龍艷平，沈真實(shí)，伍祥興

（1. 湖南隆平種業(yè)有限公司，湖南 長(zhǎng)沙 410125；2. 瀏陽(yáng)市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心，湖南 瀏陽(yáng)410300）

蘿藍(lán)花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂觀察及核型分析

龍艷平1，沈真實(shí)2，伍祥興2

（1. 湖南隆平種業(yè)有限公司，湖南 長(zhǎng)沙 410125；2. 瀏陽(yáng)市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心，湖南 瀏陽(yáng)410300）

采用壓片法，對(duì)蘿藍(lán)（Raphanobrassica，2n=38，RRAA）的花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂及體細(xì)胞核型進(jìn)行了研究。結(jié)果表明：蘿藍(lán)的絕大多數(shù)花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂中染色體的行為正常，終變期同源染色體配對(duì)后可形成18個(gè)二價(jià)體；在少數(shù)花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂中觀察到落后染色體、染色體橋等異常行為；其減數(shù)分裂為同時(shí)型，其花粉粒育性為91.8%。蘿藍(lán)的染色體數(shù)目為2n=4X=36，核型公式為K（2n）=2X=36=30m +6sm，其核型為“2B”型。

蘿藍(lán)；染色體；減數(shù)分裂

蘿卜（Raphanus sativus L.，2n=2x=18）屬十字花科，是一種重要的蔬菜作物，早期人們發(fā)現(xiàn)蘿卜與蕓薹屬的一些植物如白菜（Brassica rapa L.，2n=20，AA）或甘藍(lán)（Brassica oleracea L.，2n=18，CC）之間的雜交后代營(yíng)養(yǎng)體生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)明顯，具有蔬菜或飼料作物的開(kāi)發(fā)潛力而被人工合成為異源四倍體，稱(chēng)為蘿藍(lán)，命名為Raphanobrassica（蘿卜作母本）或Brassicoraphanus（蘿卜作父本），成為一個(gè)新物種［1-3］。隨著研究的深入，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)蘿卜是具有多種抗源和優(yōu)異性狀的育種材料，向蕓薹屬植物中導(dǎo)入有價(jià)值的基因逐漸成為屬間雜交的主要目標(biāo)。而蘿卜屬與蕓薹屬之間有性雜交不親和性及雜種敗育現(xiàn)象明顯，一些常規(guī)的技術(shù)和方法如混合授粉、切柱頭、化學(xué)藥物處理等對(duì)蕓薹屬與蘿卜的遠(yuǎn)緣雜交效果不大。但通過(guò)蘿藍(lán)作為橋梁，同蕓薹屬植物雜交，導(dǎo)入蘿卜的遺傳物質(zhì)，成功率相對(duì)較高，至今已有多種基因被挖掘利用，如 Lelivelt等［4］和Peterka等［5］分別以蘿卜-白菜（Raphanobrassica，2n=38，RRAA）和蘿卜-甘藍(lán)（Raphanobrassica，2n=36，RRCC）為親本，與甘藍(lán)型油菜反復(fù)回交，不斷選擇偏甘藍(lán)型性狀雜交后代，成功地將蘿卜中抗根結(jié)線蟲(chóng)基因?qū)敫仕{(lán)型油菜（命名為蘿藍(lán)）。陳衛(wèi)江等［6］以蘿藍(lán)為供體材料，將蘿卜恢復(fù)基因?qū)敫仕{(lán)型油菜蘿卜細(xì)胞質(zhì)雄性不育（Ogu CMS）恢復(fù)材料CLR650中，轉(zhuǎn)育出甘藍(lán)型油菜Ogu CMS的新型恢復(fù)材料，表明人工合成的蘿藍(lán)在蘿卜和蕓薹屬間基因的交流過(guò)程中有著重要的作用，研究通過(guò)對(duì)蘿藍(lán)的小孢子發(fā)育過(guò)程觀察、花粉粒育性鑒定以及對(duì)其體細(xì)胞染色體進(jìn)行核型分析，旨在為蘿藍(lán)的進(jìn)一步利用提供細(xì)胞學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1供試材料

