于　瑩，郭文棟，趙麗娟，吳建忠，程莉莉，趙東升，胡瑩瑩，吳廣文，關(guān)鳳芝，袁紅梅*

（1.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士后工作站，哈爾濱　150086；2.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟作物研究所，哈爾濱　150086；3.黑龍江省科學(xué)院自然與生態(tài)研究所，哈爾濱　150040；4.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物育種研究所，哈爾濱　150086）

亞麻纖維素合酶LuCesA8基因克隆與表達(dá)分析

于瑩1,2，郭文棟3，趙麗娟1,4，吳建忠2，程莉莉2，趙東升2，胡瑩瑩2，吳廣文2，關(guān)鳳芝1,2，袁紅梅1,2*

（1.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士后工作站，哈爾濱150086；2.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟作物研究所，哈爾濱150086；3.黑龍江省科學(xué)院自然與生態(tài)研究所，哈爾濱150040；4.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物育種研究所，哈爾濱150086）

以亞麻快速生長期莖部組織總RNA為模板，通過反轉(zhuǎn)錄PCR克隆纖維素合酶基因LuCesA8（基因ID：Lus10029245）全長開放讀碼框序列。序列分析結(jié)果表明，開放讀碼框全長2 967 bp，共編碼988個氨基酸。通過多氨基酸序列比對發(fā)現(xiàn)，該蛋白與麻風(fēng)樹CesA8蛋白親緣關(guān)系最近，相似度達(dá)87%，與胡楊、可可樹、雷蒙德氏棉及芝麻CesA8蛋白氨基酸序列相似性分別為86%、85%、85%、81%。熒光定量PCR結(jié)果表明，該基因在亞麻不同發(fā)育階段表達(dá)水平存在顯著差異，快速生長期表達(dá)量最高，花期和綠熟期次之，苗期最低。研究為揭示LuCesA8基因在次生細(xì)胞壁纖維素合成中的作用奠定基礎(chǔ)。

亞麻；纖維素合酶；克?。槐磉_(dá)分析

網(wǎng)絡(luò)出版時間2016-8-24 15:04:00[URL]http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20160824.1504.010.html

于瑩,郭文棟,趙麗娟,等.亞麻纖維素合酶LuCesA8基因克隆與表達(dá)分析[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2016,47(8):39-45.

Yu Ying,Guo Wendong,Zhao Lijuan,et al.Cloning and expression analysis of the cellulose synthase geneLuCesA8 in flax [J].Journal of Northeast Agricultural University,2016,47(8):39-45.(in Chinese with English abstract)

纖維素是構(gòu)成植物細(xì)胞壁重要組成部分，對維持植物細(xì)胞壁機械強度尤為重要。纖維素含量因物種差異而不同，在種子纖維植物。如棉花、木棉種子絨毛中纖維素含量高達(dá)95%～99%，而在韌皮纖維作物如亞麻纖維中，纖維素含量約為80%～ 90%，木材和竹材中纖維素含量約為40%～50%[1]。植物中纖維素占總生物量1/3，每年由綠色植物光合作用產(chǎn)生纖維素達(dá)1011t[2]。深入研究纖維植物中纖維素生物合成過程，挖掘控制纖維發(fā)育重要基因，通過遺傳操作改良植物纖維品質(zhì)和產(chǎn)量具有重要意義。

纖維細(xì)胞發(fā)育過程復(fù)雜，受多基因表達(dá)調(diào)控。在高等植物中，纖維素合酶（Cellulose synthase，CesA）超家族，屬于糖基轉(zhuǎn)移酶（GT）家族2，負(fù)責(zé)催化纖維素合成[3]。纖維素合酶在細(xì)胞膜上組裝成纖維素合酶復(fù)合體（Cellulose synthase complex, CSC），由6個大亞基組成，每個大亞基包含6個CesA蛋白，形成由36個單體組成的玫瑰狀復(fù)合體[4-6]。纖維素一般以微纖絲（Microfibril）形式存在，每條微纖絲橫截面平均有36條β-1,4-D-葡聚糖鏈，每條葡聚糖鏈由幾千到上萬個單糖分子組成[5]。目前已從多種植物中鑒定出CesA基因，毛果楊（Populus trichocarpa）中鑒定出18個CesA基因，小麥中鑒定出22個CesA基因，擬南芥中鑒定出10 個CesA基因。研究發(fā)現(xiàn)，植物初生、次生細(xì)胞壁形成涉及不同纖維素合酶[7-10]，在擬南芥中的10個CesA蛋白中，AtCesA1、AtCesA3和AtCesA6主要參與初生細(xì)胞壁合成，AtCesA2、AtCesA5和AtCe?sA9被視為AtCesA6的同源蛋白，這些蛋白之間功能冗余，AtCesA4、AtCesA7和AtCesA8則參與次生細(xì)胞壁合成[11]。目前，國內(nèi)外纖維發(fā)育研究主要集中在木質(zhì)纖維和種子纖維（如楊樹、棉花等），而韌皮纖維作物（如麻類）研究相對滯后。

