梁永富，王康才，隋利，薛啟，葉軍，陳興忠

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，江蘇 南京 210095；2.泰州市林業(yè)技術(shù)指導(dǎo)站，江蘇 泰州 225300)

Ca2+對酸橙幼苗低溫脅迫下抗逆生理指標(biāo)的影響△

梁永富1，王康才，隋利1，薛啟1，葉軍2，陳興忠2

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，江蘇 南京 210095；2.泰州市林業(yè)技術(shù)指導(dǎo)站，江蘇 泰州 225300)

分析Ca(NO3)2對低溫脅迫下酸橙幼苗抗逆生理指標(biāo)的影響，探討Ca(NO3)2對酸橙幼苗低溫脅迫調(diào)控的可行性。該實驗以盆栽酸橙幼苗為材料，葉面噴施5、10、15、20、25mmol·L-1的Ca(NO3)2溶液，置于4℃/0℃(晝/夜)，光照為600 μmol·m-2·s-1的人工氣候箱內(nèi)，以常溫25℃噴施蒸餾水和低溫脅迫下噴施蒸餾水為對照，處理3d后，測定酸橙幼苗POD、SOD和CAT酶活性、可溶性蛋白含量、脯氨酸含量、MDA含量、相對電導(dǎo)率和葉綠素含量。結(jié)果表明，低溫脅迫下葉面噴施Ca(NO3)2溶液可提高酸橙幼苗葉片POD、SOD和CAT酶活性，顯著提高可溶性蛋白和脯氨酸等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的含量，降低細(xì)胞MDA含量和相對電導(dǎo)率，減緩葉綠素下降的趨勢，提高了葉片光合效率。葉面噴施一定濃度Ca(NO3)2溶液可減輕低溫脅迫對酸橙幼苗葉片的傷害。

Ca(NO3)2；酸橙；低溫脅迫

蕓香科植物酸橙CitrusaurantiumL.是中藥材枳殼的基原植物，也是一種經(jīng)濟(jì)及觀賞價值較高的果樹。枳殼類藥材以枳實之名始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》[1]，具有理氣寬中、行滯消脹的功效，為常用理氣藥?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，枳殼粗提物具有抗腫瘤[2]、降血脂[3]等作用。酸橙主要分布于浙江、貴州、江西、四川、江蘇等長江以南各省[4]，現(xiàn)市場上流通的酸橙類枳殼主產(chǎn)于江西、浙江和四川等地。枳殼依產(chǎn)地分為川枳殼、湘枳殼、江枳殼、蘇枳殼、溫枳殼五類[5]。蘇枳殼主產(chǎn)于江蘇，曾經(jīng)有一定產(chǎn)量，現(xiàn)在在市場上基本消失。為了讓蘇枳殼重新形成產(chǎn)量，江蘇泰州對酸橙進(jìn)行引種，但在引種的過程中發(fā)現(xiàn)，酸橙葉片受冬季低溫的影響，會出現(xiàn)枯黃掉落的現(xiàn)象，低溫還影響了初春時節(jié)酸橙的花芽分化，導(dǎo)致枳殼類藥材產(chǎn)量下降。因此，如何減輕低溫對酸橙造成的傷害，增強(qiáng)酸橙對低溫脅迫的抗逆性，對提高枳殼類藥材產(chǎn)量具有重要意義。

Ca2+作為細(xì)胞信號傳導(dǎo)過程中的第二信使，在植物細(xì)胞膜感受到寒冷脅迫信號后，能夠?qū)⑿盘柨焖賯鬟f到胞內(nèi)，并引起胞內(nèi)相應(yīng)的生理化學(xué)反應(yīng)，減輕低溫對植物的傷害[6-8]。研究表明，噴施外源Ca2+可以提高植物的抗逆性，增強(qiáng)植物對低溫環(huán)境的適應(yīng)性[9-11]。CaCl2作為Ca2+的常用鈣鹽，其在低溫環(huán)境下對植物抗寒性的提高已得到了證實[12]，但酸橙是中度耐鹽植物，Cl-對其會造成陰離子傷害[13-15]。Ca(NO3)2可以代替CaCl2處理柑橘類植物，提高其抗寒性[16-17]。本文根據(jù)酸橙栽培過程中遇到的實際問題，研究低溫脅迫下，葉面噴施不同濃度Ca(NO3)2對酸橙幼苗葉片生理生化特性的影響，包括細(xì)胞膜透性、膜脂過氧化產(chǎn)物丙二醛含量和滲透物質(zhì)含量等，以探討Ca(NO3)2與酸橙幼苗抗寒能力的關(guān)系，以期為酸橙栽培技術(shù)的改進(jìn)提供依據(jù)。