供試材料為蘿藍(lán)（Raphanobrassica，2n=4x=36，RRCC），由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)傅廷棟院士1993年提供，每年選取典型單株套袋自交，保存種植于湖南省作物研究所試驗(yàn)田，在植株現(xiàn)蕾時(shí)取材。

1.2方 法

1.2.1體細(xì)胞觀察方法有絲分裂觀察時(shí)，從植株上取幼小花序，經(jīng)0.002 mol/L 8-羥基喹啉在22℃下處理5 h后于乙醇∶冰醋酸（3∶1）混合液中固定過(guò)夜。顯微鏡下觀察時(shí)，先剝出雌蕊，用蒸餾水沖洗后，在l mol/L的鹽酸中60℃水浴3～5 min，卡寶品紅染色1 min，壓片并置于油鏡下觀察計(jì)數(shù)。

1.2.2減數(shù)分裂觀察方法減數(shù)分裂觀察時(shí)，在上午9：00～11：00，下午3：00～5：00取花序頂端幼小花蕾在卡諾固定液（乙醇∶冰醋酸=3∶1）中固定24 h，用l mol/L鹽酸60℃恒溫解離5～6 min，從花蕾中取出花藥，在載片上解剖出花粉母細(xì)胞，滴1滴改良卡寶品紅，壓片鏡檢?；ǚ塾杂^察時(shí)，可取當(dāng)日開(kāi)放花朵的花粉粒涂于載玻片上，用醋酸洋紅染色3 min后，顯微鏡下觀察攝影。

1.2.3核型分析方法取50個(gè)以上分散良好、著絲點(diǎn)清晰的中期細(xì)胞進(jìn)行染色體數(shù)目統(tǒng)計(jì)，并從中選擇5個(gè)分散較好的分裂相進(jìn)行顯微攝影及核型數(shù)據(jù)測(cè)量。核型分析方法參照李懋學(xué)等［7］的研究。

2 結(jié)果與分析

2.1花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂過(guò)程觀察

蘿藍(lán)大部分花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂過(guò)程中染色體的行為正常。粗線期可觀察到染色體明顯變粗及染色較深的染色粒（圖1-a）。終變期觀察到18個(gè)形態(tài)清晰的二價(jià)體（圖1-b），佐證了蘿藍(lán)的染色體數(shù)目為2n=36，該時(shí)期也是進(jìn)行染色體計(jì)數(shù)的最佳時(shí)期。在中期I，二價(jià)體聚集并整齊排列到赤道面上形成赤道板（圖1-c），此期一些細(xì)胞中出現(xiàn)染色體落后現(xiàn)象（圖1-d）。后期I，同源染色體分離，向細(xì)胞的兩端移動(dòng)（圖1-e），此期少數(shù)細(xì)胞中出現(xiàn)染色體橋及染色體落后現(xiàn)象（圖1-f）。末期I細(xì)胞質(zhì)不分裂，前期II，染色體分散到細(xì)胞質(zhì)中，每個(gè)子細(xì)胞中具有18個(gè)單價(jià)體（圖1-g）。中期II，2個(gè)子細(xì)胞中的染色體均排列到細(xì)胞的赤道面（圖1-h），此期少數(shù)細(xì)胞中出現(xiàn)染色體落后的情況（圖1-i）。后期II姐妹染色單體分開(kāi)，分別走向細(xì)胞兩極，此時(shí)在細(xì)胞內(nèi)可明顯觀察到4組染色體（圖1-j）。末期Ⅱ細(xì)胞內(nèi)部形成4個(gè)子細(xì)胞，發(fā)育為四分體（圖1-l），另外，此期有少數(shù)三分體及多分體形成，減數(shù)分裂方式屬于同時(shí)型，在減數(shù)分裂過(guò)程中約有7.7%的花粉母細(xì)胞出現(xiàn)染色體異常分離現(xiàn)象。與麥藍(lán)菜［8］、毛車(chē)前［9］和半支蓮［10］等植物的花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂過(guò)程相似。