亞麻（Linum usitatissimum L.）隸屬亞麻科，是重要韌皮纖維作物，具有基因組小、自花授粉等特點。目前，亞麻已成為研究韌皮纖維發(fā)育和次生細(xì)胞壁形成最理想的模式植物。本研究以高纖亞麻品種Diana為試驗材料，克隆參與次生細(xì)胞壁合成的纖維素合酶基因LuCesA8，利用生物信息學(xué)方法分析序列，并研究LuCesA8基因在不同發(fā)育時期表達(dá)特性，為深入理解次生細(xì)胞壁纖維素合成機理及通過基因工程改良亞麻等作物纖維品質(zhì)奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料和試劑

高纖亞麻品種Diana、低纖亞麻品種白花種植于黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院民主園區(qū)試驗田，按照BBCH劃分法[12]，取BBCH19、32、35、55、58、61、65、69、75、78等發(fā)育時期莖中部組織，取材后迅速放入液氮速凍，放置于-80℃冰箱保存，提取RNA。

試劑包括RNA提取試劑盒（天根公司）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa公司）；KOD聚合酶（TOYOBO公司）；DNA膠回收試劑盒（OMEGA公司）及克隆載體pMD18-T（TaKaRa公司）。引物合成和基因測序由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成。

1.2方法

1.2.1總RNA提取與全長cDNA擴增

提取樣品總RNA，具體提取過程按照試劑盒說明書。取1 μg RNA，20 μL反應(yīng)體系中反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA。根據(jù)亞麻纖維素合酶基因LuCesA8 （Lus10029245）CDS全長序列，利用Primer Premier 5.0設(shè)計1對特異引物，LuCesA8F:5'ATGCAATCC GCCGGCGCC 3'，LuCesA8R:5'TTAAGCACCTTGA GCTTTG 3'。采用RT-PCR方法擴增基因，擴增體系含2×PCR Buffer for KOD FX Neo 25 μL、dNTP （2 mmol·L-1）10 μL、5'及3'primer（10 μmol·L-1）各2 μL、模板cDNA 1 μL、KOD FX Neo（1 U· μL-1）1 μL，滅菌水補足至50 μL。PCR反應(yīng)程序：98℃預(yù)變性5 min；循環(huán)為98℃變性10 s，60℃退火30 s，68℃延伸2 min 30 s，共30個循環(huán)；68℃延伸5 min。PCR擴增產(chǎn)物純化后克隆到pMD18-T載體上，測序分析。

1.2.2序列分析方法

ProtParam軟件（http://web.expasy.org/protparam/）分析該蛋白分子質(zhì)量與等電點；TMHMM Server v. 2.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）在線軟件分析跨膜結(jié)構(gòu)域；ProtScale（http://web.expasy.org/ protscale/）在線軟件預(yù)測該氨基酸序列疏水性/親水性；NetPhos 2.0預(yù)測LuCesA8氨基酸序列磷酸化位點。PSORT（http://psort.hgc.jp/form.html）在線軟件預(yù)測該蛋白亞細(xì)胞定位；SOPMA（http://npsa-pbil. ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/PSA/npsa_sop?ma.html）在線軟件預(yù)測蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)，Smart軟件（http://smart.embl-heidelberg.de/）分析蛋白保守結(jié)構(gòu)域。ClustalW（1.83）及Genedoc軟件作纖維素合酶基因氨基酸多序列比對分析，利用MEGA5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.3LuCesA8基因定量表達(dá)分析

