何江，程波，徐元，姚松伯，楊偉俊

(1.新疆維吾爾自治區(qū)藥物研究所 新疆維吾爾藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 烏魯木齊 830004.)

·專題·

基于ITS2條形碼鑒定維藥藥西瓜及其誤用品△

何江，程波，徐元，姚松伯，楊偉俊*

(1.新疆維吾爾自治區(qū)藥物研究所 新疆維吾爾藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 烏魯木齊 830004.)

目的：采用ITS2條形碼對(duì)維吾爾藥材藥西瓜及其誤用品栝樓、羅漢果進(jìn)行分子鑒定，以確保藥材質(zhì)量及臨床療效。方法：提取維吾爾藥材藥西瓜及其誤用品栝樓、羅漢果的DNA，并對(duì)藥材進(jìn)行PCR擴(kuò)增其ITS2 (internal transcribed spacer 2)并雙向測(cè)序，經(jīng)CodonCode Alingner V3.0 對(duì)其測(cè)序峰圖進(jìn)行校對(duì)拼接后，用MEGA6.05軟件計(jì)算種內(nèi)種間遺傳距離K2P (kimura 2-parameter)，并構(gòu)建鄰接系統(tǒng)聚類樹NJ(neighbor-joingtree，NJTree)。結(jié)果：提取維吾爾藥材藥西瓜及誤用品栝樓、羅漢果基因組DNA后，經(jīng)檢測(cè)具降解現(xiàn)象，但仍可通過PCR擴(kuò)增獲得三者的ITS2序列；藥西瓜與誤用品之間的K2P遺傳距離遠(yuǎn)大于藥西瓜種內(nèi)遺傳距離；NJ系統(tǒng)聚類樹結(jié)果表明能將藥西瓜與其誤用品區(qū)分開來，單獨(dú)聚為一類。結(jié)論：ITS2條形碼可準(zhǔn)確鑒別維吾爾藥材藥西瓜及其誤用品，為藥西瓜的質(zhì)量和臨床用藥安全提供了鑒定依據(jù)。

藥西瓜；ITS2條形碼；鑒定；誤用品

前言

維吾爾族常用藥材藥西瓜又稱之為苦西瓜、苦蘋果。為葫蘆科植物苦藥西瓜Citrulluscolocynthis(L.)Schrad.成熟干燥的果實(shí)，具有清熱瀉火、健胃消食、治療各種頭痛、關(guān)節(jié)炎、月經(jīng)不通、驅(qū)痰證、黑膽液、神經(jīng)性痰病等療效[1-2]。藥西瓜主要分布于亞洲的西部、中部、地中海地區(qū)、歐洲的西部以及及南部、非洲北部。其原產(chǎn)于亞洲熱帶及非洲地區(qū)。由于藥西瓜主要由國(guó)外進(jìn)口，最近幾十年來，隨著維吾爾醫(yī)藥學(xué)的迅速發(fā)展，藥西瓜的進(jìn)口量早已不能滿足臨床用藥的需求。目前，在新疆維吾爾自治區(qū)的和田、瑪納斯等地雖有栽培，但均處于試驗(yàn)性質(zhì)，產(chǎn)量甚微，因而出現(xiàn)了供不應(yīng)求的局面，故在維吾爾藥材市場(chǎng)出現(xiàn)了以其同科植物如栝樓、羅漢果等藥材替代藥西瓜誤用于臨床的現(xiàn)象，影響了臨床用藥安全與準(zhǔn)確[2]。其誤用品栝樓為葫蘆科植物栝樓TrichosantheskirilowiiMaxim.及雙邊栝樓TrichosanthesrosthoriniiHarms.成熟干燥的果實(shí)[3-4]，羅漢果為葫蘆科植物羅漢果Siraitiagrosvenorii(Swingle) C.jeffery.成熟干燥的果實(shí)[5]。雖然三者同為葫蘆科植物，但栝樓和羅漢果均屬于中醫(yī)用藥，據(jù)考證在維吾爾醫(yī)學(xué)史籍中無臨床應(yīng)用的記載。藥西瓜的藥性、功能主治、有效化學(xué)成分、藥理作用等均與栝樓、羅漢果不同，不可以相互替使代用[6-9]。本研究利用了植物DNA條形碼中ITS2序列對(duì)維吾爾藥材藥西瓜及其誤用品栝樓、羅漢果進(jìn)行鑒定研究，為該藥材準(zhǔn)確快速鑒定提供科學(xué)依據(jù)，以確保藥材質(zhì)量以及臨床安全用藥。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