1 材料

供試材料由湖南程錦農(nóng)業(yè)科技開發(fā)有限公司提供，經(jīng)南京農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材科學(xué)系王康才教授鑒定為蕓香科植物酸橙CitrusaurantiumL.

2 方法

2.1 實驗設(shè)計

試驗于2015年9月至11月在南京農(nóng)業(yè)大學(xué)溫室內(nèi)進(jìn)行。于2015年9月1日選取生長基本一致、無病蟲害、高10 cm左右的酸橙幼苗進(jìn)行盆栽，盆高16 cm×直徑14 cm的塑膠盆中。栽培基質(zhì)是蛭石：營養(yǎng)土為2∶1的混合物，基質(zhì)體積約為花盆體積的80%，每盆4株。常規(guī)水肥管理，每5 d澆水一次，每次澆水量為150 mL，緩苗1個月后進(jìn)行外源Ca2+和低溫脅迫處理。選用Ca(NO3)2代替Ca2+處理酸橙幼苗，Ca(NO3)2設(shè)計5，10，15，20，25 mmol·L-15個濃度。于2015年10月1日至3日18∶00對酸橙進(jìn)行葉面噴施，以葉面的正反面浸潤、向下滴液為度，每處理4盆。連續(xù)噴施3 d，第3 d噴施生長調(diào)節(jié)劑2h后，將幼苗連同塑膠盆放入人工氣候箱(QHX-800L人工氣候箱，金壇市良友儀器有限公司)中進(jìn)行低溫脅迫處理，溫度為4 ℃/0 ℃(晝/夜)，光照為600 μmol·m-2·s-1，同時設(shè)置2組對照，對照CK1為置于溫度為25 ℃/23 ℃(晝/夜)，噴施蒸餾水；CK2為低溫脅迫，噴施蒸餾水。低溫處理3 d后，于2015年10月3日取出苗木在室溫下恢復(fù)24 h后進(jìn)行相關(guān)生理指標(biāo)測定。

2.2 相關(guān)生理指標(biāo)

測定可溶性蛋白含量測定采用Bradford考馬斯亮藍(lán)G-250染色法；脯氨酸含量測定采用茚三酮法；丙二醛(MDA)含量測定采用硫代巴比妥酸(TBA)法；超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化氫酶(CAT)活性測定分別采用氮藍(lán)四唑(NBT)法和高錳酸鉀滴定法；過氧化物酶(POD)活性測定采用愈創(chuàng)木酚法；葉綠素含量采用乙醇提取分光光度法；相對電導(dǎo)率采用電導(dǎo)儀法[18]。

2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用Excel 2010和統(tǒng)計軟件SPSS 20.0進(jìn)行統(tǒng)計分析，LSD法檢驗差異顯著性。

3 結(jié)果與分析

3.1 Ca(NO3)2對低溫脅迫下酸橙幼苗葉片MDA含量和相對電導(dǎo)率的影響

由圖1可知，與常溫對照CK1相比，低溫脅迫下，酸橙幼苗葉片的MDA含量均顯著升高，說明細(xì)胞膜遭到不同程度低溫傷害。而與低溫脅迫對照CK2相比，葉面噴施濃度為5，10，15，20和25 mmol·L-1的Ca(NO3)2溶液均顯著降低了葉片MDA含量，分別降低了11.35%、16.47%、28.38%、62.43%、35.41%。其中，以濃度為20 mmol·L-1的Ca(NO3)2噴施效果最好，與CK2相比，差異極顯著。

