張忠兵，王思瑤，鄭順亮，夏柯，李志川，陳艷明，4

(1.北京友博藥業(yè)有限責(zé)任公司，北京 101300；2.牡丹江友搏藥業(yè)股份有限公司，黑龍江 牡丹江 157013；3.美國(guó)TOLEDO大學(xué)，美國(guó) 俄亥俄州 43614；4.天津大學(xué) 藥物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，天津 300192)

疏血通注射液的抗凝生物活性測(cè)定方法及其機(jī)制研究△

張忠兵1，2*，王思瑤1，2，鄭順亮1，2，夏柯1，2，李志川3，陳艷明1，2，4

(1.北京友博藥業(yè)有限責(zé)任公司，北京 101300；2.牡丹江友搏藥業(yè)股份有限公司，黑龍江 牡丹江 157013；3.美國(guó)TOLEDO大學(xué)，美國(guó) 俄亥俄州 43614；4.天津大學(xué) 藥物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，天津 300192)

目的：建立適合的疏血通注射液抗凝生物活性測(cè)定的方法，并探索疏血通注射液的抗凝作用機(jī)理。方法：通過(guò)實(shí)驗(yàn)建立了疏血通注射液生物活性測(cè)定的3鐘方法，即《中華人民共和國(guó)藥典》上收載的凝血酶滴定法(挑絲法)、臨床上常用的凝血儀測(cè)定法、以及國(guó)際上通用的測(cè)定凝血酶活性的熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)法，并進(jìn)行了3種方法的比較。結(jié)果：確定3種方法都可以使用，但以FRET法比較穩(wěn)定，受人工操作誤差影響小，靈敏度最高。結(jié)論：建立了適合疏血通注射液的3種抗凝生物活性方法。通過(guò)測(cè)定疏血通注射液對(duì)活化部分凝血酶時(shí)間(APTT)、凝血酶原時(shí)間(PT)、凝血酶時(shí)間(TT)的影響，以及對(duì)凝血酶活性的抑制作用，推測(cè)凝血酶可能是疏血通注射液抗凝作用的主要靶點(diǎn)。

疏血通注射液；抗凝；凝血酶

疏血通注射液是由水蛭、地龍兩味中藥組方，采用低溫浸漬、超微研磨、反復(fù)凍融、熱壓處理和超濾等現(xiàn)代工藝提取有效成分精制而成的中藥注射劑，臨床用于急性腦梗死的治療，安全性較好，療效確切[1-2]。研究表明疏血通注射液具有抗凝、溶栓、調(diào)節(jié)血脂、改善血液流變學(xué)、細(xì)胞保護(hù)等藥理作用[3-6]。

研究已經(jīng)證明疏血通注射液體內(nèi)給藥后具有一定的抗凝活性，能明顯延長(zhǎng)小鼠的凝血時(shí)間[3]。目前《中華人民共和國(guó)藥典》對(duì)于水蛭藥材的抗凝生物活性采用凝血酶滴定法(挑絲法)，該方法適合于具有較強(qiáng)抗凝活性的樣品測(cè)定。疏血通注射液由于僅保留了藥材中的活性小分子成分，其藥理作用相對(duì)溫和，本研究采用體外試驗(yàn)為主，比較了傳統(tǒng)的挑絲法、臨床上常用的血凝儀測(cè)定法、以及高靈敏度的熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)抗凝血酶生物活性測(cè)定法，以求探索建立適合疏血通注射液的抗凝生物活性測(cè)定方法，并對(duì)其抗凝機(jī)制進(jìn)行一定的探討。

1 儀器與材料

1.1 儀器與試劑

EnSpireTMMultilabel Plate Reader微孔板檢測(cè)儀配備Wallac EnVision Manager 1.12軟件系統(tǒng)(Perkin Elmer公司)，C2000-4半自動(dòng)血凝儀(北京普利生儀器有限公司)。

1.2 材料

凝血酶、牛纖維蛋白原(中國(guó)食品藥品檢定研究院)，SensoLyte?520凝血酶活性測(cè)定試劑盒(美國(guó)AnaSpec公司)，活化部分凝血酶時(shí)間(APTT)、凝血酶原時(shí)間(PT)、凝血酶時(shí)間(TT)測(cè)定試劑盒(北京普利生儀器有限公司)。疏血通注射液(牡丹江友搏藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：12040312，12051821，12052621)。

1.3 動(dòng)物

雄性SD大鼠，SPF級(jí)，體重250 g左右(北京華阜康生物科技股份有限公司)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCX(京)2012-0001。

2 方法

2.1 凝血酶滴定法(挑絲法)

