李桂林，宋雅迪，呂振暉，劉春暉，李佳，張夏楠

(首都醫(yī)科大學(xué) 中醫(yī)藥學(xué)院，北京 100069)

基于ITS序列位點(diǎn)特異性PCR的酸棗仁及其混偽品的鑒別△

李桂林，宋雅迪，呂振暉，劉春暉，李佳，張夏楠*

(首都醫(yī)科大學(xué) 中醫(yī)藥學(xué)院，北京 100069)

目的：基于ITS序列建立酸棗仁及其市場(chǎng)混偽品的分子鑒定方法。方法：收集酸棗仁及其常見混偽品理?xiàng)椚?、枳椇子、紫荊子、兵豆，提取總DNA，基于ITS序列設(shè)計(jì)引物并進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，用BioEdit分析軟件進(jìn)行序列比對(duì)，針對(duì)變異位點(diǎn)用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)特異性鑒別引物，進(jìn)行PCR反應(yīng)并考察反應(yīng)條件。結(jié)果：ITS序列可以用于酸棗仁及其易混淆品種的鑒別研究，在位點(diǎn)特異性PCR反應(yīng)條件考察中，DNA模板用量范圍應(yīng)為0.7～2.1 ng·μL-1，退火溫度在59 ℃時(shí)特異性最佳，實(shí)驗(yàn)建立的方法對(duì)不同Taq酶和PCR儀具有普遍適應(yīng)性。結(jié)論：研究設(shè)計(jì)的位點(diǎn)特異性引物在一定條件下的PCR反應(yīng)中，酸棗仁能擴(kuò)增出66 bp的條帶，而其他混偽品不能擴(kuò)增出條帶，從而實(shí)現(xiàn)了酸棗仁與其混偽品的快速、準(zhǔn)確鑒別。

酸棗仁；ITS；特異性PCR；分子鑒定

酸棗仁為鼠李科植物酸棗ZiziphusjujubaMill.var.spinosa(Bunge)Hu ex H.F.Chou 的干燥成熟種子。產(chǎn)自河北、陜西、遼寧、山東、河南、安徽等省。酸棗仁性平，味甘、酸，具有養(yǎng)心補(bǔ)肝、寧心安神、斂汗、生津的功能，用于虛煩不眠、驚悸多夢(mèng)、體虛多汗、津傷口渴[1]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，本品具有鎮(zhèn)靜催眠、鎮(zhèn)痛抗驚厥、降壓、降血脂、增強(qiáng)免疫功能、抗缺氧、抗心律失常、抗衰老、抗輻射及抗血小板聚集等作用[2]。由于酸棗仁野生資源減少，市場(chǎng)貨源供不應(yīng)求，藥材市場(chǎng)上出現(xiàn)以同屬植物滇刺棗ZizyphusmauritianaLam.的種子理?xiàng)椚驶熳魉釛椚食鍪鄣那闆r，此外還有枳椇子Hoveniadulcis(又名拐棗仁)、兵豆Lensculinaris、紫荊子Cercischinensis等混偽品出現(xiàn)。目前對(duì)于酸棗仁的鑒別研究多采用藥材性狀[3]、顯微特征[4]、薄層色譜[5]、電泳[6-7]、紫外光譜[8-9]、掃描電鏡[10]等傳統(tǒng)鑒別方法，但由于該5個(gè)品種外觀性狀相近，顯微組織特征不明顯，化學(xué)成分復(fù)雜，以上這些方法專屬性不強(qiáng)，且容易受到外加因素的干擾[11]。本實(shí)驗(yàn)即以ITS序列作為分子標(biāo)記，應(yīng)用位點(diǎn)特異性PCR技術(shù)篩選特異性鑒別引物，建立一種快速、穩(wěn)定的分子鑒別方法以區(qū)分酸棗仁及其混偽品藥材。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

DYY-6D電泳系統(tǒng)(北京市六一儀器廠)，PCR儀(Life Technologies 公司，型號(hào) Veriti；德國(guó)Eppendorf AG 22331 Hamburg；德國(guó)Eppendorf Mastercycler pro)，1-14臺(tái)式離心機(jī)(德國(guó)SiGMR公司)，Vilber Lourmat凝膠成像儀(法國(guó))，Plant Genomic DNA kit 50 Preps植物基因組DNA提取試劑盒(TianGen)。