圖1-1 Ca(NO3)2對低溫脅迫下酸橙幼苗MDA含量的影響

圖1-2 Ca(NO3)2對低溫脅迫下酸橙幼苗相對電導(dǎo)率的影響

從表1可以看出，與常溫對照CK1相比，CK2的相對電導(dǎo)率顯著升高了124.23%，說明低溫脅迫破壞了酸橙幼苗葉片細(xì)胞膜系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)與功能，致使相對電導(dǎo)率急劇上升。葉面噴施不同濃度的Ca(NO3)2后，與CK2相比，均出現(xiàn)不同程度的降低了相對電導(dǎo)率，且相對電導(dǎo)率隨著Ca(NO3)2濃度的升高而出現(xiàn)呈先升高后降低的趨勢。在Ca(NO3)2濃度為20 mmol·L-1時，噴施效果最好，相對電導(dǎo)率較CK2降低45.02%。

3.2 Ca(NO3)2對低溫脅迫下酸橙幼苗葉片SOD、POD、CAT活性的影響

由表1可知，經(jīng)低溫脅迫處理后，CK2酸橙幼苗葉片的POD、SOD酶活性較CK1明顯降低，分別降低33.17%和13.51%，說明低溫脅迫顯著抑制了酸橙幼苗葉片的抗氧化酶活性。與CK2相比，葉面噴施不同濃度的Ca(NO3)2溶液，均能顯著提高酸橙幼苗葉片POD、SOD、CAT的酶活性。其中以20mmol·L-1的Ca(NO3)2溶液葉面噴施的效果最好，POD、SOD、CAT的酶活性增加率最大，與CK2相比，分別增加了76.95%，16.65%，30.00%。

表1 生長調(diào)節(jié)劑對低溫脅迫下酸橙幼苗葉片抗氧化酶活性的影響

注：同一列不同小寫字母表示顯著差異，P<0.05(表2同)

3.3 Ca(NO3)2對低溫脅迫下酸橙幼苗葉片脯氨酸和可溶性蛋白含量的影響

可溶性蛋白是植物體內(nèi)重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，參與植物的滲透調(diào)節(jié)過程，低溫脅迫下其含量的多少反映了植物對逆境的適應(yīng)能力。由圖2-1可知，低溫脅迫下，CK2可溶性蛋白含量明顯高于CK1，較CK1提高15.98%，說明低溫脅迫下，酸橙可以自發(fā)產(chǎn)生某種機(jī)制，積累可溶性蛋白，以適應(yīng)低溫環(huán)境。與CK2相比，葉面噴施Ca(NO3)2溶液可以進(jìn)一步提高酸橙幼苗葉片可溶性蛋白含量，且可溶性蛋白含量隨著Ca(NO3)2濃度的升高而呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。相對于低溫處理CK2來說，葉面噴施20 mmol·L-1的Ca(NO3)2效果最好，可溶性蛋白含量增加了68.86%。

脯氨酸也是植物體內(nèi)重要的調(diào)節(jié)物質(zhì)之一，當(dāng)植物受到環(huán)境脅迫時，植物體內(nèi)的脯氨酸含量就會迅速增加，以減輕環(huán)境脅迫對植物造成的傷害，所以脯氨酸的含量在一定程度上反映了植物的抗逆性。由圖2-2可以看出，經(jīng)過低溫脅迫處理后，CK2脯氨酸含量較CK1增加了16.11%，說明酸橙幼苗對低溫傷害有一定的抵抗力。與CK2相比，葉面噴施10，15，20，25 mmol·L-1的Ca(NO3)2溶液均顯著顯著提高植物體內(nèi)脯氨酸含量，分別提高9.90%、15.93%、39.45%、27.07%。其中，以20 mmol·L-1的Ca(NO3)2的噴施效果最好。

圖2-1 Ca(NO3)2對低溫脅迫下酸橙幼苗可溶性蛋白含量的影響

圖2-2 Ca(NO3)2對低溫脅迫下酸橙幼苗脯氨酸含量的影響

3.4 Ca(NO3)2對低溫脅迫下酸橙幼苗葉片葉綠素含量的影響

由表2可知，經(jīng)低溫處理后，CK2酸橙幼苗光合色素均明顯下降，葉片中葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素和葉綠素總量較CK1分別下降了18.39%、18.78%、26.46%、18.46%，均達(dá)顯著水平。經(jīng)不同濃度的Ca(NO3)2處理的酸橙幼苗葉片，相對于低溫處理CK2來說，光合色素含量均明顯提高，其中以20 mmol·L-1的Ca(NO3)2的處理效果最好，顯著減緩了酸橙幼苗光合色素下降的趨勢。葉片中葉綠素a，葉綠素b，類胡蘿卜素和葉綠素總量較CK2分別提高了22.39%、21.54%、36.30%、27.47%。