1.1.1 材料 實(shí)驗(yàn)材料均于2011年至2015年收集，來源見表1.包括實(shí)驗(yàn)樣品及來自于Genbank下載的序列。所有樣品由新疆維吾爾自治區(qū)藥物研究所何江副研究員鑒定，樣品保存于新疆維吾爾自治區(qū)藥物研究所。

表1 樣品來源

1.1.2 試劑 三氯甲烷(天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司)、Taq酶、dNTPs、Buffer、引物、植物基因組DNA提取試劑盒均購(gòu)自北京天根生物科技有限公司，瓊脂糖(Biowest 111860Regular AGAROSE G-10 西班牙)。

1.1.3 儀器 高速低溫離心機(jī)Eppendorf 5424型(德國(guó)Eppendorf公司)；PCR儀BIO-RAD C-1000TM (美國(guó))；凝膠成像儀BIO-RAD Del DocTMXR+(美國(guó))。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 依據(jù)北京天根生物科技有限公司植物基因組DNA提取試劑盒說明書操作提?。?/p>

1.2.2 PCR擴(kuò)增、瓊脂糖核酸電泳檢測(cè)及測(cè)序 參照WU Jin-song等人ITS2基因擴(kuò)增方法[10-11]，ITS2 PCR擴(kuò)增正向引物為ITS2F：5′-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3′，反向引物為ITS3R：5′-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3′。PCR反應(yīng)體系體積為30 μL，體系內(nèi)含Taq酶0.3 ul、PCR buffer 3.0 μL、dNTP 3.0 μL、正反向引物各1 μL、H2O 16.7 ul、總DNA 5 ul。PCR反應(yīng)體系條件為：94 ℃，5 min；94 ℃，30 s；56 ℃，30 s；72 ℃，45 s；40 cycles；72 ℃，10 min。之后在1%瓊脂糖核酸電泳檢測(cè)，檢測(cè)合格后PCR產(chǎn)物直接交由北京華大基因公司進(jìn)行雙向測(cè)序。

1.2.3 序列處理 將測(cè)序峰圖應(yīng)用Codon Code Aligner V3.0軟件進(jìn)行校對(duì)與拼接，去除低質(zhì)量序列以及引物區(qū)，獲得ITS2序列，使用基于隱馬爾可夫模型的HMMer注釋方法[12]，去除兩端5.8S和28S區(qū)段獲得ITS2間隔區(qū)序列，待用。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析 將所有序列用軟件MEGA6.05分析比對(duì)，并基于Kimura2-parameter(K2P)模型進(jìn)行種內(nèi)種間遺傳距離分析。所得序列采用構(gòu)建鄰接(NJ)系統(tǒng)聚類樹對(duì)藥西瓜及其誤用品進(jìn)行鑒定分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA提取及PCR擴(kuò)增

提取藥西瓜、栝樓及羅漢果樣品基因組DNA，結(jié)果如圖1所示，4份藥西瓜樣品、4份栝樓樣品和2份羅漢果樣品的DNA經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳后4份藥西瓜樣品和4份栝樓樣品的DNA出現(xiàn)有彌散現(xiàn)象的條帶，而2份羅漢果樣品的DNA則未出現(xiàn)條帶。將提取藥西瓜、栝樓及羅漢果樣品基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。結(jié)果如圖2所示，4份藥西瓜樣品、4份栝樓樣品和2份羅漢果樣品的ITS2序列經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳后均出現(xiàn)清晰、單一條帶。說明藥材DNA雖有降解，但仍可通過PCR擴(kuò)增獲得其ITS2序列。

注：M：Marker；1～4：藥西瓜；5～8：栝樓；9、10：羅漢果圖1 DNA提取電泳結(jié)果

注：M：Marker；1～4：藥西瓜；5～8：栝樓；9、10：羅漢果圖2 ITS2 PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.2 藥西瓜與其誤用品植物ITS2序列種內(nèi)和種間比較