1.2 試劑

2x Easy Taq?PCR SuperMix，2x Phusion High-Fidelity PCR MM W/HF Buffer，Trans FastTaq DNA Polymerase(5U·μL-1)，TaKaRa dNTP Mixture 2.5 mm each，Trans 10x FastTaq Buffer(Mg2+)，Trans2K?DNA Marker(北京全式金生物技術(shù)有限公司)，瓊脂糖Biowest?Regular Agarose G-10，Tiangen 10 000x GeneGreen Nucleic Acid Dye，10x Mops 電泳緩沖液[生工生物工程(上海)股份有限公司]。

1.3 藥材

收集安國(guó)、亳州藥材市場(chǎng)的20份材料，包括11份酸棗仁、5份理?xiàng)椚省?份枳椇子、1份紫荊子、1份兵豆，鑒定人為首都醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院李佳副教授。

2 方法

2.1 提取樣品總DNA

取適量樣品研磨成細(xì)粉，采用植物基因組DNA提取試劑盒提取樣品總DNA，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 ITS片段擴(kuò)增與測(cè)序

各樣品采用ITS通用引物進(jìn)行擴(kuò)增[12]，ITS1：5′-AGAAGTCGTAACAAGGTTTCCGTAGG-3′；ITS 4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′。PCR反應(yīng)體系總體積為50 μL，包括25 μL 2x Phusion High-Fidelity PCR MM W/HF Buffer，正反引物各2.5 μL，DNA 5 μL，無菌水15 μL。反應(yīng)條件為98 ℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)(98 ℃ 7 s，55 ℃ 20 s，72 ℃ 15 s)，72 ℃ 7 min。產(chǎn)物由北京睿博興科生物技術(shù)有限公司測(cè)序，各樣品均采用正反雙向測(cè)序，以保證結(jié)果的準(zhǔn)確性。

2.3 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹

根據(jù)測(cè)序結(jié)果利用CLUSTAL X軟件進(jìn)行序列排序，使用MEGA6進(jìn)行遺傳分析構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2.4 設(shè)計(jì)位點(diǎn)特異性鑒別引物

根據(jù)2.2測(cè)序結(jié)果將酸棗仁、理?xiàng)椚?、兵豆、枳椇子、紫荊子的ITS序列用CONTIG軟件同源對(duì)齊并輔以人工校對(duì)，多重序列比對(duì)進(jìn)行差異變異位點(diǎn)分析，根據(jù)變異位點(diǎn)采用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)特異性鑒別引物。引物序列由北京睿博興科生物技術(shù)有限公司合成。引物序列為ZmITS3F：5′-CAACCAGCGAACCCGTGAA-3′；ZmITS3R：5′-CCAAGGAAGGCTCCGTGACA3′。

2.5 PCR擴(kuò)增條件的確定

用設(shè)計(jì)的特異性鑒別引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系為25 μL，包括12.5 μL 2x Easy Taq?PCR SuperMix緩沖液，正反引物各0.5 μL，DNA 35 ng·μL-1共1.5 μL，無菌水10 μL。PCR反應(yīng)條件為94 ℃ 5 min，35個(gè)循環(huán)(94 ℃ 30 s，55 ℃ 15 s，72 ℃ 30 s)，72 ℃ 7 min。反應(yīng)結(jié)束后取反應(yīng)產(chǎn)物5 μL，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，SYNGENE凝膠成像系統(tǒng)觀察、成像。為使PCR鑒別反應(yīng)準(zhǔn)確高效，考察了DNA模板量(0.4～2.6 ng·μL-1)、退火溫度(53、55、56、57、59、61、63 ℃)、Taq酶種類(2x EasyTaq?PCR SuperMix、Trans FastTaq DNA Polymerase)以及不同PCR儀(Life Technologies 公司，型號(hào) Veriti；德國(guó)Eppendorf AG 22331 Hamburg；德國(guó)Eppendorf Mastercycler pro)對(duì)PCR鑒別反應(yīng)的影響。

3 結(jié)果與分析

3.1 酸棗仁及其混偽品的ITS分析及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

采用Mega 6分析軟件進(jìn)行酸棗仁及其混偽品系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建，采集NJ法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，見圖1，采用Kimura2-parameter 距離，系統(tǒng)樹各分支的置信度用bootstrap method檢驗(yàn)，共進(jìn)行1000次循環(huán)。從圖1可知，酸棗仁與理?xiàng)椚实挠H緣關(guān)系最近，其次為枳椇子，與紫荊子和兵豆的關(guān)系較遠(yuǎn)，都可以區(qū)分開，可信度在98%以上，符合植物分類結(jié)果。證明ITS序列可以用于鑒別酸棗仁及其混偽品。

