徐元江，甄梓娟，許永強，曹芳，廖志華，蘭小中*

(1.西藏大學(xué) 農(nóng)牧學(xué)院 藥用植物研究中心，西藏 林芝 860000； 2.西南大學(xué)-西藏大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院 藥用植物聯(lián)合研發(fā)中心/西南大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，重慶 400715)

·中藥農(nóng)業(yè)·

藏藥匙葉翼首草的快繁技術(shù)研究△

徐元江1，甄梓娟1，許永強1，曹芳2，廖志華2，蘭小中1*

(1.西藏大學(xué) 農(nóng)牧學(xué)院 藥用植物研究中心，西藏 林芝 860000； 2.西南大學(xué)-西藏大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院 藥用植物聯(lián)合研發(fā)中心/西南大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，重慶 400715)

目的：建立藏藥匙葉翼首草組培快速繁殖體系。方法：采用不同濃度的植物生長調(diào)節(jié)劑誘導(dǎo)產(chǎn)生叢生芽與根，并篩選三種不同栽培基質(zhì)。結(jié)果：最好的消毒條件為75%酒精處理30 s+2.5% NaClO處理2.5 min+MS液(含2.5% PPM抗菌劑)處理3小時。誘導(dǎo)叢生芽的最佳培養(yǎng)基為MS+6BA 3 mg·L-1+NAA 0.5 mg·L-1，其次為MS+6BA 3 mg·L-1+NAA 0.2 mg·L-1。叢生芽生根的適宜培養(yǎng)基為MS+NAA 0.2 mg·L-1，小苗最適宜栽培基質(zhì)為蛭石：珍珠巖=1∶1。結(jié)論：通過本研究的方法可得到翼首草無菌苗與再生苗。

匙葉翼首草；萌發(fā)；快繁；組培

翼首草為常用藏藥材，屬川續(xù)斷科(Dipsacaceae)翼首草屬Pterocephalus多年生草本，以全草入藥，藏語音譯名稱“榜子毒烏”、“榜孜毒烏”、“榜孜奪吾”等。在“南派藏醫(yī)藥”中，翼首草被喻為地上“七種仙草”之一[1]，系西藏自治區(qū)二級瀕危藏藥材品種之一。在《四部醫(yī)典》、《晶珠本草》等藏醫(yī)典籍均有記載?！吨腥A人民共和國藥典》規(guī)定其基原為匙葉翼首草Pterocephalushookeri(C.B.Clarke)H?eck，味苦，性寒；有小毒，解毒除瘟，清熱止痢，祛風(fēng)通痹[2]。翼首草生于海拔1800～4800 m的山野草地、高山草甸及耕地附近，分布于云南、四川、西藏東部和青海南部等藏區(qū)[3]。藥理研究表明，翼首草含有三萜皂苷類、環(huán)烯醚萜苷類、生物堿及多糖等，具有顯著的抗炎、鎮(zhèn)痛及免疫調(diào)節(jié)等作用[4]。最近郭晨旭研究表明其提取物還有一定抗腫瘤的功效[5]。

目前有關(guān)翼首草的研究主要有種子萌發(fā)[6-7]及人工栽培技術(shù)[8-9]，化學(xué)成分[10-12]，藥理活性與臨床應(yīng)用[13-14]，質(zhì)量體系[15]等方面。關(guān)于翼首草組培與快繁技術(shù)的研究尚未見報道。植物組培技術(shù)在藥用植物中大量應(yīng)用，可以使難以有性繁殖的藥用植物大量增殖，減少對環(huán)境的依賴與破壞，保存與繁殖瀕臨滅絕的藥材資源[16]。本實驗對翼首草快繁技術(shù)體系進(jìn)行了初步探索，可以在較短時間內(nèi)獲取大量的幼苗用于生產(chǎn)種植，為今后開展相基因工程等后續(xù)工作提供支持。

1 材料與方法

1.1 材料

匙葉翼首草種子采自西藏林芝市西藏大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院牧場，僅西藏大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院蘭小中教授鑒定為匙葉翼首草P.hookeri。

1.2 試劑

蔗糖、無水乙醇等購自重慶川東化工廠；NaClO溶液(5.5%活性氯)購于成都市科龍化工試劑廠；PPM抗菌劑購于Plant Cell Technology公司；6BA，NAA分析純購于Sigma；其他試劑均為分析純。