選取Actin、UBI為內(nèi)參基因，LuCesA8及內(nèi)參基因熒光定量引物序列如表1所示，將反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物稀釋至同一濃度，然后按照試劑盒SYBR Premix ExTaqTM（TaKaRa）PCR擴增。12 μL反應(yīng)體系為：2×SYBR Green Realtime PCR Master mix 6 μL，上、下游引物（10 μmol·L-1）各0.25 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 4.5 μL。每個樣品3次重復(fù)，擴增條件為：94℃預(yù)變性30 s，94℃12 s，56℃45 s，72℃45 s，78.5℃讀板1 s，45個循環(huán)。利用BIO-RAD公司生產(chǎn)實時定量PCR儀擴增，計算2-△△Ct值確定不同基因相對表達(dá)量。

表1　Real-time PCR引物序列Table 1　Primers sequences for Real-time PCR

2　結(jié)果與分析

2.1亞麻LuCesA8基因擴增

以Diana品種cDNA第一條鏈為模板作PCR反應(yīng)，擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，可見一清晰條帶（見圖1）。將PCR擴增產(chǎn)物純化后克隆到pMD18-T載體，測序分析，經(jīng)測序長度為2 967 bp，編碼988個氨基酸。

圖1　LuCesA8基因克隆電泳結(jié)果Fig.1　Agarose gel electrophoresis of LuCesA8 gene cloning PCR products

2.2亞麻LuCesA8基因序列分析

該基因編碼蛋白分子質(zhì)量為111.3 ku，蛋白理論等電點為6.73，負(fù)電荷殘基（Asp+Glu）數(shù)為107個，正電荷殘基（Arg+Lys）數(shù)為104個，不穩(wěn)定系數(shù)為39.89，屬于穩(wěn)定蛋白。脂肪族氨基酸指數(shù)為85.04，蛋白疏水性為-0.126，該蛋白無信號肽。通過NetPhos 2.0預(yù)測LuCesA8氨基酸序列磷酸化位點，發(fā)現(xiàn)該蛋白有28個Ser、10個Thr和14個Tyr可能成為蛋白激酶磷酸化位點（見圖2）。在線軟件PSORT分析該蛋白亞細(xì)胞定位情況，預(yù)測該蛋白位于細(xì)胞質(zhì)膜上。SOPMA分析軟件預(yù)測該蛋白二級結(jié)構(gòu)，該蛋白由α-螺旋（34.92%）、β-折疊（9.72%）、不規(guī)則盤繞（36.44%）、延伸鏈（18.93%）組成。

通過Smart軟件分析預(yù)測亞麻LuCesA8蛋白結(jié)構(gòu)模式見圖3，該蛋白有8個預(yù)測的跨膜結(jié)構(gòu)域，2個在N-端，6個在C-端。蛋白N末端區(qū)有1個鋅指結(jié)構(gòu)ZnF（Zinc-finger），該結(jié)構(gòu)上有1個保守序列CxxC（半胱氨酸氨-xx-半胱氨酸氨），該結(jié)構(gòu)域功能尚不清楚，但推測在纖維素合酶復(fù)合體中這些結(jié)構(gòu)域與蛋白間相互作用有關(guān)，是維持纖維素合成酶復(fù)合體穩(wěn)定結(jié)構(gòu)的重要功能區(qū)。ZnF結(jié)構(gòu)域后有1個高變區(qū)（HVR-I）和2個跨膜區(qū)，第2個跨膜區(qū)上存在1個保守基序SXXCEXWF；在第2與第3兩個跨膜結(jié)構(gòu)域之間是酶的中央結(jié)構(gòu)域，其間有1個蛋白序列高變區(qū)Ⅱ（HVR-Ⅱ），高變區(qū)Ⅱ兩邊各有1個保守區(qū)域CR-1和CR-2，CR-1區(qū)含有一個保守D-天冬氨酸殘基和保守的天冬氨酸殘基DxD，該區(qū)域可結(jié)合纖維素合成的底物，CR-2區(qū)除含1個保守D-天冬氨酸殘基外，還有保守序列QxxRW，與纖維素合成酶催化活性有關(guān)。

圖2　LuCesA8蛋白磷酸化位點預(yù)測Fig.2　Predicted phosphorylation sites in LuCesA8

圖3　LuCesA8蛋白結(jié)構(gòu)特征Fig.3　Protein features of LuCesA8

以BLASTP程序進(jìn)行蛋白序列同源性比對，該蛋白在GenBank中與麻風(fēng)樹（Jatropha curcas）CesA8蛋白（XP_012091811.1）氨基酸序列同源性最高，相似性為87%。其次為胡楊（Populus euphratica）、可可樹（Theobroma cacao）、雷蒙德氏棉（Gossypium raimondii）、芝麻（Sesamum indicum）CesA8蛋白，氨基酸序列相似性分別為86%、85%、85%、81%。利用ClustalX多重序列比較分析（見圖4），發(fā)現(xiàn)不同物種間纖維素合酶CesA8序列保守性較高。