方法并適當(dāng)調(diào)整[7]，精密量取本品6.0 mL，減壓濃縮(50～60 ℃)至干，殘?jiān)铀芙獠⑼耆D(zhuǎn)移至2 mL量瓶中，加水至刻度，搖勻，精密量取100 μL，置適宜白瓷板中，加入含0.5%(牛)纖維蛋白原的三羥甲基氨基甲烷鹽酸緩沖液(臨用配制)200 μL，攪勻，置水浴(37±0.5)℃溫?zé)? min，滴加每1mL中含10單位的凝血酶溶液(每1 min滴加1次，每次5 μL，邊滴加邊輕輕攪勻)至出現(xiàn)整塊可挑起透明凝膠狀沉淀，記錄消耗凝血酶溶液的體積，按公式(1)計(jì)算。

U=C1V1/(C2V2)

(1)

式中：U—每1 mL疏血通原液中含抗凝血酶活性單位，中和一個(gè)單位的凝血酶的量為一個(gè)抗凝血酶活性單位；C1—凝血酶溶液的濃度，U·mL-1；C2—供試品溶液的濃度，為3.0 mL原液·mL-1；V1—消耗凝血酶溶液的體積，μL；V2—供試品溶液的加入量，μL。

2.2 血凝儀測(cè)定法

SD大鼠10%水合氯醛麻醉后，腹主動(dòng)脈取血，加3.2%枸櫞酸鈉溶液(1∶9)抗凝，靜置1 h后，3000 r·min-1離心15 min制備大鼠血漿，在測(cè)量杯中加入大鼠血漿50 μL后，加入不同濃度的疏血通注射液以及相關(guān)測(cè)定試劑，按北京普利生公司APTT、PT、TT試劑盒方法操作，以肝素鈉作為陽(yáng)性對(duì)照，測(cè)定血液凝固時(shí)間。

2.3 熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)法

采用AnaSpec公司試劑盒，照試劑盒說(shuō)明書中微孔板方法操作，先后將測(cè)試緩沖液、凝血酶、疏血通注射液(必要時(shí)將注射液凍干成粉，并用蒸餾水溶解適當(dāng)稀釋至所需劑量)加入底部透明的黑色96孔板(Perkin Elmer公司)測(cè)試孔中(總體積為50 μL)，37 ℃預(yù)熱微孔板15 min后，加入50 μL凝血酶熒光底物溶液使反應(yīng)總體積為100 μL，37 ℃避光反應(yīng)30 min后，加入反應(yīng)終止液50 μL。設(shè)定激發(fā)光485 nm、發(fā)射光535 nm，立即測(cè)定熒光密度(RFU)。按公式(2)計(jì)算疏血通注射液的抗凝血酶活性。

(2)

式中：RFU(1)—不加入凝血酶以及疏血通注射液測(cè)試孔熒光讀數(shù)； RFU(2)—加入凝血酶，不加入疏血通注射液的測(cè)試孔熒光讀數(shù)； RFU(3)—不加入凝血酶，加入疏血通注射液的測(cè)試孔熒光讀數(shù)； RFU(4)—加入凝血酶以及疏血通注射液的測(cè)試孔熒光讀數(shù)。

3 結(jié)果與討論

3.1 凝血酶滴定法測(cè)定疏血通注射液抗凝血酶活性量效關(guān)系

取50 mL(批號(hào)：12040312)疏血通注射液，減壓濃縮(50～60 ℃)至干，殘?jiān)铀芙獠⑼耆D(zhuǎn)移至5 mL量瓶中，加水至刻度，搖勻，則濃縮藥液濃度為10 mL原液·mL-1；將濃縮藥液與純水以相應(yīng)比例混合，制成10個(gè)劑量梯度疏血通藥液作為測(cè)試用樣品溶液，依次編號(hào)為1～10號(hào)。精密量取以上測(cè)試用樣品溶液各100 μL，置適宜白瓷板中，照凝血酶滴定法操作，記錄滴定終點(diǎn)時(shí)間和消耗凝血酶活性單位，按公式計(jì)算抗凝血酶活性?；钚詼y(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1，消耗凝血酶活性單位、抗凝血酶活性與疏血通注射液的量效關(guān)系曲線見(jiàn)圖1。

