欒非時(shí)，盧丙洋,，周慧文,，王學(xué)征,

（1.農(nóng)業(yè)部東北地區(qū)園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱　150030；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，哈爾濱　150030）

甜瓜遺傳連鎖圖譜構(gòu)建及果實(shí)相關(guān)性狀QTL定位

欒非時(shí)12，盧丙洋1,2，周慧文1,2，王學(xué)征1,2

（1.農(nóng)業(yè)部東北地區(qū)園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱150030；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，哈爾濱150030）

試驗(yàn)以厚皮甜瓜品系M4-5為母本材料，薄皮甜瓜品系M1-15為父本材料，配制雜交組合獲得F1、F2代，研究甜瓜果實(shí)相關(guān)性狀遺傳規(guī)律。對(duì)M4-5和M1-15兩親本間存在SNP突變位點(diǎn)序列作CAPS檢測(cè)，共設(shè)計(jì)CAPS標(biāo)記523對(duì)，CAPS標(biāo)記223對(duì)，多態(tài)率43.8%。利用多態(tài)性引物標(biāo)記F2代群體，構(gòu)建甜瓜遺傳連鎖圖譜，該圖譜包含195個(gè)標(biāo)記，12個(gè)連鎖群，1 702.55 cM，標(biāo)記間平均距離8.78 cM。28個(gè)，貢獻(xiàn)率介于3.4974%～17.9684%。其中與果實(shí)形狀相關(guān)位點(diǎn)14個(gè)，與產(chǎn)量相關(guān)位點(diǎn)9個(gè)，與可溶性固形物含量相關(guān)位點(diǎn)5個(gè)。

甜瓜；果實(shí)性狀；遺傳連鎖圖譜；QTL

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間2016-8-24 15:04:00[URL]http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20160824.1504.004.html

欒非時(shí),盧丙洋,周慧文,等.甜瓜遺傳連鎖圖譜構(gòu)建及果實(shí)相關(guān)性狀QTL定位[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2016,47(8):9-20.

Luan Feishi,Lu Bingyang,Zhou Huiwen,et al.Construction of genetic linkage map and QTL location for fruit-related traits in melon[J].Journal of Northeast Agricultural University,2016,47(8):9-20.(in Chinese with English abstract)