根據(jù)K2P參數(shù)遺傳距離模型計(jì)算得到的序列間遺傳距離，見表2.藥西瓜種內(nèi)K2P距離為0～0.044，栝樓種內(nèi)K2P距離為0～0.005，羅漢果種內(nèi)K2P距離為0.014.藥西瓜與栝樓的種間的K2P距離為0～0.156，藥西瓜與羅漢果種間K2P距離為0.044～0.166.經(jīng)各樣本種內(nèi)種間遺傳距離分析結(jié)果表明基原物種與誤用品之間的遺傳距離遠(yuǎn)大于藥西瓜種內(nèi)遺傳距離。因此，ITS2序列能夠?qū)⑺幬鞴吓c其誤用品區(qū)分開。

2.3 藥西瓜及其誤用品NJ樹

基于ITS2序列，通過鄰接法(NJ)所構(gòu)建的系統(tǒng)聚類樹圖(圖3)可以看出藥西瓜4個(gè)樣品單獨(dú)聚為一支，栝樓4個(gè)樣品單獨(dú)聚為一支，羅漢果2個(gè)樣品單獨(dú)聚為一支。可明顯將藥西瓜與其誤用品區(qū)分，

表2 ITS2序列的K2P遺傳距離

表明ITS2條形碼可以準(zhǔn)確的鑒別藥西瓜與其誤用品栝樓、羅漢果。

圖3 基于TIS2序列構(gòu)建的藥西瓜及其誤用品的鄰接(NJ)樹

3 討論

ITS2是真核生物rDNA上的一段順反子，在種間具有顯著的特異性，被廣泛用于物種分類、系統(tǒng)進(jìn)化和植物條形碼研究。同時(shí)中藥材不同于新鮮的樣品，其DNA在生產(chǎn)過程經(jīng)過加工、炮制等過程，必定會(huì)發(fā)生不同程度的降解，ITS2序列短，更有利于獲取發(fā)生降解的樣本序列，這對(duì)于中藥材DNA條形碼在實(shí)際中的應(yīng)用具有重要的意義[13]。本研究結(jié)果也表明，藥西瓜、栝樓以及羅漢果藥材樣本采用試劑盒一般都能成功提取其DNA，而且發(fā)現(xiàn)其基因組DNA電泳呈彌散狀態(tài)，少數(shù)不可見，這說明藥材樣品DNA已經(jīng)發(fā)生了一定程度的降解。但其ITS2擴(kuò)增產(chǎn)物電泳后都可以出現(xiàn)單一明亮條帶并測(cè)序成功，這表明ITS2條形碼易于擴(kuò)增，確實(shí)適合于本研究藥材的鑒定。

李妮[14]等曾葫蘆科的新鮮的實(shí)驗(yàn)樣本進(jìn)行ITS2條形碼研究，在屬水平上的鑒定成功率是100%，種水平可達(dá)88.5%。這是由于ITS2序列可基于隱馬爾可夫模型去除兩端5.8S和26S區(qū)段，獲得完整ITS2間隔區(qū)序列，使后續(xù)數(shù)據(jù)處理更準(zhǔn)確可靠，這也是目前其他候選條形碼序列不具備的優(yōu)勢(shì)[13]。而本實(shí)驗(yàn)利用干燥的藥材樣品(最早為2011年樣品)也獲得了完整ITS2序列，并通過數(shù)據(jù)分析，發(fā)現(xiàn)藥西瓜及其誤用品間種內(nèi)最大K2P距離均小于種間最小K2P

距離，鄰接NJ樹中藥西瓜與其誤用品各自分別聚為一支，可明顯的把藥西瓜與其誤用品栝樓、羅漢果區(qū)分開。因此，應(yīng)用ITS2條形碼能夠準(zhǔn)確快速鑒定維吾爾藥材藥西瓜與其誤用品，為藥西瓜的質(zhì)量和臨床用藥安全提供了鑒定依據(jù)。

[1] 苗靜，張潔，鄧世明，等.維藥藥西瓜化學(xué)成分的分離與鑒定[J].中草藥，2012，43(3)：432-435.

[2] 張彥福.維吾爾藥材真?zhèn)舞b別[M].烏魯木齊：新疆美術(shù)攝影出版社，新疆電子音像出版社.2007：155-166.

