD固體斜面培養(yǎng)基上，30 ℃下培養(yǎng)24 h，用于酵母的復(fù)篩。

將活化的初篩菌種接種于YPD液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24 h，達(dá)到2×108個(gè)·mL-1的菌體濃度。在發(fā)酵培養(yǎng)基中，按10%接種量接種，32 ℃、180 r·min-1進(jìn)行發(fā)酵，以出發(fā)菌株L為對(duì)照菌株，每株設(shè)3個(gè)重復(fù)，60 h后對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行分析[16-17](乙醇產(chǎn)量、殘還原糖含量、糖醇轉(zhuǎn)化率)，篩選出性能較為優(yōu)良的菌株。

1.4高溫馴化處理

將篩選出的優(yōu)勢(shì)菌株接種于YPD固體培養(yǎng)基上，分別放在32、36、38、40 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中隔離培養(yǎng)24 h，觀察其生長(zhǎng)狀況，以生物量和乙醇產(chǎn)率為指標(biāo)來進(jìn)行評(píng)價(jià)[18]。在38 ℃時(shí)，乙醇產(chǎn)率至少在50%的菌株將進(jìn)行漸進(jìn)式(a處理)和熱沖擊式(b處理)2種馴化處理[19]。

以漸進(jìn)式馴化耐高溫酵母菌株在馴化培養(yǎng)基中進(jìn)行，共分為2個(gè)階段：第1個(gè)階段是從38 ℃至44 ℃每隔24 h進(jìn)行1步，共進(jìn)行6步；第2個(gè)階段是從44 ℃至46 ℃每隔12 h進(jìn)行1步，共進(jìn)行4步。

以熱沖擊式馴化耐高溫酵母需要進(jìn)行3個(gè)周期。把釀酒酵母暴露在50 ℃的高溫中30 min,然后在38 ℃保持15 min，如此進(jìn)行3次循環(huán)。

將馴化后得到的釀酒酵母接種于YPD固體培養(yǎng)基上，分別把它們放在36、38、40 ℃下隔離培養(yǎng)24 h，觀察其生長(zhǎng)情況。將生長(zhǎng)良好的菌株以10%接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，通過測(cè)定在38 ℃和40 ℃下的生物量和乙醇產(chǎn)率，從a處理和b處理中挑選出優(yōu)勢(shì)菌株，制成種子液，保存以備用。

1.5目的菌株與出發(fā)菌株發(fā)酵能力及產(chǎn)乙醇能力比較

在a處理和b處理中分別選擇出來在40 ℃時(shí)生長(zhǎng)且產(chǎn)乙醇的菌株在發(fā)酵培養(yǎng)基中單獨(dú)培養(yǎng)，利用排水法[20-21]測(cè)量在38 ℃36 h之內(nèi)酵母發(fā)酵時(shí)的產(chǎn)氣量來測(cè)定其發(fā)酵力，發(fā)酵結(jié)束后測(cè)定發(fā)酵液中的乙醇產(chǎn)量及殘還原糖含量。

2 結(jié)果與分析

2.1紫外誘變育種

2.1.1 紫外誘變殺菌曲線的繪制 微生物紫外誘變的最佳照射時(shí)間是當(dāng)微生物的致死率在70%～75%時(shí)。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的酵母細(xì)胞用紫外線照射，以照射時(shí)間(10、20、30、40、50、60、70、80、90、100 s)為橫坐標(biāo)，致死率為縱坐標(biāo)，繪制釀酒酵母L誘變時(shí)間與致死率之間的關(guān)系曲線(圖1)。

圖1 紫外照射時(shí)間與酵母L致死率曲線圖Fig.1 Curve of irradiation time by UV and death ratio of yeast L

由圖1可以看出，紫外線照射時(shí)間越長(zhǎng)，酵母細(xì)胞致死率越大。當(dāng)酵母細(xì)胞照射40 s時(shí)，致死率72.3%，因此本試驗(yàn)采用對(duì)酵母L進(jìn)行紫外照射40 s。照射后的酵母作適當(dāng)稀釋后涂布平皿，放在30 ℃的電熱恒溫培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)3 d后，共有單菌落75株。

2.1.2 初篩 紫外誘變后的75株單菌落，其中有15株生長(zhǎng)良好且直徑較大，因此把它們作為復(fù)篩出發(fā)菌株。

2.1.3 搖瓶復(fù)篩 將初篩得到的15株酵母菌株活化后，以10%的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基。在32 ℃、180 r·min-1條件下進(jìn)行乙醇發(fā)酵，以釀酒酵母L作為對(duì)照，每株3個(gè)重復(fù)，取平均值，60 h后對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行乙醇產(chǎn)量、殘還原糖含量、糖醇轉(zhuǎn)化率分析(表1)。

表1 菌株發(fā)酵搖瓶復(fù)篩結(jié)果Table1 Results of flask-shaking fermentation by recreening

2.2耐高溫酵母選育

2.2.1 高溫馴化前篩選 從復(fù)篩試驗(yàn)結(jié)果可知，菌株L-2、L-3、L-5、L-7、L-9、L-10、L-11、L-13和L-14(共9株)，發(fā)酵產(chǎn)乙醇能力較強(qiáng)，殘還原糖含量較低，糖醇轉(zhuǎn)化率也較高。它們分別接種于32、36、38、40 ℃下YPD固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，24 h后，觀察其生長(zhǎng)情況(表2)。

表2 在培養(yǎng)皿中復(fù)篩酵母的生長(zhǎng)情況Table 2 Growth on petri dishes for yeasts submitted to thermal acclimatization

注：+：生長(zhǎng)，±：弱生長(zhǎng)，-：不生長(zhǎng)。

Note: + : growth, ±：weak growth, -: don’t grow.