甜瓜（Cucumis melon L.）是被子植物亞門、雙子葉植物綱、葫蘆目、葫蘆科、屬一年生蔓性草本植物。染色體2n=2x=24。我國(guó)現(xiàn)為世界甜瓜種植面積最大、產(chǎn)量最高的國(guó)家。果實(shí)形狀、體積、果重、可溶性固形物含量等性狀是影響果實(shí)品質(zhì)重要因素[1]。目前，果實(shí)形狀、果實(shí)重量、可溶性固形物含量等是甜瓜果實(shí)性狀基因定位研究主要對(duì)象。Périn等用同一個(gè)圓形果實(shí)甜瓜品系分別與兩個(gè)長(zhǎng)形果實(shí)甜瓜品系雜交構(gòu)建兩個(gè)重組自交系群體，定位和分析控制甜瓜果形基因，兩個(gè)群體中果形性狀主要受果實(shí)長(zhǎng)度影響，與果實(shí)形狀和子房形狀相關(guān)的QTL位點(diǎn)存在大量共區(qū)間現(xiàn)象，說明在子房發(fā)育過程中活躍著大量控制果實(shí)形狀基因，可能存在基因多效現(xiàn)象[2]。Monforte等利用F2和DH群體，共檢測(cè)到20個(gè)與甜瓜早熟性、果形及可溶性固形物含量相關(guān)QTL位點(diǎn)。在9號(hào)連鎖群檢測(cè)到1個(gè)與甜瓜外果皮顏色相關(guān)位點(diǎn)，在1號(hào)連鎖群檢測(cè)到和綠色果肉顏色相關(guān)位點(diǎn)?？刂瞥壬忸伾倪z傳因素相對(duì)復(fù)雜，在2號(hào)和12號(hào)連鎖群分別找到和橙色果肉顏色相關(guān)位點(diǎn)，擴(kuò)大群體規(guī)模有利于闡明控制橙色果肉遺傳因素[3]。果實(shí)重量是影響產(chǎn)量重要因素。Zalapa等在探究甜瓜產(chǎn)量相關(guān)性狀時(shí)共檢測(cè)到包括單株果重、單果平均重在內(nèi)5個(gè)性狀的37個(gè)QTL位點(diǎn)，試驗(yàn)結(jié)果表明甜瓜種質(zhì)資源中高度分枝類型的基因更具增產(chǎn)潛力[1]。Obando等以RILs群體為基礎(chǔ)檢測(cè)到134個(gè)與甜瓜果實(shí)品質(zhì)性狀相關(guān)QTL位點(diǎn)，其中包括與形態(tài)學(xué)和外觀性狀相關(guān)位點(diǎn)52個(gè)，與顏色性狀相關(guān)位點(diǎn)69個(gè)，余下23個(gè)位點(diǎn)與果實(shí)風(fēng)味性狀相關(guān)[4]。Diaz等參考國(guó)際葫蘆科基因組計(jì)劃數(shù)據(jù)，將8個(gè)甜瓜圖譜整合為一個(gè)圖譜，分析果實(shí)相關(guān)性狀發(fā)現(xiàn)果實(shí)形狀遺傳可能性明顯高于果實(shí)重量和可溶性固形物含量[5]。Diaz等以中等大小、長(zhǎng)果形的印度地方甜瓜品種PI1124112和果形較大、橢圓形西班牙栽培甜瓜品種PS為親本材料雜交獲得F2代群體，利用基于遺傳連鎖分析QTL定位，共檢測(cè)到10個(gè)和果實(shí)形狀相關(guān)QTL位點(diǎn)，分別與果實(shí)長(zhǎng)度、果實(shí)直徑和果形相關(guān)，3個(gè)性狀中均檢測(cè)到貢獻(xiàn)率較大的QTL位點(diǎn)[6]。Ramamurthy等研究甜瓜果實(shí)形狀和子房形狀過程中，發(fā)現(xiàn)兩者之間存在顯著正相關(guān)，與Périn等結(jié)果相似，說明甜瓜果實(shí)形狀在開花期之前已確定。Ramamurthy等利用基于遺傳連鎖分析的QTL定位時(shí)，共檢測(cè)到31個(gè)與甜瓜果實(shí)品質(zhì)和形態(tài)性狀相關(guān)的QTL位點(diǎn)，其中23個(gè)位點(diǎn)得到證實(shí)，8個(gè)新定位的QTL位點(diǎn)涉及果實(shí)形狀、單株總果重、可溶性固形物含量、果肉顏色、子房形狀等[7]。

本試驗(yàn)以厚皮甜瓜品系M4-5為母本材料，薄皮甜瓜品系M1-15為父本材料，配制雜交組合獲得F1、F2代，研究甜瓜果實(shí)相關(guān)性狀遺傳規(guī)律，利用CAPS標(biāo)記構(gòu)建遺傳連鎖圖譜，通過分子標(biāo)記找到控制果實(shí)相關(guān)性狀位點(diǎn)，為進(jìn)一步開展甜瓜果實(shí)相關(guān)基因定位和克隆研究提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1田間試驗(yàn)材料

以遺傳和表型差異極大作為親本材料選擇依據(jù)，并配置雜交組合用以表型數(shù)據(jù)調(diào)查和圖譜構(gòu)建。母本材料為厚皮甜瓜伊麗莎白（M4-5），中早熟品系，果實(shí)圓形（果形指數(shù)0.9），果皮厚，果實(shí)大（單果重0.96 kg）。父本材料為薄皮甜瓜M1-15，早熟品系，果實(shí)長(zhǎng)橢圓形（果形指數(shù)1.5），果皮薄，果實(shí)?。▎喂?.24 kg）。兩親本材料來源于東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院西甜瓜分子育種研究室。利用母本M4-5和父本M1-15配置雜交組合，獲得F1代，F(xiàn)1代自交獲得F2代。

1.2田間試驗(yàn)設(shè)計(jì)

2015年4月～2015年8月，在東北農(nóng)業(yè)大學(xué)設(shè)施園藝工程中心1號(hào)大棚播種P1、P2、F1和F2代群體，采用完全隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，3次重復(fù)，親本P1、P2及F1各種植30株，每小區(qū)種植10株。隨機(jī)種植F2300株（見圖1），株行距35 cm×50 cm。待果實(shí)成熟后測(cè)定果實(shí)相關(guān)性狀。

