張嚴(yán)磊，施歡賢，雷莉妍，宋忠興，唐志書(shū)

(陜西中醫(yī)藥大學(xué)陜西省中藥資源產(chǎn)業(yè)化協(xié)同創(chuàng)新中心，陜西省中藥基礎(chǔ)與新藥研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 咸陽(yáng) 712083)

·中藥工業(yè)·

文冠果葉多糖超聲輔助提取工藝及其藥效學(xué)初步研究△

張嚴(yán)磊，施歡賢，雷莉妍，宋忠興，唐志書(shū)*

(陜西中醫(yī)藥大學(xué)陜西省中藥資源產(chǎn)業(yè)化協(xié)同創(chuàng)新中心，陜西省中藥基礎(chǔ)與新藥研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 咸陽(yáng) 712083)

目的：以文冠果葉為原料，研究超聲輔助法對(duì)文冠果葉多糖提取得率的影響。在此基礎(chǔ)上，對(duì)文冠果葉多糖抗癌、抗氧化活性進(jìn)行初步研究。方法：?jiǎn)我蛩卦囼?yàn)基礎(chǔ)上采用正交試驗(yàn)法研究溫度、料液比、超聲功率對(duì)文冠果葉多糖得率的影響，進(jìn)一步優(yōu)化超聲提取的工藝；四甲基偶氮唑鹽比色法(MTT)研究文冠果葉多糖對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2增殖的抑制作用；抗氧化活性通過(guò)DPPH·清除實(shí)驗(yàn)檢測(cè)。結(jié)果：文冠果葉多糖的最佳提取工藝為提取溫度90 ℃，料液比為1∶20，超聲功率90 W，超聲時(shí)間30 min，在該條件下文冠果葉多糖的提取率可達(dá)17.90%；活性研究顯示，在濃度2.5 mg·mL-1時(shí)，文冠果葉多糖對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2增殖抑制率為20.21%；濃度為0.2 mg·mL-1時(shí)，對(duì)DPPH·自由基清除率高達(dá)90.78%。結(jié)論：超聲輔助提取文冠果葉多糖與傳統(tǒng)的水熱提取法相比，提取時(shí)間短、收率高；文冠果葉多糖具有一定的抗肝癌活性及良好的抗氧化活性，具有開(kāi)發(fā)為藥品及化妝品等相關(guān)產(chǎn)品的潛能。

超聲輔助；文冠果葉多糖；藥效學(xué)；初步研究

文冠果XanthocerassorbifoliaBunge是無(wú)患子科(Sapindaceae)，屬木本油料植物，該植物較特殊，是一屬一種，為中國(guó)特有的民間植物[1]。文冠果原產(chǎn)中國(guó)西北，其葉[2]、花[3]、果殼[4]、果柄[5]、種皮[6]等皆含有多種化學(xué)成分，有抗風(fēng)濕、祛風(fēng)、消腫止痛等功能，臨床上主要用于治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等[7]。最近研究表明，文冠果殼提取物有改善記憶的功能，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，主要活性物質(zhì)為文冠果殼苷[8]。

但是文冠果目前最廣為人知的特點(diǎn)是種仁含油量高、油營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高且具備開(kāi)發(fā)為生物柴油的品質(zhì)[9]。因此，近年來(lái)，國(guó)家將文冠果作為木本油料作物大力推廣，重新引燃了各地對(duì)文冠果栽種熱情。目前大規(guī)模的栽種區(qū)域主要在甘肅、陜西、遼寧及內(nèi)蒙古，栽種面積保守在27萬(wàn)公頃以上[10]。對(duì)文冠果資源的開(kāi)發(fā)利用目前主要有：生產(chǎn)種仁售賣(mài)及種仁榨油；文冠果嫩葉加工茶葉售賣(mài)。從目前調(diào)研來(lái)看，存在諸多問(wèn)題：第一，文冠果種仁的售價(jià)普遍較高且銷(xiāo)量較少，種仁一部分被科研單位購(gòu)買(mǎi)用于研究，還有一部分用于育種栽培；第二，文冠果種仁油被證明具有多種對(duì)人體有益的功能，但其售價(jià)高且市場(chǎng)認(rèn)可度低，因此市面很少有售；第三，文冠果葉茶據(jù)宣傳有多種保健功能，諸如降壓、降血糖等，但是幾乎無(wú)藥理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)及相關(guān)文獻(xiàn)可查，加上民眾對(duì)其認(rèn)知度不高，產(chǎn)品單一，導(dǎo)致市面上亦難覓其蹤影。這樣的情況導(dǎo)致的結(jié)果：一方面國(guó)家大力推廣栽種，栽種面積已成一定規(guī)模，但是種子卻大量積壓，栽種沒(méi)有收益大大打擊種植戶及相關(guān)企業(yè)信心；另一方面市場(chǎng)卻很少見(jiàn)到文冠果相關(guān)產(chǎn)品。

