蔡鵬，吳嬋榕，劉華英*，唐婭娜

(1.廣西師范大學(xué) 漓江學(xué)院，廣西 桂林 541004；2.廣西師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，廣西 桂林 541004)

ABA與CCC對南天竹離體保存的影響△

蔡鵬1，吳嬋榕2，劉華英2*，唐婭娜2

(1.廣西師范大學(xué) 漓江學(xué)院，廣西 桂林541004；2.廣西師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，廣西 桂林541004)

為探索南天竹種質(zhì)資源離體保存的方法，以南天竹試管苗為材料，研究不同濃度ABA和CCC對其離體保存時的生長、增殖、存活率及恢復(fù)生長的影響。結(jié)果表明，CCC對株高的抑制大于ABA，對增殖的抑制較ABA弱，最高存活率(83.33%)遠大于ABA的(56.67%)。適合南天竹試管苗離體保存的培養(yǎng)基為MS+30g·L-1蔗糖+0.5mg·L-16-BA+0.05mg·L-1NAA+5.0mg·L-1CCC，保存120d后，存活率為83.33%、增殖系數(shù)為2.33、株高為1.59cm，恢復(fù)生長成活率達96.67%，且形態(tài)正常。添加CCC可延緩南天竹試管苗生長，用于南天竹種質(zhì)資源的離體保存。

南天竹；離體保存；CCC；ABA

南天竹NandinadomesticaThunb.，又名南天竺，屬小檗科南天竹屬。南天竹是一種具有觀賞、生態(tài)、藥用等多種價值的樹種，具有良好的開發(fā)利用前景[1-3]。植物種質(zhì)資源離體保存技術(shù)與傳統(tǒng)保存技術(shù)相比，不僅占用空間小，保存數(shù)量大，投資少，而且排除了病蟲害的侵襲，也避免了大田種質(zhì)保存的災(zāi)害風(fēng)險，而且種質(zhì)長期離體保存之后仍具有很強的再生能力，可以迅速大量繁殖，成為長期種質(zhì)保存的一條經(jīng)濟、有效、理想的途徑[4]。組織培養(yǎng)是當(dāng)前植物種質(zhì)離體保存的主要方法，但頻繁繼代費時費工，同時會導(dǎo)致體細胞無性系變異概率增加[5]。添加植物生長抑制劑可以減緩材料的生長速度，延長繼代時間以達到中短期離體保存種質(zhì)的目的，已經(jīng)在許多植物上取得了成功。添加1.0～3.0 mg·L-1的ABA能夠有效延長百合試管苗的繼代間隔時間，離體保存9個月時存活率均在80%以上[6]。添加5 mg·L-1CCC、0.1 mg·L-1ABA或60 mg·L-1B9對蘋果‘中砧1號’組培苗具有相同的保存效果[7]。蔣澤平等[8]使用CCC對火焰南天竹離體保存后的最高存活率為72%。本研究在前期建立的南天竹離體快繁體系的基礎(chǔ)上，探索不同濃度的ABA與CCC對常溫條件下南天竹試管苗離體保存時生長、增殖、存活率和恢復(fù)生長的影響，篩選適宜的植物生長抑制劑及濃度，以期為南天竹種質(zhì)資源的離體保存提供理論依據(jù)和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1材料

取生長健壯，無病蟲害的紅果南天竹當(dāng)年生嫩枝。0.1%HgCl2消毒10min后，用MS+1mg·L-16-BA+0.1mg·L-1IBA+90mg·L-1青霉素+1600mg·L-1Vc誘導(dǎo)出新芽；再用MS+0.5mg·L-16-BA+0.05mg·L-1NAA進行增殖；最后采用培養(yǎng)基為MS+0.01mg·L-1NAA+0.3mg·L-16-BA進行壯苗。生長狀況良好的試管苗備用。

1.2方法

以南天竹試管苗為材料，在培養(yǎng)基為MS+30g·L-1蔗糖+0.5mg·L-16-BA+0.05mg·L-1NAA(CK)的基礎(chǔ)上，處理1～4分別添加1.0、2.0、3.0、5.0mg·L-1ABA；處理5～8分別添加0.5、1.0、2.0、5.0mg·L-1CCC；以封口膜封口，離體保存。保存期間每30d觀察記錄試管苗的長勢、存活率。保存120d后，將試管苗轉(zhuǎn)入MS+0.5mg·L-16-BA+0.05mg·L-1NAA培養(yǎng)基中進行恢復(fù)培養(yǎng)；棉塞封口，50d后統(tǒng)計其恢復(fù)生長的情況。增殖系數(shù)=增殖后的芽數(shù)/接種外植體數(shù)；存活率=存活株數(shù)/總株數(shù)×100%。