圖1　田間布局Fig.1　Distribution in plastic greenhouse

1.3果實(shí)性狀調(diào)查方法

將收獲的父、母本，F(xiàn)1和F2群體中成熟甜瓜果實(shí)分株標(biāo)號(hào)，每株收獲1個(gè)果實(shí)，每個(gè)果實(shí)每個(gè)性狀測(cè)定3次，取測(cè)量3次平均值作結(jié)果，其中父、母本，F(xiàn)1代各測(cè)定30株，F(xiàn)2代測(cè)定284株，具體測(cè)定方法如下：

單果重：電子天平測(cè)量；

外果皮和食用果皮硬度：硬度計(jì)測(cè)量；

種腔、果實(shí)長(zhǎng)度、寬度：直尺測(cè)量；

種腔與果實(shí)比例：種腔與果實(shí)長(zhǎng)度比值；

可溶性固形物：手持糖度儀測(cè)定。

1.4分子標(biāo)記試驗(yàn)內(nèi)容與方法

1.4.1CAPS分子標(biāo)記開發(fā)

以兩親本材料基因組重測(cè)序數(shù)據(jù)為依據(jù)，已發(fā)布甜瓜基因組數(shù)據(jù)為參考，利用東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院西甜瓜實(shí)驗(yàn)室自編Perl語(yǔ)言腳本提取SNP位點(diǎn)前后約500 bp堿基序列，利用SNP2CAPS[8]軟件查找存在差異的酶切位點(diǎn)候選序列，根據(jù)序列中突變位點(diǎn)所處位置，選擇適合CAPS標(biāo)記開發(fā)的序列設(shè)計(jì)引物。

1.4.2DNA提取

待M4-5（♀）、M1-15（♂）、F1代及其自交獲得的F2代群體定植緩苗后，采集幼嫩葉片，分袋保存，分別標(biāo)號(hào)，以免混淆，用以提取DNA。

采用改良CTAB法提取植物基因組DNA[9]，應(yīng)用氯仿、異戊醇（24 ? 1）抽提3次，以保證DNA純度。提取親本及F1的DNA用于CAPS標(biāo)記多態(tài)性篩選，F(xiàn)2單株DNA用于遺傳連鎖分析。

1.4.3CAPS標(biāo)記篩選與驗(yàn)證

將引物母液按體積比1 ? 49稀釋后，采用降落式PCR（Touchdown PCR）反應(yīng)程序進(jìn)行引物PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)程序參照束永俊等方法[10]，步驟略有改動(dòng)，PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠電泳上檢驗(yàn)。

參照限制性內(nèi)切酶操作說明書對(duì)酶切位點(diǎn)加以驗(yàn)證，利用Eco RⅠ、HindⅢ、PstⅠ、Bam HⅠ 4種限制性核酸內(nèi)切酶分別對(duì)相應(yīng)PCR產(chǎn)物酶切驗(yàn)證，酶切體系為15.3 μL，酶切反應(yīng)在水浴鍋中進(jìn)行，具體酶切溫度根據(jù)4種不同限制性內(nèi)切酶最適反應(yīng)溫度設(shè)定，均為37℃。1%瓊脂糖凝膠電泳酶切產(chǎn)物檢驗(yàn)。

1.5遺傳連鎖圖譜構(gòu)建

利用IciMapping V3.3對(duì)具有多態(tài)性且應(yīng)用到F2代基因分型的分子標(biāo)記構(gòu)建遺傳圖譜，采用復(fù)合區(qū)間作圖法構(gòu)建遺傳連鎖圖譜。利用MapChart2.2軟件繪制遺傳連鎖圖譜，依次將連鎖群命名為L(zhǎng)G1～LG12。

1.6QTL定位分析方法

QTL分析使用IciMapping V3.3軟件，采用復(fù)合區(qū)間作圖法，以1.0 cM步行速度在全基因組內(nèi)掃描。以性狀英文縮寫、連鎖群編號(hào)和QTL編號(hào)為依據(jù)命名其QTL。