從表2可以看出，所有菌株都能在32 ℃下生長(zhǎng)，菌株L-3、L-5、L-7、L-9、L-10、L-13和L-14能在36 ℃下生長(zhǎng)，菌株L-3、L-5、L-7、L-9、L-10和L-13能在38 ℃下生長(zhǎng)，沒有菌株能在40 ℃下生長(zhǎng)。生長(zhǎng)在38 ℃下培養(yǎng)基中的菌株被接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，分別測(cè)量在36、38、40 ℃下發(fā)酵48 h后生物量和乙醇產(chǎn)率，如圖2所示。

a：在36 ℃下生物量和乙醇產(chǎn)率，b：在38 ℃下生物量和乙醇產(chǎn)率，c：在40 ℃下生物量和乙醇產(chǎn)率。a：Biomass and ethanol production at 36 ℃, b：Biomass and ethanol production at 38 ℃, c：Biomass and ethanol production at 40 ℃.

在36 ℃時(shí)，所有菌株都有相似的生物量(90～145 mg)和乙醇產(chǎn)率(49%～62%)。在38 ℃時(shí)，各菌株被分為3組：(1)菌株L-5、L-7和L-9生物量為95～115 mg，乙醇產(chǎn)率約為51%；(2)菌株L-3和L-13生物量大約為70 mg，乙醇產(chǎn)率約為50%；(3)菌株L-10，生物量為25 mg，乙醇產(chǎn)率為12.25%。它們之間的差異可能是因?yàn)樵谧贤庹T變過程中改變了其基因組成[22]。在40 ℃時(shí)，只有菌株L-9生物量達(dá)到50 mg左右，乙醇產(chǎn)率大約為35%，其余菌株幾乎都不能生長(zhǎng)。因此，菌株L-3、L-5、L-7、L-9和L-13可以通過高溫馴化處理來提高它們產(chǎn)乙醇的能力。

2.2.2 高溫馴化處理 在38 ℃下，乙醇產(chǎn)率超過50%的菌株L-3、L-5、L-7、L-9和L-13以相同的接種量接入馴化培養(yǎng)基中進(jìn)行a處理和b處理2個(gè)不同的熱處理過程。處理后，它們分別接種于YPD固體培養(yǎng)基中，放置于36、38、40 ℃下隔離培養(yǎng)，觀察其生長(zhǎng)情況，結(jié)果見表3。

在36 ℃下，2種熱處理的菌株L-3、L-5、L-7、L-9和L-13都能生長(zhǎng)；在38 ℃下，經(jīng)過a處理的菌株L-3、L-5、L-7和L-9和b處理的菌株L-3和L-9能生長(zhǎng)；在40 ℃下，經(jīng)過a處理的菌株L-3、L-5和L-9能生長(zhǎng)、L-7能弱生長(zhǎng)，經(jīng)過b處理的5株菌株均不能生長(zhǎng)。把經(jīng)過2種熱處理后的5株菌株以10%的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，分別放置于38 ℃和40 ℃下發(fā)酵48 h后，測(cè)得其生物量和乙醇產(chǎn)率，結(jié)果見圖3所示。

表3 在培養(yǎng)皿中不同熱處理馴化的酵母生長(zhǎng)狀況Table 3 Growth on petri dishes for yeasts submitted to thermal acclimatization

注：+：生長(zhǎng)，±：弱生長(zhǎng)，-：不生長(zhǎng)。

Note: +:growth,±：weak growth,-:don’t grow.

在38 ℃時(shí)，經(jīng)過a處理得到的結(jié)果：發(fā)酵48 h后，菌株L-5、L-7和L-9的生物量為81～106 mg，乙醇產(chǎn)率約為50%；菌株L-3和L-13的生物量分別為60 mg和31 mg，乙醇產(chǎn)率分別為41.23%和4.68%。經(jīng)過b處理后，僅有L-5和L-9能生長(zhǎng)和產(chǎn)乙醇，但乙醇產(chǎn)率較低。在40 ℃時(shí)，各菌株生長(zhǎng)都比38 ℃時(shí)的弱，產(chǎn)乙醇能力也很低。所有經(jīng)過a處理的各菌株都能生長(zhǎng)，但平均生物量?jī)H為32.4 mg，乙醇產(chǎn)率從0～18.56%。經(jīng)過b處理的菌株僅L-9能生長(zhǎng)，乙醇產(chǎn)率僅為11.21%。由試驗(yàn)可得，經(jīng)過a處理的菌株L-9a在38 ℃下，生物量較高，為106 mg，乙醇產(chǎn)率也較高，為53.02%，可作為目的菌株。