利用Clustal軟件對LuCesA8氨基酸序列與選取的24個其他物種纖維素合酶CesA8氨基酸序列作多序列比對，MEGA5.0軟件以鄰位相接法（NJ法）構(gòu)建CesA8蛋白分子進(jìn)化樹（見圖5），采用Bootstrap重復(fù)1 000次檢驗，分析亞麻LuCesA8基因與其他物種纖維素合酶CesA8關(guān)系。在該系統(tǒng)進(jìn)化樹中，亞麻LuCesA8蛋白與胡楊（Populus euphra?tica）、麻風(fēng)樹（Jatropha curcas）親緣關(guān)系最近，聚在1個分支中。

2.3亞麻纖維素合酶基因LuCesA8表達(dá)分析

通過qRT-PCR分析LuCesA8基因不同發(fā)育階段不同品種表達(dá)情況。Diana與白花同時播種，同時取材。從苗期至快速生長期，這兩個品種生長速度相同，發(fā)育時期同步。進(jìn)入現(xiàn)蕾期后白花發(fā)育較快，成熟期早于Diana。定量結(jié)果表明，兩個品種LuCesA8基因表達(dá)模式基本一致，苗期（BBCH19）表達(dá)量均較低，進(jìn)入快速生長期（BBCH32）時表達(dá)量達(dá)峰值，進(jìn)入現(xiàn)蕾期基因表達(dá)量下降，至花期（BBCH65）時該基因表達(dá)量上升至第二次高峰。在BBCH69時，出現(xiàn)蒴果，蒴果數(shù)量較少時，該基因表達(dá)量降至最低，但隨蒴果數(shù)量增加該基因表達(dá)量逐漸增加（見圖6）。

圖4　CesA8蛋白氨基酸序列多序列比對Fig.4　Multiple alignment of CesA8 protein sequence

圖5　不同植物物種纖維素合酶CesA8分子進(jìn)化關(guān)系Fig.5　Phylogenetic relationship of CesA8 proteins from different species

圖6　不同品種亞麻莖不同發(fā)育階段LuCesA8基因表達(dá)量變化Fig.6　Changes of LuCesA8 relative expression level at different developmental stages of flax stem in different varieties

3　討論與結(jié)論

亞麻纖維主要為初生韌皮纖維，纖維束由12～ 40個纖維細(xì)胞組成[13]。亞麻韌皮纖維細(xì)胞發(fā)育主要經(jīng)歷兩個階段：細(xì)胞伸長和次生細(xì)胞壁加厚，兩個時期互不重疊，分別決定韌皮纖維長度和強度，次生細(xì)胞壁加厚與韌皮纖維品質(zhì)密切相關(guān)。韌皮纖維細(xì)胞發(fā)育過程復(fù)雜，受多基因表達(dá)調(diào)控，隨亞麻基因組測序完成，很多與韌皮纖維細(xì)胞發(fā)育相關(guān)的基因，如CesA、Susy、Kor等被相繼鑒定和克隆[14-16]。其中，CesA是催化纖維素合成關(guān)鍵酶之一，是植物纖維素合成研究領(lǐng)域熱點。

植物CesA基因以超基因家族形式存在，不同成員參與不同組織、器官或細(xì)胞壁層次纖維素合成[17]。目前，在亞麻基因組中已發(fā)現(xiàn)14個CesA基因，但被克隆的CesA基因大多參與初級細(xì)胞壁形成，而參與次級細(xì)胞壁合成的CesA基因較少[18-19]。本研究通過RT-PCR法獲得亞麻纖維素合酶LuCe?sA8（Lus10029245）基因全長開放讀碼框序列。序列分析結(jié)果表明，開放讀碼框全長2 967 bp，共編碼988個氨基酸。通過多氨基酸比對發(fā)現(xiàn)，該蛋白與麻風(fēng)樹CesA8蛋白親緣關(guān)系最近，相似度達(dá)87%，與胡楊、可可樹、雷蒙德氏棉及芝麻CesA8蛋白氨基酸序列相似性分別為86%、85%、85%、81%，推測該蛋白可能參與次生細(xì)胞壁纖維素合成。該蛋白具有植物纖維素合酶基因保守結(jié)構(gòu)特征：1個鋅指結(jié)構(gòu)ZnF，2個可變區(qū)HVR-Ⅰ、HVR-Ⅱ，2個保守區(qū)CR-1和CR-2，8個跨膜結(jié)構(gòu)域及保守基序CxxC、SXXCEXWF、DxD及QxxRW等。