上述培養(yǎng)基都為MS附加7g·L-1瓊脂，pH5.8～6.2。培養(yǎng)條件為：光強1500～2000lx，光照時間12h每天，溫度(25±1)℃。每處理接種10瓶，每瓶接種1個材料，設(shè)5次重復(fù)，數(shù)據(jù)統(tǒng)計時去除最高值與最低值。

2 結(jié)果與分析

2.1不同濃度ABA和CCC對南天竹離體保存試管苗葉片生長狀況的影響

注：+指大部分枯萎，++指少數(shù)枯萎，+++指無枯萎現(xiàn)象。

由表2可知，所有處理試管苗隨著保存時間的延長葉片逐漸枯萎，葉片厚度也由薄變厚。隨著ABA濃度的遞增葉片枯萎增加，且都劣于對照組，保存120 d時大部分葉片都枯萎，表明ABA處理不利于葉片的存活生長。使用1 mg·L-1與5 mg·L-1CCC處理對于葉片生長影響較小，且略優(yōu)于對照。可見，CCC對離體保存時葉片存活生長的效果好于ABA。

2.2不同濃度ABA和CCC對南天竹離體保存試管苗株高的影響

表2 不同濃度ABA和CCC對南天竹離體保存株高的影響

由表1可知，隨保存時間的延長，各處理的株高均有不同程度的增加且莖均由細變粗。隨ABA濃度的增高，保存不同天數(shù)時株高都呈下降趨勢，但1～3 mg·L-1ABA處理的株高大于對照，表現(xiàn)出促進作用，而5.0 mg·L-1ABA處理的小于對照，尤其是保存120 d時，顯示出明顯的抑制生長效果。隨CCC濃度的增高，保存不同天數(shù)時株高都呈先升后降趨勢，1.0 mg·L-1CCC處理的株高大于對照，5.0 mg·L-1CCC對株高的抑制最明顯。結(jié)果表明，CCC對株高的抑制效果優(yōu)于ABA，適宜濃度為2～5 mg·L-1。

2.3不同濃度ABA和CCC對南天竹離體保存試管苗增殖系數(shù)的影響

表3 不同濃度ABA和CCC對南天竹離體保存的增殖系數(shù)的影響

隨著保存時間的延長，各處理的增殖系數(shù)均有增加，結(jié)果見表3。隨ABA濃度的增高，保存不同天數(shù)時增殖系數(shù)都呈下降趨勢，與株高的表現(xiàn)一致，2～5 mg·L-1ABA處理的增殖系數(shù)小于對照，表現(xiàn)出抑制作用，而1 mg·L-1ABA處理的保存至60 d時增殖系數(shù)都是大于對照，之后小于對照，顯示ABA處理抑制試管苗的增殖，濃度越高抑制越強烈。保存不同天數(shù)時，0.5、2、5 mg·L-1CCC處理的增殖系數(shù)小于對照，2 mg·L-1CCC處理的抑制最明顯，5 mg·L-1CCC處理的與對照接近，1 mg·L-1CCC處理的保存至60 d時增殖系數(shù)大于對照，之后小于對照。結(jié)果表明，ABA和CCC處理抑制離體保存時試管苗的增殖，CCC對增殖的抑制較ABA弱。

2.4不同濃度ABA和CCC對南天竹試管苗離體保存存活率的影響

表4 不同濃度ABA和CCC對南天竹離體保存存活率的影響

從表4可以看出，保存30 d時各處理試管苗的存活率都較高，隨保存時間的延長各處理試管苗的存活率都呈下降趨勢。隨著ABA濃度的上升，試管苗的存活率逐漸降低，都低于對照，5 mg·L-1ABA處理的降低幅度最大，保存120 d時存活率僅有6.66%，說明ABA處理影響試管苗存活，濃度越高抑制作用越強，5 mg·L-1ABA不適用于其保存。不同濃度CCC處理的存活率與對照相比有不同程度的降低，1 mg·L-1CCC處理的存活率最低，5 mg·L-1CCC處理的存活率達到83.33%，略高于對照組的。總的來看，CCC處理的存活率高于ABA處理的。