由此可見(jiàn)，發(fā)展文冠果產(chǎn)業(yè)，目前最迫切的任務(wù)是對(duì)文冠果加大研發(fā)力度，闡明其各種藥理作用，開(kāi)發(fā)相關(guān)產(chǎn)品，以研發(fā)帶動(dòng)栽種與銷(xiāo)售市場(chǎng)。

植物多糖是近年來(lái)中藥研究的熱點(diǎn)領(lǐng)域，多糖的多種生物活性不斷被發(fā)現(xiàn)，有抗癌、降血糖、調(diào)節(jié)免疫、保肝護(hù)肝等多種功能[11]。從植物中提取多糖并研究其功能也是目前研究的熱點(diǎn)之一。與傳統(tǒng)的水熱提取法相比，超聲、微波等手段應(yīng)用于中藥及天然產(chǎn)物提取方面具有提取效率高、良好的活性保持等優(yōu)點(diǎn)，因此在多糖提取中被廣泛使用，是提取領(lǐng)域的新方法與新趨勢(shì)[12-13]。

鑒于以上原因，本文研究超聲輔助水熱法提取文冠果葉多糖，并通過(guò)單因素和正交試驗(yàn)優(yōu)化提取工藝；在此基礎(chǔ)上，對(duì)文冠果葉多糖進(jìn)行抗肝癌、抗氧化活性的初步研究。研究結(jié)果為文冠果資源的綜合開(kāi)發(fā)和利用提供新的思路，也為文冠果葉的開(kāi)發(fā)提供理論基礎(chǔ)與參考。

1 儀器與試藥

1.1 藥材

新鮮的文冠果葉由楊凌普天農(nóng)業(yè)科技有限公司提供，通風(fēng)處陰干、粉碎過(guò)4目篩備用。

1.2 細(xì)胞株

HepG2人肝癌細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。

1.3 試藥

DMEM培養(yǎng)基(美國(guó)HyClone公司)；胎牛血清(浙江天航生物科技有限公司)；雙抗(北京索萊寶科技有限公司)；0.25%胰蛋白酶(美國(guó)HyClone公司)；抗壞血酸(Vc)(成都科龍化工試劑)；1，1-二苯基-2-苦基苯肼(DPPH·)標(biāo)準(zhǔn)品(Sigma公司)；1.10-鄰二氮菲(一水)(成都科龍化工試劑)；95%乙醇、無(wú)水乙醇、去離子水等試劑及溶劑均為分析純。

1.4 儀器

UV-2600紫外分光光度計(jì)(日本島津)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)；Zirbus Technology LTD-Vaco真空冷凍干燥機(jī)(香港嘉盛科技有限公司)；KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

2 實(shí)驗(yàn)

2.1 提取工藝

干燥、粉碎的文冠果葉5 g，加石油醚脫脂，加入95%乙醇脫色素，加入相應(yīng)比例的純凈水(一定的溫度和超聲頻率)提取30 min，抽濾，濾液濃縮至原液的五分之一，加入4倍體積無(wú)水乙醇，4 ℃靜置過(guò)夜，抽濾，濾渣醇洗，冷凍干燥稱(chēng)重。

文冠果葉多糖得率(%)=文冠果葉多糖質(zhì)量(g)/干燥文冠果葉質(zhì)量(g)×100%。

2.1.1 單因素試驗(yàn) 時(shí)間對(duì)文冠果葉多糖得率的影響：每份文冠果葉分別超聲輔助提取10、20、30、40、50、60 min，料液比為1∶25，提取溫度為50 ℃，超聲頻率為50 W。

料液比對(duì)文冠果葉多糖得率的影響：每份文冠果葉分別加入料液比為1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30的純凈水，提取溫度50 ℃，超聲頻率為50 W。

溫度對(duì)文冠果葉多糖收率的影響：每份文冠果葉溫度分別為25、40、50、60、70、80、90 ℃，料液比1∶25，超聲頻率為50 W。

超聲頻率對(duì)文冠果葉多糖提取得率的影響：每份文冠果葉粉超聲頻率分別為40、50、60、70、80、100 W，料液比為1∶25，溫度為50 ℃。

提取次數(shù)對(duì)文冠果葉多糖得率的影響：每次提取后更換溶劑，最后合并總提取液，每份文冠果葉分別提取1次、2次、3次、4次，每次40 min，料液比為1∶25，超聲頻率為50 W，溫度為50 ℃。