2　結(jié)果與分析

2.1甜瓜果實(shí)相關(guān)性狀表型數(shù)據(jù)分析

2.1.1親本及F1果實(shí)表型數(shù)據(jù)分析

由表1可知，兩親本M4-5和M1-15果實(shí)各性狀存在差異，母本M4-5單果重、果實(shí)長(zhǎng)、果實(shí)寬、種腔直徑均明顯大于父本M1-15，僅果形指數(shù)小于父本M1-15，可溶性固形物和種腔與果實(shí)比這兩個(gè)性狀兩親本差異不顯著。在F1代果實(shí)中，單果重、果實(shí)寬、果形指數(shù)、種腔直徑及種腔與果實(shí)比均介于兩親本之間，而果實(shí)長(zhǎng)度存在超親現(xiàn)象，明顯大于兩親本值，可溶性固形物含量明顯小于兩親本。

表1　親本、F1及F2群體果實(shí)相關(guān)性狀表現(xiàn)Table 1　Fruit-related trait separation proportion of the parental materials,F1and F2generation

2.1.2果實(shí)單果重表型數(shù)據(jù)分析

由圖2可知，在單果重方面，母本M4-5單果重為（0.96±0.55）kg，父本M1-15單果重為（0.24± 0.13）kg，F(xiàn)1單果重為（0.60±0.68）kg，介于兩親本之間。在F2代果實(shí)中，單果重呈連續(xù)分離狀態(tài)，且存在超親現(xiàn)象，單果重分離范圍0.17～1.97 kg，整體分離趨勢(shì)基本符合正態(tài)分布，表明單果重受多個(gè)基因共同控制，同時(shí)存在主效基因，為數(shù)量性狀，可作QTL定位分析。

2.1.3果實(shí)長(zhǎng)度表型數(shù)據(jù)分析

由圖3可知，在果實(shí)長(zhǎng)度方面，母本M4-5果實(shí)長(zhǎng)度為（11.6±0.21）cm，父本M1-15果實(shí)長(zhǎng)度為（10.11±0.18）cm，F(xiàn)1果實(shí)長(zhǎng)度為（13.36±0.57）cm，果實(shí)長(zhǎng)度均高于兩親本。在F2代果實(shí)中，果實(shí)長(zhǎng)度分離范圍7.00～20.80 cm，最高值和最低值均出現(xiàn)超親遺傳，分離趨勢(shì)基本符合正態(tài)分布，表明果實(shí)長(zhǎng)度受多個(gè)基因共同控制，同時(shí)存在主效基因，為數(shù)量性狀，可作QTL定位分析。

圖2　果實(shí)單果重次數(shù)分布Fig.2　Fruit weight proportion distribution in F2population

圖3　果實(shí)長(zhǎng)度次數(shù)分布Fig.3　Fruit length proportion distribution in F2population

2.1.4果實(shí)寬度表型數(shù)據(jù)分析

由圖4可知，在果實(shí)寬度方面，母本M4-5果實(shí)寬度為（12.95±0.29）cm，父本M1-15果實(shí)寬度為（6.64±0.12）cm，F(xiàn)1果實(shí)寬度為（9.59±0.44）cm，F(xiàn)1代表型數(shù)據(jù)介于父本和母本之間。在F2代果實(shí)中，果實(shí)寬度為6.50～16.00 cm，與兩親本相比存在超親現(xiàn)象，分離趨勢(shì)呈連續(xù)正態(tài)分布，表明果實(shí)寬度受多個(gè)基因共同控制，同時(shí)存在主效基因，為數(shù)量性狀，可作QTL定位分析。

2.1.5果形指數(shù)表型數(shù)據(jù)分析

由圖5可知，在果形指數(shù)方面，母本M4-5果形指數(shù)為0.90±0.13，果實(shí)為近圓形，父本M1-15果形指數(shù)為1.53±0.18，果實(shí)為長(zhǎng)橢圓形，F(xiàn)1代果形指數(shù)為1.40±0.25，果形指數(shù)介于兩親本之間，且偏向父本M1-15，為長(zhǎng)橢圓形。