2.5不同濃度ABA和CCC對南天竹試管苗離體保存后恢復(fù)生長的影響

表5 不同濃度ABA和CCC對南天竹離體保存120 d后恢復(fù)生長的影響

注：+指長勢一般，++指長勢良好，+++指長勢旺盛。

南天竹試管苗離體保存120 d后恢復(fù)培養(yǎng)50 d的統(tǒng)計結(jié)果見表5。隨著離體保存時ABA濃度升高，恢復(fù)培養(yǎng)試管苗的株高、增殖系數(shù)、存活率逐漸降低，葉片長勢逐漸變?nèi)?，? mg·L-1ABA處理的株高高于對照，其余指標(biāo)都低于對照。采用CCC處理離體保存的恢復(fù)培養(yǎng)試管苗的株高接近或好于對照，0.5 mg·L-1CCC處理的長得最高，增殖和葉片長勢與對照相近；2 mg·L-1CCC處理的增殖系數(shù)最高，并明顯高于對照，但葉片長勢較差；5 mg·L-1CCC處理的存活率最高，達到96.67%，高于對照的，其余濃度處理的則低于對照，且葉片長勢在所有處理中為最佳，形態(tài)與對照無差異。

綜合試管苗離體保存和恢復(fù)培養(yǎng)的效果考慮，1 mg·L-1ABA和5 mg·L-1CCC處理既減緩保存時的生長、增殖，又保持較高的存活率，恢復(fù)生長良好，可用于其離體保存，5 mg·L-1CCC處理的效果好于1 mg·L-1ABA處理的。因此，在MS+30g蔗糖+0.5 mg·L-16-BA+0.05 mg·L-1NAA培養(yǎng)基上添加5 mg·L-1CCC是南天竹試管苗離體保存的適宜濃度。

3 討論

從種質(zhì)離體保存的結(jié)果來看，長期保存成功的關(guān)鍵因素之一是使用合適的植物生長抑制劑。因為利用激素調(diào)控技術(shù)，不僅能延長培養(yǎng)物在試管中的保存時間而且能提高試管苗質(zhì)量和再次繼代成活率。郭延平等[9]使用ABA離體保存獼猴桃和徐志微等[10]使用ABA離體保存葡萄品種黑玫瑰試管苗時報道ABA的濃度越大對生長的抑制作用越明顯，本實驗的結(jié)果與此一致，但高濃度處理時離體保存的存活率非常低，恢復(fù)生長也不佳，認為高濃度ABA并不適于南天竹試管苗的離體保存。

CCC是一種廣譜高效低毒的植物生長延緩劑，可使試管苗生長健壯，抗逆性增強，移栽成活率提高等[11-12]。通常認為CCC通過抑制GA3的生物合成來控制植株高度，同時，經(jīng)過CCC處理后的植物，提高了POD活性，而某些POD同工酶具有IAA氧化酶作用，使植物內(nèi)源IAA水平降低，從而實現(xiàn)矮化作用[13-15]。蔣澤平等[8]在添加5mg·L-1CCC的培養(yǎng)基中離體保存南天竹120d后存活率僅為72%，這與本實驗的研究結(jié)果(存活率為83.33%)相差較大，這可能與培養(yǎng)基中使用的激素濃度及培養(yǎng)基的成分或基因型差異有關(guān)。在本實驗中，當(dāng)CCC濃度達5mg·L-1時，對南天竹試管苗沒有產(chǎn)生明顯毒害作用，此結(jié)果與趙克蓉[28]在馬鈴薯的研究報道一致，但與袁宏安等[17]在馬鈴薯的研究結(jié)果不一致，表明不同植物甚至同一植物不同基因型離體保存時適宜的CCC濃度不同。

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EffectsofABAandCCConNandinadomesticaThunb.invitroPreservation

CAIPeng1，WUChanrong2，LIUHuaying2*，TANGYana2

(1.LijiangCollegeofGuangxiNormalUniversity，Guilin541004，China；2.CollegeofLifeScienceofGuangxiNormalUniversity，Guilin541004，China)

The effects of different concentration of ABA and CCC on the growth，proliferation，survival rate and recovery growth of test-tube shoots during in vitro preservation were studied for exploring a method forinvitropreservation ofNandinadomestica.The results showed that the inhibition degree of plant height by CCC treatment was deeper than ABA treatment，the inhibition effect on the proliferation was reversed，and the survival rate(83.33%)by CCC treatment was obviously higher than ABA treatment (56.67%).So the suitable medium forN.domesticain vitro preservation was MS+30g·L-1sucrose+0.50mg·L-16-BA+0.05mg·L-1NAA+5mg·L-1CCC，on which in vitro preservation for120d，the survival rate，proliferation coefficient and plant height was83.33%，2.33and1.59cm，respectively. Afterinvitropreservation for120d，the survival rate on recovery culture reached96.67%，and their morphology was normal.By adding CCC，the growth of test-tube shoots was alleviated which could applicate forN.domesticagermplasm in vitro preservation.

Nandinadomestica；invitropreservation；CCC；ABA

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.9.021

2015-06-11)

國家自然科學(xué)基金(31160071)

*

劉華英，副教授，研究方向：植物細胞學(xué)研究；Tel:(0733)5845952，E-mail：hyliuchsh@aliyun.com