2.1.2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，因素及水平見(jiàn)表1。

表1 正交試驗(yàn)因素及水平

2.2 文冠果葉多糖藥效學(xué)的初步研究

2.2.1 抗肝癌活性研究 HepG2細(xì)胞的培養(yǎng)：將HepG2細(xì)胞置于25 mL塑料培養(yǎng)瓶中，加入完全高糖DMEM培養(yǎng)基(含10% 胎牛血清，100 U·L-1青霉素和100 U·L-1鏈霉素)，置于37 ℃含5%的CO2的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)。待細(xì)胞生長(zhǎng)至90%匯合時(shí)，用0.25%的胰酶消化傳代，3 d傳代1次。

MTT法檢測(cè)細(xì)胞相對(duì)存活率：HepG2細(xì)胞以1×104個(gè)/每孔的密度接種于96孔板中，培養(yǎng)12 h，使細(xì)胞充分貼壁。棄去培養(yǎng)基，加入文冠果葉多糖。在細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束前4 h，每孔加入15 μL的MTT。培養(yǎng)結(jié)束后，吸去培養(yǎng)基，每孔加入150 μL的DMSO，37 ℃震蕩10 min，用多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm處的吸光度值。

2.2.2 抗氧化活性研究 DPPH·標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：精密稱(chēng)取DPPH·標(biāo)準(zhǔn)品12 mg，用甲醇溶解并定容至250 mL，低溫避光保存，備用。臨用前將用甲醇稀釋2倍，測(cè)量其吸光度。

Vc及樣品的溶液的制備：分別量取抗壞血酸和樣品25 mg，用甲醇溶解并定容至25 mL容量瓶。分別精密量取上述溶液適量，依次用甲醇稀釋至質(zhì)量濃度分別為0.01、0.04、0.08、0.12、0.16、0.2 mg·mL-16個(gè)梯度的樣品溶液。

計(jì)算方法：取2 mL的DPPH·標(biāo)準(zhǔn)液與2 mL甲醇溶液混勻，常溫避光反應(yīng)15 min，于517 nm處測(cè)量吸光度(A空白)，用各濃度樣品溶液代替甲醇測(cè)量其吸光度(A樣)，陽(yáng)性對(duì)照參照樣品方法。

DPPH·清除率=(A空白-A樣)/A空白×100%

3 結(jié)果與分析

3.1 超聲時(shí)間對(duì)文冠果葉多糖提取率的影響

由圖1可知，在料液比為1∶25，溫度為50 ℃，超聲頻率為50 W的條件下，文冠果葉多糖的得率隨提取時(shí)間變化比較大，提取時(shí)間大于40 min后，得率基本不再增加，因此選擇40 min為實(shí)驗(yàn)時(shí)間。

圖1 時(shí)間對(duì)文冠果葉多糖提取率的影響

3.2 超聲次數(shù)對(duì)文冠果葉多糖得率的影響

由圖2可知，在料液比為1∶25，溫度為50 ℃，超聲頻率為50 W的條件下，文冠果葉多糖的得率隨提取次數(shù)只有些許增加，幾乎可以忽略不計(jì)，且考慮到增加提取次數(shù)對(duì)溶劑回收帶來(lái)能源浪費(fèi)等麻煩，因此提取1次即可。

圖2 提取次數(shù)對(duì)文冠果葉多糖得率的影響

3.3 料液比對(duì)文冠果葉多糖提取率的影響

由圖3可知，在溫度為50 ℃，超聲頻率為50 W的條件下，當(dāng)料液比大于1∶15時(shí)，得率依然隨著料液比增加而增加，但是增加趨勢(shì)變緩，且料液比越大，后續(xù)濃縮困難，因此選擇1∶15為提取實(shí)驗(yàn)的料液比。

圖3 料液比對(duì)文冠果葉多糖得率的影響

3.4 溫度對(duì)文冠果葉多糖得率的影響

由圖4可知，在料液比為1∶25，超聲頻率為50 W的條件下，當(dāng)溫度高于80 ℃后得率基本不再增加，趨于穩(wěn)定，故而選擇80 ℃為實(shí)驗(yàn)溫度。

圖4 溫度對(duì)文冠果葉多糖得率的影響

3.5 超聲頻率對(duì)文冠果葉多糖得率的影響

由圖5可知，在料液比為1∶25，溫度為50 ℃的條件下，當(dāng)超聲頻率大于80 W后得率增加趨于穩(wěn)定狀態(tài)，因此確定80 W為超聲輔助的實(shí)驗(yàn)頻率。

圖5 超聲頻率對(duì)文冠果葉多糖得率的影響

3.6 正交試驗(yàn)