Day等分析亞麻開花期中期韌皮纖維組織表達(dá)基因，發(fā)現(xiàn)其中4.4%ESTs與細(xì)胞壁形成和成熟相關(guān)，其中纖維素合酶（CesA）、β-木糖苷酶，木葡聚糖核內(nèi)轉(zhuǎn)移/水解酶（XTH）、β-半乳糖苷酶及過氧化物酶基因均有較高表達(dá)量[14-15]。毛果楊中PtCe?sA8基因在木質(zhì)部特異高表達(dá)，主要參與次生細(xì)胞壁形成[17,20-21]。在擬南芥中AtCesA8是次生壁形成必需基因，主要在花序莖中表達(dá)，在缺少次生木質(zhì)部的幼葉和花等器官中微弱表達(dá)[22]。本研究通過熒光定量PCR分析不同發(fā)育階段亞麻LuCesA8基因表達(dá)特征，發(fā)現(xiàn)亞麻植株進(jìn)入快速生長期（BBCH32）時，該基因表達(dá)量最高，該發(fā)育時期正是亞麻纖維細(xì)胞啟動次生細(xì)胞壁加厚階段，當(dāng)亞麻進(jìn)入開花期（BBCH65）和綠熟期（BBCH78），LuCesA8基因表達(dá)量再次上調(diào)，此時次生細(xì)胞壁進(jìn)一步加厚，纖維素沉積，纖維逐漸成熟，由此確定LuCesA8基因與亞麻次生細(xì)胞壁加厚密切相關(guān)。LuCesA8基因在亞麻次生細(xì)胞壁形成中的功能鑒定尚待深入研究。本研究可為闡明亞麻次生細(xì)胞壁中纖維素合成機理提供參考依據(jù)。

[1]許雷.大青楊纖維素合酶基因的克隆與遺傳轉(zhuǎn)化的研究[D].哈爾濱:東北林業(yè)大學(xué),2011.

[2]Carroll A,Somerville C.Cellulosic biofuels[J].Annu Rev of Plant Biol,2008,60(1):165-182.

[3]Doblin M S,Kurek I,Jacob-Wilk D,et al.Cellulose biosynthesis in plants:From genes to rosettes[J].Plant and Cell Physiology, 2002,43(12):1407-1420.

[4]Somerville C.Cellulose synthesis in higher plants[J].Annual Re?view of Cell and Developmental Biology,2006,22(1):53-78.

[5]Mutwil M,Debolt S,Persson S.Cellulose synthesis:A complex complex[J].Current Opinion in Plant Biology,2008,11(3):252-257.

[6]Saxena I M,Brown R M Jr.Cellulose synthase and related en?zymes[J].Current Opinion in Plant Biology,2000,3(6):523-531.

[7]Haigler C H,Datcheva I,Hogan P S,et al.Carbon partitioning to cellulose synthesis[J].Plant Mol Biol,2001,47(1/2):29-51.

[8]Desprez T,Juraniec M,Crowell E F.Organization of cellulose synthease complexes involved in primary cell wall synthesis in Arabidopsis thaliana[J].PNAS,2007,104(39):15572-15577.

[9]Hill J L Jr,Hammudi M B,Tien M.The Arabidopsis cellulose syn?thase complex:A proposed hexamer of CESA trimers in an equi?molar stoichiometry[J].Plant Cell,2014,26(12):4834-4842.

[10]Wang J,Elliott J E,Williamson R E.Features of the primary wall CesA complex in wild type and cellulose-deficient mutants of Arabidopsis thaliana[J].Journal of Experimental Botany,2008,59 (10):2627-2637.

[11]Atanassov H,Pittman J K,Turner S R.Elucidating the mecha?nisms of assembly and subunit interaction of the cellulose syn?thase complex of Arabidopsis secondary cell walls[J].Journal of Bi?ological Chemistry,2009,284(6):3833-3841.