1.3 方法

1.3.1 無菌苗萌發(fā)將種子剝?nèi)ネ夥N皮，選取飽滿正常的種子，放在培養(yǎng)瓶中，用紗布封好瓶口，自來水沖洗30 min。按表1的5種消毒方式進(jìn)行種子消毒，每種消毒劑處理后用無菌水沖洗3～5次。每種消毒處理選取種子30粒，在25 ℃，光照培養(yǎng)2周，統(tǒng)計種子污染率等數(shù)據(jù)。

1.3.2 翼首草增殖將萌發(fā)的無菌苗接到MS培養(yǎng)基的罐子中培養(yǎng)2個月。每苗取2～4片成熟葉片，去掉葉尖與葉柄，剪成0.5～0.8 cm長的葉段。將葉面朝上放置，葉的邊緣切口插入加不同植物生長調(diào)節(jié)劑的MS培養(yǎng)基(見表2)。每個處理12段葉片，設(shè)置3個重復(fù)。

1.3.3 翼首草芽生根處理將翼首草叢生芽放于無菌培養(yǎng)皿中，用鑷子與解剖刀分開叢生芽。選取大小相近，生長狀態(tài)良好的芽，插入MS加不同濃度的NAA的培養(yǎng)基中，深度約為0.5 cm，誘導(dǎo)生根，每個處理10株苗(表3)。

1.3.4 翼首草煉苗與移栽選取培養(yǎng)瓶中生長健壯，大小一致的翼首草幼苗，打開瓶口。煉苗3 d后洗凈根部的培養(yǎng)基，分別種植在三種栽培基質(zhì)(表4)，三種培養(yǎng)基質(zhì)提前混勻并用含0.1%花無缺的水澆透。翼首草幼苗在溫室培養(yǎng)3d后放到室外培養(yǎng)。

1.3.5 統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)錄入與整理用EXECL 2013，統(tǒng)計分析使用SPSS 16.0。

1.3.6 MS培養(yǎng)基pH值在5.80～5.85，瓊脂粉8.0 g·L-1，蔗糖30 g·L-1，121 ℃的條件下滅菌20 min。組培室溫度25℃左右，相對濕度40%左右，光照16 h·d-1，光照強度約為1400 Lx。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同消毒方式的效果

消毒處理5的消毒效果最好，特別是對于霉菌污染的種子具有較強的消毒能力，同時對種子的損害較小。消毒處理3雖然沒有污染，但是種子已經(jīng)失活，結(jié)果詳情見表1。

表1 翼首草種子不同消毒方式的效果

2.2 翼首草增殖

翼首草是多年生無莖草本，用于進(jìn)行快繁的組織有根、葉與莖尖。前期實驗發(fā)現(xiàn)其根的再生能力弱，不易出芽；莖尖較小剝?nèi)‰y度大，來源少且剝?nèi)∵^程易損傷故不適于進(jìn)行快繁。在MS固體培養(yǎng)基中加細(xì)胞分裂素6BA(分別為：1 mg·L-1、2 mg·L-1、3 mg·L-1、4 mg·L-1)與生長素NAA(分別為：0.2 mg·L-1、0.5 mg·L-1、1 mg·L-1、2 mg·L-1)。當(dāng)6BA/NAA值大于3才有芽產(chǎn)生，在一定的范圍內(nèi)隨著6BA/NAA的值增加，芽的數(shù)量與質(zhì)量呈現(xiàn)增加的趨勢。當(dāng)6BA與NAA均為較高濃度時，僅僅能誘導(dǎo)出愈傷組織。翼首草芽誘導(dǎo)激素濃度范圍較廣，其中6BA為2 mg·L-1至4 mg·L-1，NAA為0.2 mg·L-1至1 mg·L-1均能誘導(dǎo)出芽。本實驗中最佳芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為7號，5號(表2)。

2.3 芽生根處理

生根培養(yǎng)基中的芽大約10 d開始生根，20 d根生長趨于穩(wěn)定。翼首草生根較容易，在未添加NAA時生根較慢；在MS+NAA 0.2 mg·L-1的培養(yǎng)基最好，根生長較快，根數(shù)適中；在較高濃度的MS+NAA 0.5 mg·L-1時根最多但較短，可能是較高濃度NAA對根的誘導(dǎo)有促進(jìn)作用卻對根生長有一定抑制作用。

表2 不同激素配方對翼首草芽誘導(dǎo)的影響

注：叢生芽的數(shù)量：++++>+++>++>+>0，不同小寫字母間表示不同處理的差異達(dá)到顯著水平(P<0.05)