表2 生長調(diào)節(jié)劑對低溫脅迫下酸橙幼苗葉片葉綠素含量的影響

4 討論

4.1 Ca2+對酸橙幼苗滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的調(diào)節(jié)作用

低溫傷害是環(huán)境脅迫之一，限制了植物的生長。農(nóng)林業(yè)生產(chǎn)中常因低溫傷害而導(dǎo)致農(nóng)作物大幅減產(chǎn)，使生產(chǎn)者蒙受巨大損失。在受到低溫脅迫時，植物感受外界環(huán)境的低溫信號后，通過自身的低溫信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)調(diào)控植物的生理生化代謝途徑，合成有關(guān)物質(zhì)，以減輕低溫傷害[19]。脯氨酸和可溶性蛋白是植物體內(nèi)重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，可以增加植物細(xì)胞質(zhì)濃度，降低細(xì)胞滲透勢和冰點，防止細(xì)胞脫水和胞內(nèi)結(jié)冰，從而減輕植物的低溫傷害[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過3 d的低溫脅迫處理，與CK1相比，CK2酸橙幼苗葉片中可溶性蛋白和脯氨酸含量均顯著提高，說明低溫對酸橙幼苗造成了傷害，觸發(fā)了酸橙幼苗的抗冷機(jī)制，促使酸橙主動積累可溶性蛋白和脯氨酸，降低細(xì)胞滲透勢，緩減了酸橙幼苗因低溫而導(dǎo)致的細(xì)胞失水，一定程度上解輕了酸橙幼苗的低溫傷害[19-20]。本實驗研究表明，低溫脅迫下，與CK2相比，葉面噴施一定濃度的Ca2+溶液，可進(jìn)一步提高酸橙幼苗葉片可溶性蛋白和脯氨酸含量，有效減輕了低溫傷害。這可能是因為Ca2+是第二信使，能夠傳導(dǎo)低溫信息而促進(jìn)植物抗寒基因的表達(dá)[21-24]，進(jìn)而促進(jìn)植物合成可溶性蛋白和脯氨酸，增加植物抵御低溫的能力，這與李國新[25]，耿廣東[26]等的研究相一致。

4.2 Ca2+對酸橙幼苗抗氧化酶和細(xì)胞膜的調(diào)節(jié)作用

SOP、SOD和CAT是植物體內(nèi)抗氧化酶，能夠快速清除植物體內(nèi)活性氧(ROS)。正常生長條件下植物體內(nèi)ROS的產(chǎn)生與其清除系統(tǒng)會保持動態(tài)平衡，體內(nèi)ROS水平低，不會引起細(xì)胞膜系統(tǒng)的氧化傷害[27]。本研究發(fā)現(xiàn)，在低溫脅迫下，與CK1相比，CK2酸橙幼苗葉片中MDA含量和相對電導(dǎo)率顯著上升，可能的原因是低溫抑制了POD和SOD抗氧化酶活性，致使細(xì)胞內(nèi)ROS的清除機(jī)制遭到破壞，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)ROS含量上升，當(dāng)ROS的積累超過一定閾值時，就會發(fā)生膜脂過氧化，細(xì)胞膜的完整性遭到破壞，細(xì)胞膜系統(tǒng)的半透性逐步喪失，依賴于膜系統(tǒng)的代謝系統(tǒng)發(fā)生紊亂[27]，致使細(xì)胞內(nèi)電解質(zhì)外流，MDA含量和相對電導(dǎo)率顯著上升。與CK2相比，葉面噴施濃度為20 mmol·L-1的Ca(NO3)2溶液可以提高POD、SOD和CAT抗氧化酶活性，降低MDA含量和相對電導(dǎo)率。一方面可能是因為Ca2+能夠穩(wěn)定細(xì)胞壁、細(xì)胞膜和膜蛋白，使細(xì)胞膜的代謝系統(tǒng)趨于正常[11]，另一方面Ca2+是低溫信號轉(zhuǎn)導(dǎo)重要的第二信使，通過與細(xì)胞內(nèi)鈣調(diào)素(CaM)等鈣離子感應(yīng)器結(jié)合，改變不同蛋白質(zhì)的磷酸化狀態(tài)，引發(fā)各種細(xì)胞反應(yīng)，如合成各種抗氧化酶等生物大分子，從而提高了抗氧化酶活性，加快了細(xì)胞內(nèi)活性氧的清除，增強(qiáng)了植物適應(yīng)低溫環(huán)境的能力[21-24]。