圖1　蘿藍(lán)花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂（a：粗線期；b：終變期；c：中期Ⅰ；d：中期Ⅰ落后染色體；e：后期Ⅰ；f：后期Ⅰ染色體橋；g：末期Ⅰ；h：中期Ⅱ；i：后期Ⅱ；j：末期Ⅱ；k：四分體；l：花粉粒。標(biāo)尺長(zhǎng)度=5μm）

2.2花粉粒育性觀察結(jié)果

隨機(jī)選擇幾個(gè)視野，共觀察統(tǒng)計(jì)了1 272個(gè)花粉粒的醋酸洋紅染色反應(yīng)結(jié)果，其中不育花粉粒僅104個(gè)，花粉育性為91.8%，敗育率為8.2%。

2.3染色體數(shù)目觀察結(jié)果

通過(guò)對(duì)蘿藍(lán)根尖細(xì)胞63個(gè)視野良好中期分裂相的染色體數(shù)目統(tǒng)計(jì)，確定其染色體數(shù)目為2n=36，同時(shí)花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂終變期可觀察到18個(gè)二價(jià)體，未發(fā)現(xiàn)染色體數(shù)目變異。核型分析參數(shù)取自5個(gè)中期細(xì)胞染色體的平均值，核型分析內(nèi)容見(jiàn)表1，核型圖見(jiàn)圖3。蘿藍(lán)最長(zhǎng)染色體和最短染色體之比為3.8，核型不對(duì)稱(chēng)系數(shù)為61.19%，核型公式為K（2n）=4X=36=30m+6sm，核型類(lèi)型為“2B”型。

圖2　蘿藍(lán)花粉粒醋酸洋紅染色反應(yīng)

圖3　染色體中期分裂相及核型

3 結(jié)論與討論

蘿藍(lán)是人工合成的為數(shù)不多的雙二倍體雜種，在自然界的被子植物中，多倍體現(xiàn)象最為常見(jiàn)，而人工合成的多倍體往往存活困難，且經(jīng)濟(jì)性狀較差［11］，多倍體植物在進(jìn)化上取得的成功與人類(lèi)在新合成多倍體領(lǐng)域的表現(xiàn)相差甚遠(yuǎn)，通過(guò)對(duì)人工多倍體的研究，將有助于進(jìn)一步了解植物進(jìn)化、物種形成以及雜種優(yōu)勢(shì)的機(jī)制。蘿藍(lán)經(jīng)人工合成后，也出現(xiàn)過(guò)自交結(jié)實(shí)差及雜種敗育現(xiàn)象，經(jīng)過(guò)多代自交后，株系間植株形態(tài)已經(jīng)沒(méi)有太大差別，研究結(jié)果表明，蘿藍(lán)的染色體數(shù)目為2n=4x=36，減數(shù)分裂時(shí)，絕大多數(shù)終變期能形成18對(duì)二價(jià)體，后期染色體都能均等分配到細(xì)胞兩極，蘿藍(lán)植株中蘿卜和甘藍(lán)的染色體已基本能夠正常配對(duì)和分離，類(lèi)似于正常二倍體物種的減數(shù)分裂行為，表明其在細(xì)胞學(xué)水平已經(jīng)穩(wěn)定。