2.3菌株L-9a和菌株L的發(fā)酵力及產(chǎn)乙醇能力比較

由圖4可以看出，菌株L-9a與出發(fā)菌株L的發(fā)酵能力相當(dāng)，但大量產(chǎn)氣的時(shí)間比出發(fā)菌株L提前8 h，為后期發(fā)酵試驗(yàn)縮短了時(shí)間。

a：在38 ℃下生物量和乙醇產(chǎn)率，b：在40 ℃下生物量和乙醇產(chǎn)率。 a：Biomass and ethanol production at 38 ℃, b：Biomass and ethanol production at 40 ℃.

圖4 菌株L-9a和菌株L發(fā)酵力測(cè)定結(jié)果Fig.4 Results of yeast L-9a and L fermentation power

由表4可以看出，菌株L-9a乙醇產(chǎn)量平均為1.71 mL·100 mL-1，殘還原糖含量平均為0.76 g·100 mL-1，與菌株L(乙醇產(chǎn)量1.72 mL·100 mL-1，殘還原糖含量0.74 g·100 mL-1)相比基本一致，但菌株L-9a的發(fā)酵溫度為38 ℃，與菌株L發(fā)酵溫度30 ℃相比，有利于解決同步糖化發(fā)酵中糖化和發(fā)酵溫度不一致的問題。

表4 菌株L-9a與菌株L搖瓶試驗(yàn)結(jié)果Table 4 Results of flask-shaking fermentation by recreening

3 結(jié) 論

本研究首先對(duì)出發(fā)菌株L進(jìn)行紫外誘變，然后采用漸進(jìn)式和熱沖擊式對(duì)誘變菌株進(jìn)行高溫馴化處理，并分別將馴化后的菌株放在36、38、40 ℃下隔離培養(yǎng)24 h，觀察其生長(zhǎng)情況。將生長(zhǎng)良好的菌株以10%接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，通過測(cè)定在38 ℃和40 ℃下的生物量和乙醇產(chǎn)率，選育出1株耐高溫釀酒酵母L-9a，并測(cè)定其發(fā)酵能力。結(jié)果表明：(1)經(jīng)過a處理的菌株L-9a在38 ℃下，生物量較高，為106 mg，乙醇產(chǎn)率也較高，為53.02%，可作為目的菌株。(2)菌株L-9a乙醇產(chǎn)量平均為1.71 mL·100 mL-1，殘還原糖含量平均為0.76 g·100 mL-1，與菌株L相比基本一致，但菌株L-9a的發(fā)酵溫度為38 ℃，與菌株L發(fā)酵溫度30 ℃相比，有利于解決同步糖化發(fā)酵中糖化和發(fā)酵溫度不一致的問題。(3)與原始菌株L相比，經(jīng)處理得到的菌株L-9a，在同步糖化發(fā)酵中，有較高的乙醇產(chǎn)量。利用這株菌株，在同步糖化發(fā)酵過程中，使轉(zhuǎn)化預(yù)處理木質(zhì)纖維素變成乙醇的溫度與酶水解最優(yōu)溫度更接近。

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(責(zé)任編輯：蔣國良)

BreedingofthermotolerantyeaststrainsSaccharomycescerevisiaeforbioethanolproduction

BU Wenjing1， DUAN Qiuhong2， DU Jinyu1， WANG Yi3， SUI Jixue1

(1.Department of Energy and Power Engineering,Henan University of Animal Husbandry and Economy,Zhengzhou 450011,China；2.Zhengzhou Institute of Science and Technology，Zhengzhou 450062,China; 3.College of Mechanical and Electrical Engineering，Henan Agricultural University，Zhengzhou 450002,China)

SaccharomycescerevisiaeL as staring strain was acclimatized and screened with UV mutation and high temperature treatment. A thermotolerant yeast strainsSaccharomycescerevisiaeL-9a was obtained.The results show that through high temperature Treatment A under the condition of 38 ℃,the biomass of L-9a was 106mg,ethanol yield was 53.02%,the average yield was 1.71 mL·100 mL-1and residual reducing sugar content was 0.76 g·100 mL-1. The temperature inconsistency problem of saccharification and fermentation in SSF was solved.

bioethanol; biomass；Saccharomycescerevisiae；thermotolerant yeast

TS261.1

：A

2015-09-12

河南省科技攻關(guān)項(xiàng)目(152102210319)；鄭州市科技攻關(guān)項(xiàng)目(141PPTGG411)

卜文靜(1985-)，女，河南義馬人，助教，碩士，從事生物質(zhì)能、太陽能等新能源應(yīng)用技術(shù)的研究。

杜金宇(1976-)，男，河南南陽人，講師，博士。

1000-2340(2016)02-0235-06