4.3 Ca2+對酸橙幼苗葉綠素的調(diào)節(jié)作用

光合色素是綠色植物進(jìn)行光合作用的物質(zhì)基礎(chǔ)，光合色素含量的多少一定程度上決定了綠色植物對光的轉(zhuǎn)化效率能的高低。本研究發(fā)現(xiàn)，低溫脅迫下，與常溫對照CK1相比，CK2酸橙幼苗葉片中葉綠素和類胡蘿卜素含量顯著下降，一方面可能是低溫抑制了光合色素合成酶的活性，致使光合色素的合成受阻；另一方面，低溫導(dǎo)致光抑制現(xiàn)象的發(fā)生，產(chǎn)生的活性氧破壞了葉綠體雙層膜和內(nèi)囊體結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致光合色素的分解[28-29]。此外，低溫引起的植物代謝緩慢可能會導(dǎo)致合成光合色素的原料減少，造成葉綠素含量的減少[30]。與CK2相比，葉面噴施Ca(NO3)2溶液可提高葉片中光合色素的含量。究其原因，可能是因為Ca2+能夠穩(wěn)定葉綠體雙層膜及內(nèi)囊體結(jié)構(gòu)，同時誘導(dǎo)了光合色素合成酶和抗寒基因的表達(dá)，從而使光合色素含量提高。這與邵怡若[31]等的研究相一致。

綜上所述，葉面噴施一定濃度的Ca(NO3)2溶液能夠提高酸橙幼苗葉片POD、SOD和CAT酶活性，顯著提高可溶性蛋白和脯氨酸等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的含量，降低細(xì)胞中MDA含量和相對電導(dǎo)率，減緩葉綠素下降的趨勢，并最終提高低溫脅迫下酸橙幼苗的抗逆性。用Ca(NO3)2溶液處理酸橙幼苗適宜的適宜濃度為20 mmol·L-1。

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EffectsofExogenousCa(NO3)2onPhysiologicalofCitrusaurantiumunderLowTemperatureStress

LIANG Yongfu1,WANGKangcai1*,SUILi1,XUEQi1,YEJun2,CHENXinzhong2

(1.CollegeofHorticulture,NanjingAgriculturalUniversity,Nanjing210095,China;2.ForestrytechnicalguidanceStationofTaizhou,Taizhou225300,China)

In order to reveal feasibility of the regulation of Ca(NO3)2onCitrusaurantiumunder low temperaturestress，the effects of Ca(NO3)2on physiological index were studied.Pot culturedCitrusaurantiumleaves under the same outdoor conditions were sprayed with 5，10，15，20，25mmol·L-1Ca(NO3)2separately，and then placed in the low incubator[0℃/4℃(day/night)，light intensity 600 μmol·m-2·s-1]，and sprayed with distilled water at 25 ℃ and under low temperature stress were set as the control.The related relative conductivity，contents of proline，malondialdehyde，soluble protein，chlorophyll，activities of SOD，POD and CAT，were measured.The results showed that the exogenous Ca(NO3)2enhanced the activities of SOD and POD，the contentsofproline and soluble protein，and effectively reduces the damage of heat stress on cell membrane.At the sametime，the exogenous Ca(NO3)2increases the contents of chlorophyll，the efficiency of leaf photosynthesis.In conclusion，the foliage spraying Ca(NO3)2could reduce the damage of low temperature stress onCitrusaurantiumleaves.

Ca(NO3)2；Citrusaurantiumseedlings；low temperature stress

2016-03-25)

江蘇省林業(yè)三新工程項目(LYSX[2014]48)

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王康才，教授，研究方向：藥用植物栽培與生理；E-mail：wangkc@njau.edu.cn

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.12.022