[12]吳廣文,關(guān)鳳芝.亞麻生長發(fā)育周期BBCH劃分法介紹[J].黑龍江農(nóng)業(yè)科學(xué),2005(4):64-65.

[13]莊馥萃.植物纖維和纖維植物[J].生物學(xué)通報,2001,36(11): 16-18.

[14]Day A,Addi M,Kim W,et al.ESTs from the fibre-bearing stem tissues of flax(Linum usitatissimum L.):Expression analyses of sequences related to cell wall development[J].Plant Biology, 2005,7(1):23-32.

[15]李翔,陳信波,鄒杰,等.亞麻韌皮纖維細(xì)胞發(fā)育分子生物學(xué)研究進(jìn)展[J].湖南農(nóng)業(yè)科學(xué),2011(9):4-7.

[16]吳建忠.亞麻LusiCesA1上調(diào)基因表達(dá)研究[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2016,47(3):44-51.

[17]龐景,童再康,黃華宏,等.杉木纖維素合成酶基因CesA的克隆及表達(dá)分析[J].浙江農(nóng)林大學(xué)學(xué)報,2015,32(1):40-46.

[18]Suzuki S,Li L G,Sun Y H,et a1.The cellulose synthase gene su?pedamily and biochemical functions of xylem·specific cellulose synthase·like genes in Populus trichocarpa[J].Plant Physiology, 2006,142(3):1233-1245.

[19]陳亞娟,王宏芝,李瑞芬,等.毛白楊纖維素合酶基因家族部分成員的克隆及表達(dá)[J].林業(yè)科學(xué),2011,47(10):70-75.

[20]高原,陳信波,龍松華,等.亞麻纖維素合成酶及其類蛋白基因部分序列的克隆[J].中國麻業(yè)科學(xué),2008,30(6):293-297.

[21]吳建忠.亞麻纖維素合酶關(guān)鍵基因(LusiCesA1)的克隆[J].作物雜志,2014(6):36-39.

[22]Soraya D,Mats L,Lars A,et a1.The genome sequence of black cottonwood(Populus trichocarpa)reveals l 8 conserved cellulose synthase(CesA)genes[J].Planta,2005,221(5):739-746.

Cloning and expression analysis of the cellulose synthase geneLuCesA8 in flax

/YU Ying1,2,GUO Wendong3,ZHAO Lijuan1,4,WU Jianzhong2,CHENG Lili2, ZHAO Dongsheng2,HU Yingying2,WU Guangwen2,GUAN Fengzhi1,2,YUAN Hongmei1,2(1.Postdoctoral Workstation,Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences,Harbin 150086,China;2.Institute of Industrial Crops,Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences,Harbin 150086,China;3.Institute of Nature and Ecology,Heilongjiang Academy of Sciences,Harbin 150040,China;4.Institute of Crop Breeding,HeilongjiangAcademy ofAgricultural Sciences,Harbin 150086,China)

The total RNA extracted from flax stems at the stage of rapid growth was used for RT-PCR, then the full-length Open Reading Frame(ORF)sequence ofLuCesA8(Gene ID:Lus10029245)was amplified.The sequence analysis showed that the full-length ORF ofLuCesA8 consisted of 2 967 bp, encoding 988 amino acids.Homology analysis of the deduced amino acid showed 86%,85%,85%,81% identity to CesA8 fromPopulus trichocarpa,Theobroma cacao,Gossypium raimondiiandSesamum indicum,respectively.The qRT-PCR result revealed that the expression level of the gene was low at seedlingstage,and relatively higher at flowering and maturity stage,this gene expressed the highest level at the stage of rapid growth.This study provided a foundation for further research ofLuCesA8 biological function in the process of cellulose synthesis of the secondary cell wall.

flax;cellulose synthase;clone;expression analysis

S563.2；Q785

A

1005-9369（2016）08-0039-07

2016-05-14

哈爾濱市科技局創(chuàng)新人才項目（2013RFQYJ162）；黑龍江省博士后項目（LBH-Z13181）；國家博士后面上項目（2014M560275）

于瑩（1981-），女，助理研究員，博士，研究方向為亞麻遺傳育種。E-mail:yuying_1981_0451@163.com

袁紅梅，副研究員，博士，研究方向為亞麻遺傳育種。E-mail:yuanhm1979@163.com