表1 不同劑量疏血通注射液抗凝血酶活性測(cè)定

注：*表示加入滴定體系中測(cè)試用樣品溶液相當(dāng)于注射液原液的體積(mL)。

圖1 不同劑量疏血通注射液消耗凝血酶活性單位曲線圖

由圖1可見(jiàn)，當(dāng)?shù)味w系中加入疏血通注射液0.20～0.22 mL時(shí)，其滴定終點(diǎn)時(shí)間和消耗凝血酶活性單位與0.9%氯化鈉溶液相當(dāng)，此為凝血酶滴定液的空白消耗；而當(dāng)加入疏血通注射液劑量在0.28～0.44 mL時(shí)，疏血通注射液劑量與消耗的凝血酶活性單位均呈良好線性關(guān)系，因此在此區(qū)間內(nèi)可以較準(zhǔn)確測(cè)定抗凝血活性，當(dāng)疏血通注射液劑量大于0.6 mL時(shí)，其抗凝血酶活性太強(qiáng)，需消耗較多的凝血酶滴定液，會(huì)在一定程度上擴(kuò)大滴定體系(酶反應(yīng)體系)，出現(xiàn)無(wú)法確定滴定終點(diǎn)的現(xiàn)象。

3.2 凝血酶滴定法測(cè)定疏血通注射液抗凝血酶活性

分別精密量取3批疏血通注射液樣品各6.0 mL，按2.1中方法操作，計(jì)算抗凝血酶活性，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 疏血通注射液抗凝血酶活性測(cè)定表

3.3 血凝儀測(cè)定法測(cè)定疏血通注射液的抗凝活性

SD大鼠10%水合氯醛麻醉后，腹主動(dòng)脈取血，靜置1 h后，3000 r·min-1離心15 min制備大鼠血漿，在測(cè)量杯中加入10～50 μL疏血通注射液后，以肝素鈉(2 U·mL-1)作為陽(yáng)性對(duì)照，按北京普利生公司APTT、PT、TT試劑盒方法操作，測(cè)定各自血液凝固時(shí)間。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，疏血通注射液在10～50 μL均不能有效延長(zhǎng)APTT和PT，而對(duì)于TT的延長(zhǎng)呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系，見(jiàn)表3。TT按說(shuō)明書操作，加入50 μL疏血通注射液后，測(cè)定3批疏血通注射液的大鼠血漿TT，見(jiàn)表4。

表3 不同劑量疏血通注射液對(duì)大鼠血漿凝血酶時(shí)間的影響(n=5)

注：疏血通注射液批號(hào)為12040312。

表4 3批疏血通注射液的大鼠血漿凝血酶時(shí)間(n=5)

圖2所示的凝血酶凝血過(guò)程是一系列凝血因子被相繼酶解激活的過(guò)程，最終生成凝血酶，形成纖維蛋白凝塊[8]。凝血過(guò)程通常分為內(nèi)源性凝血途徑、外源性凝血途徑和共同凝血途徑。臨床上常以APTT來(lái)反映體內(nèi)內(nèi)源性凝血途徑的狀況，以PT測(cè)定來(lái)反映外源性凝血途徑的狀況。APTT涉及到凝血因子Ⅱ、Ⅴ、Ⅷ、Ⅹ、Ⅺ、Ⅻ，前血管舒張素及高分子量激肽酶；PT涉及的凝血因子主要有Ⅱ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ。從因子Ⅹ被激活至纖維蛋白形成，是內(nèi)源、外源凝血的共同凝血途徑，涉及到的凝血因子主要是Ⅹ、Ⅱ。從實(shí)驗(yàn)分析，疏血通注射液對(duì)于APTT和PT均沒(méi)有作用，只能延長(zhǎng)TT，其作用的凝血過(guò)程應(yīng)該是共同凝血途徑階段，凝血酶可能是其主要的抗凝作用靶點(diǎn)。

圖2 凝血因子參與的凝血過(guò)程示意圖

3.4 FRET法檢測(cè)疏血通注射液的抗凝血酶活性

按前述AnaSpec公司試劑盒方法操作，考察疏血通注射液(批號(hào)：12040312)對(duì)凝血酶活性的量效關(guān)系，結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖3可見(jiàn)，疏血通注射液在低濃度時(shí)對(duì)凝血酶活性的影響存在較大的誤差，且抑制曲線不規(guī)則；高濃度的疏血通注射液(體系中加入16 μL以上時(shí))對(duì)凝血酶的抑制呈現(xiàn)類似的線性關(guān)系，這與3.1中凝血酶滴定法所得結(jié)果一致。水蛭中的水蛭素為迄今為止發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)的天然凝血酶抑制劑，水蛭素對(duì)凝血酶的抑制作用相對(duì)獨(dú)立，無(wú)需其他凝血因子或血漿成分參與，與凝血酶和纖維蛋白原以特定比例結(jié)合成復(fù)合物，通過(guò)對(duì)凝血酶特異性的直接抑制作用阻斷其凝血功能[9]。筆者曾運(yùn)用本法測(cè)定水蛭素對(duì)凝血酶的抑制作用，呈現(xiàn)比較完美的線性關(guān)系。推測(cè)疏血通注射液中可能含有水蛭素相似的肽類分子，對(duì)于凝血酶有類似的線性抑制。