蘿藍(lán)在進(jìn)行減數(shù)分裂時(shí)僅在少數(shù)花粉母細(xì)胞中觀察到染色體落異常現(xiàn)象，花粉粒育性為91.8%。程志號(hào)等［12］在黃芩、馬玉濤等［13］在益母草及杜玉娟等［14］在半枝蓮的研究中，均認(rèn)為小孢子發(fā)育過(guò)程中染色體行為異常，如染色體落后、不均等分裂及多分體現(xiàn)象等會(huì)導(dǎo)致了子細(xì)胞中遺傳物質(zhì)的不均衡分配，最終導(dǎo)致一部分花粉出現(xiàn)敗育。在進(jìn)化上植物通過(guò)花粉敗育淘汰染色體數(shù)目變異的配子，也是維持物種的穩(wěn)定性的一種途徑［15］。因此，蘿藍(lán)中部分花粉母細(xì)胞在減數(shù)分裂過(guò)程中出現(xiàn)染色體落后、染色體橋等異?，F(xiàn)象可能是導(dǎo)致8.2%花粉敗育的主要原因。

表1　蘿藍(lán)染色體相對(duì)長(zhǎng)度、臂比及類(lèi)型

蘿藍(lán)的染色體組來(lái)自蘿卜和甘藍(lán)，沙玉輝等對(duì)3種不同皮色蘿卜種質(zhì)染色體形態(tài)及核型組成具分析之后，認(rèn)為3種蘿卜種質(zhì)平均臂比為1.28～1.50，不存在臂比大于2的染色體，核型類(lèi)別都為1A型，推測(cè)這3個(gè)蘿卜種質(zhì)處于系統(tǒng)發(fā)生的較初始階段［16-17］。張蜀寧等［18-19］對(duì)甘藍(lán)類(lèi)作物7個(gè)變種核型分析結(jié)果表明，核型分類(lèi)均屬于2A型，為基本對(duì)稱(chēng)型核。研究中蘿藍(lán)的染色體組一半來(lái)自蘿卜，另一半來(lái)自甘藍(lán)，經(jīng)過(guò)多年的自交，植株形態(tài)穩(wěn)定，染色體減數(shù)分裂也已正常，核型分析結(jié)果顯示蘿藍(lán)的核型公式為K（2 n）=4 X=36=30 m+6 sm，表明蘿藍(lán)的染色體組中包括15對(duì)中著絲粒染色體和3對(duì)近中著絲粒染色體，核型類(lèi)型為“2B”型。由于甘藍(lán)和蘿卜的染色體屬于小染色體類(lèi)型［20］，染色體形態(tài)又非常相似，直接壓片后在顯微鏡下難以分辨出其染色體組成，可以借助于染色體分帶、原位雜交以及分子標(biāo)記等方面的技術(shù)，為進(jìn)一步探討蘿藍(lán)的進(jìn)化、種內(nèi)親緣關(guān)系及育種工作提供更準(zhǔn)確的信息。

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（責(zé)任編輯：肖彥資）

Karyotype Analysis and Meiotic Observations of Pollen Mother Cells of Raphanobrassica

HUI Rong-kui1，SHEN Zhen-shi2，WU Xiang-xing2
（1. Hunan Longping Seed Co. Ltd.， Changsha 410125， PRC； 2. Liuyang Agricultural Technology Extension Center， Liuyang 410300， PRC）

By using the squash method， the meiosis of pollen mother cells and somatic karyotype of Raphanobrassica were studied. The results showed that the chromosome in normal behavior during the most Raphanobrassica pollen mother cells meiosis， homologous chromosomes after pairing can form 18 bivalents in diakinesis； lagging chromosomes， chromosome bridge and other abnormal behaviors were observed in a small number of pollen mother cells meiosis； its meiosis was simultaneous type， and its pollen fertility was 91.8%. The chromosome number of Raphanobrassica is 2n=4X=36， the karyotype formula is K（2n）=2X=36=30m+6sm， the karyotype is “2B”.

Raphanobrassica； chromosome； meiosis

Q253

A

1006-060X（2016）08-0006-03

10.16498/j.cnki.hnnykx.2016.08.002

2016-06-29

龍艷平（1968-），女，湖南長(zhǎng)沙市人，助理農(nóng)藝師，研究方向?yàn)橛筒诉z傳育種。