圖1 基于ITS序列構(gòu)建酸棗仁及其混偽品的系統(tǒng)發(fā)育樹

3.2 PCR反應(yīng)條件考察

為建立準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便的酸棗仁及其混偽品分子鑒別方法，本文對(duì)設(shè)計(jì)的鑒別引物在PCR反應(yīng)中的應(yīng)用進(jìn)行了全面考察。

3.2.1 DNA模板量的考察 對(duì)25 μL PCR 反應(yīng)體系中的模板DNA用量進(jìn)行了考察，分別設(shè)置為0.42、0.70、0.98、1.26、1.54、1.82、2.10、2.38、2.66 ng·μL-1，反應(yīng)體系為：12.5 μL 2x Easy Taq?PCR SuperMix 緩沖液，正反向引物各0.5 μL，無菌水補(bǔ)齊。圖2結(jié)果顯示，模板濃度為0.42 ng·μL-1時(shí)正偽品均未出現(xiàn)條帶，而提高到2.10 ng·μL-1及以上則全部出現(xiàn)條帶，其余模板量均能區(qū)分開酸棗仁及其混偽品，因此確定本方法DNA模板濃度范圍應(yīng)為0.70～2.10 ng·μL-1。實(shí)驗(yàn)采用0.70 ng·μL-1DNA模板濃度繼續(xù)進(jìn)行其他條件的考察。

注：(1)M.2 000 bp DNA Marker，3、7、8.正品酸棗仁，1、5.理?xiàng)椚剩?3、14.枳椇子，15.紫荊子，16.兵豆；(2)從上至下DNA模板濃度分別為0.42、0.70、0.98、1.26、1.54、1.82、2.10、2.38、2.66 ng·μL-1。圖2 不同DNA模板濃度PCR反應(yīng)結(jié)果

3.2.2 退火溫度的考察 設(shè)置退火溫度分別為53、55、56、57、59、61、63 ℃進(jìn)行考察，結(jié)果見圖3。退火溫度為53、55、56、57 ℃時(shí)偽品依稀可見假陽性條帶，退火溫度提高至59 ℃時(shí)偽品無條帶，而正品酸棗仁有清晰的特異性擴(kuò)增條帶，退火溫度為61、63 ℃時(shí)，偽品無條帶，而正品條帶也不易擴(kuò)增出來。因此，為保證PCR反應(yīng)具有良好的可重復(fù)性及區(qū)分度，采用59 ℃作為此方法的退火溫度。

3.2.3 兩種DNA聚合酶的考察 除上述方法中使用的聚合酶2x EasyTaq?PCR SuperMix，本研究還考察了另一種常用聚合酶Trans FastTaq DNA Polymerase(5 U·μL-1)的反應(yīng)效果。PCR反應(yīng)體系為25 μL，其中Trans FastTaq DNA Polymerase(5 U·μL-1)0.2 μL，TaKaRa dNTP Mixture 2.5 mm each 2 μL，Trans 10x FastTaq Buffer(Mg2+)2.5 μL，正反引物各 1 μL，DNA模板 1.40 ng·μL-1(1 μL)，無菌水17.3 μL。PCR反應(yīng)條件為94 ℃ 5 min，35個(gè)循環(huán)(94 ℃ 30 s，59 ℃ 15 s，72 ℃ 30 s)，72 ℃ 7 min，結(jié)果見圖4。采用兩種聚合酶的PCR反應(yīng)條件下，偽品無條帶，而正品均有66 bp特異性擴(kuò)增條帶，說明特異性引物可用多種酶進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，無單一局限性。

3.2.4 PCR儀對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果重復(fù)性的影響 選用3臺(tái)不同PCR儀器及同一儀器多次實(shí)驗(yàn)，結(jié)果均能區(qū)分開酸棗仁及其混偽品。

注：(1)M.2 000 bp DNA Marker；(2)從上到下依次為退火溫度53、55、56、57、59、61、63 ℃；(3)3、4、7、8、9、10、11、12、17、18、19.正品酸棗仁，1、2、5、6、20.理?xiàng)椚剩?3、14.枳椇子，15.紫荊子，16.兵豆。圖3 不同退火溫度下PCR反應(yīng)結(jié)果圖