圖3 疏血通注射液抗凝血酶活性的量效關(guān)系圖

運(yùn)用上述方法，對(duì)3批疏血通注射液進(jìn)行測(cè)定(加入樣品量16 μL)，發(fā)現(xiàn)3批疏血通注射液抗凝血酶活性比較接近，說(shuō)明產(chǎn)品具有良好的均一性。相關(guān)數(shù)據(jù)見(jiàn)表5。

表5 疏血通注射液的抗凝血酶活性

4 結(jié)論

疏血通注射液由于其制備工藝中僅保留了水蛭、地龍藥材中的活性小分子成分，其藥理作用相對(duì)溫和，臨床使用過(guò)程中出血性傾向等不良反應(yīng)較少，但這也給其活性測(cè)定方法的開(kāi)發(fā)帶來(lái)一定的難度。本研究采用體外試驗(yàn)為主，比較了傳統(tǒng)的凝血酶滴定法(挑絲法)、臨床上常用的血凝儀測(cè)定法、以及FRET抗凝血酶生物活性測(cè)定法。凝血酶滴定法(挑絲法)操作相對(duì)簡(jiǎn)單，不需要復(fù)雜的儀器設(shè)備，但該方法靠人工挑絲來(lái)肉眼觀察滴定終點(diǎn)，存在一定的操作誤差。且該方法靈敏度較低，需疏血通注射液凍干濃縮后在一定的劑量范圍內(nèi)方可使用本方法。血凝儀測(cè)定方法需要采取新鮮血漿進(jìn)行測(cè)定，受血漿來(lái)源影響其方法的實(shí)施和推廣有一定的難度。FRET法靈敏度相對(duì)較高，采用注射液原液即可測(cè)定，方法比較穩(wěn)定，是一種可靠的生物活性測(cè)定方法，但需要具備一定的儀器和試劑條件。

對(duì)疏血通注射液的抗凝機(jī)制分析可以發(fā)現(xiàn)，疏血通注射液對(duì)APTT和PT均沒(méi)有影響，僅對(duì)TT有一定的延長(zhǎng)，說(shuō)明其作用的凝血過(guò)程應(yīng)該是共同凝血途徑階段。而挑絲法和FRET方法均針對(duì)凝血酶進(jìn)行測(cè)定，因此推測(cè)凝血酶可能是疏血通注射液主要的抗凝作用靶點(diǎn)。

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StudyonAssayMethodsandMechanismofAnticoagulantActivityofShuxuetongInjection

ZHANG Zhongbing1，2*，WANGSiyao1，2，ZHENGShunliang1，2，XIAKe1，2，LIZhichuan3，CHENYanming1，2，4

(1.BeijingYouboPharmaceuticalCorporation，Ltd.，Beijing101300，China；2.MudanjiangYouboPharmaceuticalCorporation，Ltd.，Mudanjiang157013，China；3.UniversityofToledo，Ohio43614，theUnitedStatesofAmerica；4.CollegeofPharmaceuticalScienceandTechnology，TianjinUniversity，Tianjin300192，China)

Objective：To establish the methods of Shuxuetong Injection’s anticoagulant activity assay and study the mechanism of its anticoagulation.Methods：Three test methods were developed and compared，which werethrombin titration method included in Chinese Pharmacopoeia，determination of plasma coagulation by analyzer commonly used in clinical and thrombin activity assaythrough fluorescence resonance energy transfer(FRET) kit.Results：All the methods couldbe used to determine the Shuxuetong Injection’s activity，but the FRET method wasmore stable and sensitive，with less human operation error.Conclusion：Three anticoagulant activityassay methods were established.Through determination of the activated partial thromboplastintime(APTT)，prothrombin time(PT)，thrombin time(PT)，and the inhibition of the thrombin activity，thrombinhad been identified as the anticoagulant target of Shuxuetong Injection.

Shuxuetong Injection；anticoagulant；thrombin

2015-06-12)

重大新藥創(chuàng)制國(guó)家科技重大專項(xiàng)(2014ZX09201022-010)

*

張忠兵，博士，高級(jí)工程師，研究方向：心血管藥理學(xué)，Tel:(010)89491757,E-mail:okzzb2000@sina.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.5.006