正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

正交試驗(yàn)結(jié)果顯示，各條件對(duì)文冠果葉多糖提取得率影響大小的的主次順序?yàn)锳>B>C>D，結(jié)合各因素的K值大小，優(yōu)選出的文冠果葉多糖提取的最佳工藝條件為A3B3C3D1，即：提取溫度90 ℃，提取料液比為1∶20，提取的超聲頻率90 W，提取時(shí)間30 min。

3.7 正交試驗(yàn)最佳條件驗(yàn)證

按最佳條件A3B3C3D1，進(jìn)行文冠果葉多糖超聲輔助提取重復(fù)驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果顯示，最佳條件下文冠果葉多糖的提取得率可達(dá)17.90%，而傳統(tǒng)水熱法提取效率大大低于超聲輔助法，見(jiàn)表3。

表3 最佳條件及水熱法條件下文冠果葉多糖提取試驗(yàn)

3.8 文冠果葉多糖的藥效學(xué)初步研究結(jié)果

3.8.1 文冠果葉多糖對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2存活率抑制作用 見(jiàn)圖6。

由圖6可知，文冠果葉多糖對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2活性具有一定的抑制作用，但是效果不明顯，在質(zhì)量濃度為2.5 mg·mL-1時(shí)，抑制率為20.21%。

3.8.2 文冠果葉多糖對(duì)DPPH·自由基清除活性 由圖7可知文冠果葉多糖對(duì)DPPH·自由基有較強(qiáng)的清除活性，且具有量效關(guān)系，在質(zhì)量濃度為0.2 mg·mL-1時(shí)對(duì)DPPH·自由基清除率就可達(dá)90.78%。

圖6 抑制人肝癌細(xì)胞HepG2活性

圖7 清除DPPH自由基活性結(jié)果

4 討論

本文研究結(jié)果顯示，超聲輔助能大大提高文冠果葉多糖的提取效率，是文冠果葉多糖提取的一條高效途徑。體外活性研究結(jié)果表明，文冠果葉多糖具有一定的抗癌活性，但活性不明顯，而其抗氧化能力較強(qiáng)，具有開(kāi)發(fā)為藥品及化妝品等相關(guān)產(chǎn)品的潛力。本研究結(jié)果為文冠果資源的綜合開(kāi)發(fā)與利用提供了新的思路。

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StudyonUltrasonicAssistedExtractionTechnologyandPreliminaryPharmacodynamicsResearchofPolysaccharidefromXanthocerassorbifoliaLeaf

ZHANG Yanlei，SHIHuanxian，LEILiyan，SONGZhongxing，TANGZhishu*

(ShaanxiUniversityofChineseMedicine/ShaanxiCollaborativeInnovationCenterofIndustrializationofTraditionalChineseMedicineResources；ShaanxiKeyLaboratoryofNewDrugsandBioactiveConstituentsofTraditionalChineseMedicineXianyang，Shaanxi712083，China).

Objective：To study the effect of the ultrasonic assisted extraction on extraction rate of polysaccharide inXanthocerassorbifoliaBunge leaf，and the antioxidant and antitumor activity of the polysaccharide.Methods：On the basis of single factor experiment，orthogonal experiment method was used to study the effects of temperature，ratio of solid to liquid ratio，ultrasonic power extraction time on the yield ofX.sorbifolialeaf polysaccharide.MTT method was used to study the Inhibition effect of the polysaccharides on the proliferation of human hepatoma cell line HepG2.The antioxidant activity was tested by DPPH-clearance test.Results：The best extraction process of polysaccharides ofX.sorbifolialeaf was：extraction temperature of 90 oC，solid to liquid ratio of 1：20，ultrasonic power 90W，ultrasonic time 30min，under this conditions the polysaccharide extraction rate could reach 17.90%.The inhibitory effect ofX.sorbifolialeaf polysaccharides on the proliferation of human hepatoma cell line HepG2 rate was 24.07%，when the concentration was 2.5 mg/ml.When the concentration was 0.2 mg/ml.The free radical DPPH elimination rate could be as high as 90.78%.Conclusion：Compared to the traditional hot water extraction method，ultrasonic assisted extraction method shows properties of shorter time and higher yield.The polysaccharide extracted fromX.sorbifolialeaf had certain anti-tumor activity and good antioxidant activity，which had the potential to be developed as medicines and cosmetics.

Ultrasonic assisted extraction；Xanthocerassorbifolialeaf polysaccharide；pharmacodynamics；preliminary study

2016-01-22)

陜西省協(xié)同創(chuàng)新計(jì)劃項(xiàng)目(2015xt-52)；陜西省科技資源開(kāi)放共享平臺(tái)項(xiàng)目(2015FWPT-01)。

*

唐志書(shū),教授，研究方向：中藥資源化學(xué)；E-mail:tzs5656@163.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.12.023