注：(1)M.2000 bp DNA Marker,3、4、7、8、9、10、11、12、17、18、19.正品酸棗仁；1、2、5、6、20.理?xiàng)椚剩?3、14.枳椇子；15.紫荊子；16為兵豆；(2)上為酶Trans FastTaq DNA Polymerase(5U·μL-1)，下為酶2x Easy Taq?PCR SuperMix。圖4 兩種酶進(jìn)行PCR實(shí)驗(yàn)的結(jié)果

4 討論

ITS序列是位于高等植物核糖體rRNA基因上高度重復(fù)的串聯(lián)序列單位，被廣泛用于被子植物系統(tǒng)學(xué)的研究，尤其是近源屬間和屬內(nèi)系統(tǒng)學(xué)的研究。目前ITS序列作為植物分子鑒定的特異性片段在澤瀉[13]、紅景天[14]、肉蓯蓉[15]等多種藥用植物中得到探討和應(yīng)用，陳士林等[16]以ITS2序列為主體推出了植物類中藥材DNA條形碼鑒定的通用引物，并已得到了廣泛應(yīng)用。本實(shí)驗(yàn)即選用DNA條形碼中的ITS序列作為分子標(biāo)記，使用現(xiàn)有文獻(xiàn)記錄的ITS序列通用引物對(duì)收集的樣品進(jìn)行測(cè)序，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹的結(jié)果也證實(shí)了ITS序列可以作為分子標(biāo)記來區(qū)分酸棗仁及其混偽品，這與任莉等的研究結(jié)果相一致[17]。實(shí)驗(yàn)收集的樣品是當(dāng)前藥材市場(chǎng)較為常見的混偽品，其中理?xiàng)椚逝c酸棗仁為同屬來源，形態(tài)相近最不容易區(qū)分。本實(shí)驗(yàn)基于ITS序列設(shè)計(jì)篩選鑒別酸棗仁及其混偽品的位點(diǎn)特異性引物，建立了位點(diǎn)特異性PCR方法，并對(duì)其反應(yīng)條件進(jìn)行了一系列考察，力求得到穩(wěn)定、可重復(fù)的鑒別體系，可以準(zhǔn)確鑒別出酸棗仁及其混偽品。

位點(diǎn)特異性引物PCR具有操作簡(jiǎn)單、成本低、重復(fù)性好、鑒定條帶單一、樣品用量少等優(yōu)點(diǎn)，此外可以極大降低PCR的假陽性率，保證鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性[18]。本實(shí)驗(yàn)建立的分子鑒別方法，將為應(yīng)用DNA條形碼鑒別中藥材提供理論依據(jù)，同時(shí)也為開發(fā)酸棗仁快速鑒別試劑盒打下理論基礎(chǔ)。

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IdentificationofZizyphusjujubawiththeCounterfeitProductsbyAllele-specificPCRBasedonITSGenesSequence

LI Guilin，SONGYadi，LYUZhenhui，LIUChunhui，LIJia，ZHANGXianan*

(SchoolofTraditionalChineseMedicine，CapitalMedicalUniversity，Beijing100069，China)

Objective：To establish molecular identification method forZizyphusjujubaand its counterfeit species based on ITS genes sequence.Methods：Total DNAs ofZ.jujuba，Z.mauritiana，Hoveniadulcis，LensculinarisandCercischinensiswere extracted，and the internal transcribed spacer(ITS)regions were amplified by PCR and the products were sequenced.BioEdit analysis software was used for sequence comparison.Primer Premier 5.0 was applied to design specific primers according to the mutation sites，the PCR reactions were performed and the conditions were examined.Results：ITS sequences were used in identification research ofZ.jujubaand its counterfeit species.To investigate the specific PCR reaction conditions，the scope of DNA template should variate from 0.7-2.1 ng·μL-1，the annealing temperature was proper at 59 ℃，different Taq enzymes and PCR instruments were available for this PCR process.Conclusion：In the same PCR reaction，66 bp DNA band could be amplified fromZ.jujubawhile nothing from the counterfeit species.It is a fast and accurate method to identifyZ.jujubafrom the counterfeit products using specific PCR primer.

Zizyphusjujuba；ITS；specific PCR；molecular identification

2016-01-18)

國(guó)家自然科學(xué)基金(81303166)；國(guó)家中醫(yī)藥管理局中醫(yī)藥行業(yè)專項(xiàng)(201407003)

*

張夏楠，講師，研究方向：分子生藥學(xué)；Tel：(010)83911633，E-mail：xnzhang@ccmu.edu.cn

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.12.007