表3 不同栽培基質(zhì)對翼首草再生芽生根的影響

2.4 煉苗與移栽

選取大小適中的再生苗在25 ℃溫室中打開培養(yǎng)瓶瓶口，培養(yǎng)2 d后取出并洗凈根部培養(yǎng)基分別放入不同的栽培基質(zhì)。一周后統(tǒng)計成活率，發(fā)現(xiàn)根部特別容易感染霉菌，根部腐爛而枯萎。翼首草適應(yīng)西藏相對干燥的生長環(huán)境，在透氣較好，較干燥的1號栽培基質(zhì)中成活率相對較高為25%，而在菜園土等較多的3號基質(zhì)中存活率為0。

表4 翼首草栽培基質(zhì)篩選

注：A.萌發(fā)一周翼首草幼苗；B.翼首草葉再生出的叢生芽； C.翼首草生根的再生苗；D.翼首草再生苗移栽圖1 翼首草快繁的各階段

3 結(jié)論與討論

植物生長調(diào)節(jié)劑的種類與比例對于愈傷組織和叢生芽誘導(dǎo)具有重要影響，一般細(xì)胞分裂素與生長素的比值大于1促進(jìn)生芽，小于1促進(jìn)生根。翼首草葉片在一定激素濃度范圍內(nèi)，6BA/NAA值大于4時有芽形成，比例為6時芽最多如激素處理7；處于高激素濃度時如激素處理8，則僅產(chǎn)生愈傷組織。翼首草葉片通過激素誘導(dǎo)產(chǎn)生叢生芽見圖1 b。

翼首草種子成熟季節(jié)是雨季易感染霉菌，且缺乏堅硬的外種皮保護(hù)，消毒過度易失活。種子采集后應(yīng)及時曬干并在4 ℃陰涼環(huán)境中保存，可較好保證種子活力。翼首草的芽再生時使用培養(yǎng)皿沒有培養(yǎng)瓶的效果好，培養(yǎng)皿中可見芽點，但培養(yǎng)基表面積較大，水分蒸發(fā)較快對培養(yǎng)基激素濃度改變較大，葉片易褐化死亡；培養(yǎng)瓶因為生長空間多、培養(yǎng)基較多更適于翼首草的快繁。翼首草再生苗煉苗與移栽過程可以通過控制水分，可以添加抗菌劑如多菌靈等方法增加存活幾率。

隨著藏藥產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，翼首草的需求量也將增大。目前匙葉翼首草的來源主要是野外采集，僅見有少量的人工栽培。通常翼首草以干燥全草藥用，采收后需播種育苗而種子來源較少又不易儲藏，種子質(zhì)量與數(shù)量難以保證，采用翼首草葉片作為快繁材料，采用快繁技術(shù)將有望解決種子資源不足的問題。

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RapidPropagationTechniqueforTissueCultureofPterocephalushookeri

XU Yuanjiang1，ZHEN Zijuan1，XU Yongqiang1，CaoFang2，LIAO Zhihua2，LAN Xiaozhong1*

(1.MedicinalPlantsResearchCentre，Agricultural&AnimalHusbandryCollegeofTibetUniversity，Nyingchi860000，China； 2.SWU-TAAHCMedicinalPlantsJointResearchandDevelopmentCentreSchoolofLifeSciences，SouthwestUniversity，Chongqing400715，China)

Objective：In order to establish the tissue culture rapid propagation system of Tibetan medicine ofPterocephalushookeri.Methods：The study took leaves as materials and adopted different concentration of plant growth regulators to induce cluster buds and roots，and then screened three different growing media.Results：The best disinfection conditions was for 30 s of 75 % alcohol，2.5 min of 2.5% NaClO，3 hours of MS liquid medium (containing 2.5 % PPM).It suggested that the best medium for inducing cluster buds is MS + 6BA 3 mg·L-1+ NAA 0.5 mg · L-1，and the second is MS+6BA 3 mg · L-1+ NAA 0.2 mg · L-1.The most suitable medium of inducing roots is MS + NAA 0.2 mg · L-1.The optimal cultivation substrate is vermiculite：perlite=1∶1.Conclusion：The sterile seedling and regeneration plants can be obtained by the study.

Pterocephalushookeri；germinate；propagation；tissue culture

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.10.014

2016-01-19)

西藏自治區(qū)重大科技計劃(20131225)；藏藥材資源與開發(fā)利用創(chuàng)新團(tuán)隊建設(shè)；西藏特色農(nóng)牧資源研發(fā)協(xié)同創(chuàng)新中心；西藏大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院研究生創(chuàng)新計劃項目(YJS2015-03)

*

蘭小中，教授，研究方向：藥用植物資源與開發(fā)利用；Tel：(0894)5826471，E-mail：lanxiaozhong@163.com