[3] 葛洪，劉暢.瓜蔞的化學(xué)成分及藥理活性研究進(jìn)展[J].浙江臨床醫(yī)學(xué)，2014，16(9)：1496-1497.

[4] Li A F，Zhang Y Q.Research Advance on Chemical Constituents in Trichosanthes kirilowii Maxim[J].Journal of Anhui Agri.Sci.2012，40(30)：14713-14716.

[5] 陳瑤，賈恩禮.羅漢果化學(xué)成分和藥理作用的研究進(jìn)展[J].解放軍藥學(xué)學(xué)報(bào)，2011，27(2)：171-174.

[6] 周秋鴻，李東，徐穎，等.藥西瓜對(duì)小腸功能的影響[J].中醫(yī)藥信息，2001，18(3)：25-26.

[7] 王勤，覃洪含，王巍，等.羅漢果藥理研究進(jìn)展[J].廣西中醫(yī)院學(xué)報(bào)，2010，13(3)：75-76.

[8] 宋振巧，王洪剛，王建華.栝樓的研究進(jìn)展[J].山東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2005，5：72-74.

[9] 黃輝，張峻沛，張彥福.維吾爾藥苦西瓜本草考證及生藥鑒定[J].中國(guó)民族民間醫(yī)藥雜志，1997，28：35-38.

[10] Chen S L，Yao H，Han J P，et al.Validation of the ITS2 Region as a Novel DNA Barcode for Identifying Medicinal Plant Species[J].PLoS ONE，2010，5(1)：e8613.

[11] 陳士林.中藥DNA條形碼分子鑒定[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2012：14

[12] Alexander K，Tian S，J?rg S，et al.5.8S-28S rRNA interaction and HMM-based ITS2 annotation[J].Gene，2009，430：50-57.

[13] Kress W J，Wurdack K J，Zimmer E A，et a1.Use of DNA barcodes to identify flowering plants[J].Proc Natl Acad Sci USA，2005，102：8369-8374.

[14] 李妮，陳士林，劉義梅，等.葫蘆科植物通用DNA條形碼的篩選[J].中草藥，2011 42(7)；1396-1401.

MolecularIdentificationofUyghurMedicineCitrullusColocynthisFructusandIt’sMisuseSpeciesBasedonITS2barcode

HE Jiang，CHENG Bo，XU Yuan，YAO Songbo，YANG Weijun*

(UygurMedicinekeylabofXinjiangInstituteofMateria，Urumqi830004，China)

Objective：To identify Uyghur medicine Citrullus Colocynthis Fructus (Citrulluscolocynthis(L.) Schrad.) and it’s misuse species Trichosanthis Fructus (TrichosantheskirilowiiMaxim.)，Siraitiae Fructus (Siraitiagrosvenorii(Swingle) C.Jeffery.) by using ITS2 (internal transcribed spacer 2) barcode，which would guarantee the quality and clinical effect of this medical material.Methods：DNA extracted from Citrullus Colocynthis Fructus and it’s both misuse species were used as template，the ITS2 region was amplified by PCR and sequenced bidirectionally.ITS2 sequences were collated and matched by using Codon Code Aligner V3.0，K2P (kimura 2-parameter) model using MEGA 5.0 software and neighbor-joining(NJ)phylogenetic tree was established.Result：DNA of Uyghur medicines Citrullus Colocynthis Fructus and it’s both misuse species were extracted，which had degraded，but which ITS2 sequences could still been obtained by PCR.the intra-specific genetic distances were also smaller than inter-specific one.Results of NJ phylogenetic tree showed that Citrullus Colocynthis Fructus could be distinguished from its misuse species and classified into a separate one.Conclusion：ITS2 barcode can accurate identification of Citrullus Colocynthis Fructus and its misuse species，and provide reference for quality and safety using of Citrullus Colocynthis Fructus.

Citrullus Colocynthis Fructus；ITS2 barcode；identify；misuse species

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.10.005

2016-01-18)

“歐矢車菊根”等進(jìn)口及地產(chǎn)維藥材標(biāo)準(zhǔn)的建立與提高(201130105-2)

*

楊偉俊，研究員，研究方向：藥用植物資源；Tel：0991-2320292，E-mail：wilfred3106@163.com