在F2代果實(shí)中，果形指數(shù)分離范圍0.89～ 1.98，既有親本類型的近圓形和長(zhǎng)橢圓形，也存在兩者之間過渡類型且有超親現(xiàn)象。分離情況呈連續(xù)正態(tài)分布，表明果形指數(shù)為數(shù)量性狀，可作QTL定位分析。

圖4　果實(shí)寬度次數(shù)分布Fig.4　Fruit width proportion distribution in F2population

圖5　果形指數(shù)次數(shù)分布Fig.5　Fruit shape index proportion distribution in F2population

2.1.6種腔表型數(shù)據(jù)分析

由圖6可知，母本M4-5種腔直徑為（6.55± 0.17）cm，父本M1-15種腔直徑為（3.78±0.69）cm，父母本差異顯著。F1代種腔直徑為（5.16±0.24）cm，介于兩親本之間，且偏向于父本。F2代種腔直徑3.40～9.50 cm，存在超親現(xiàn)象，分離情況呈正態(tài)分布，為數(shù)量性狀，可作QTL定位分析。

2.1.7種腔與果實(shí)比表型數(shù)據(jù)分析

由圖7可知，種腔與果實(shí)比可顯示果實(shí)可食用率，通過種腔與果實(shí)比數(shù)據(jù)顯示，M4-5和M1-15可食用率基本相同，F(xiàn)1代數(shù)據(jù)介于兩親本之間，F(xiàn)2代群體中可食用率出現(xiàn)較大變異，種腔與果實(shí)最大比值為0.76，最小比值為0.40，呈正態(tài)分布，為數(shù)量性狀。

2.1.8可溶性固形物表型數(shù)據(jù)分析

由圖8可知，母本M4-5可溶性固形物含量為（9.24±0.43）%，父本M-15可溶性固形物含量為（10.69±0.26）%，F(xiàn)1代果實(shí)可溶性固形物含量低于兩親本，F(xiàn)2代群體可溶性固形物含量4.00%～14.00%，存在較大幅度變異，均出現(xiàn)超親遺傳現(xiàn)象。F2代群體呈正態(tài)單峰分布，表明可溶性固形物含量受多個(gè)基因共同控制，同時(shí)存在主效基因，為數(shù)量性狀。

圖6　種腔次數(shù)分布Fig.6　Seed cavity proportion distribution in F2population

圖7　種腔與果實(shí)比次數(shù)分布Fig.7　Ratio of seed cavity and fruit proportion distribution in F2population

圖8　可溶性固形物次數(shù)分布Fig.8　Brix content proportion distribution in F2population

2.2甜瓜遺傳連鎖圖譜構(gòu)建

2.2.1甜瓜基因組DNA提取

利用改良CTAB法提取基因組DNA，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，電泳結(jié)果見圖9，父母本、F1及F2代分離群體DNA濃度和純度均可用于分子標(biāo)記檢測(cè)，無RNA和蛋白質(zhì)，對(duì)分子標(biāo)記檢測(cè)不存在影響。

圖9　甜瓜基因組DNAFig.9　Genomic DNA of melon

2.2.2CAPS引物篩選與驗(yàn)證

通過測(cè)序結(jié)果，根據(jù)HindⅢ、Eco RⅠ、Bam HⅠ和PstⅠ酶切位點(diǎn)信息對(duì)M4-5和M1-15兩親本間有存在SNP突變位點(diǎn)序列作CAPS檢測(cè)，利用Primer 6設(shè)計(jì)并選用523對(duì)引物。利用提取的親本及F1代DNA，對(duì)設(shè)計(jì)的523對(duì)CAPS引物作PCR和酶切反應(yīng)，驗(yàn)證引物多態(tài)性和共顯性。圖10為部分有多態(tài)性引物經(jīng)PCR和酶切反應(yīng)后產(chǎn)物電泳條帶。驗(yàn)證結(jié)果顯示，523對(duì)CAPS引物中有229對(duì)存在多態(tài)性和共顯性，多態(tài)率達(dá)43.8%。

圖10　CAPS引物在親本及F1代多態(tài)性表現(xiàn)Fig.10　Polymorphism of CAPS markers among parental materials and F1generation

2.2.3甜瓜遺傳圖譜構(gòu)建

利用篩選出的多態(tài)性引物在F2代群體中作分析，IciMapping V3.3軟件對(duì)多態(tài)性CAPS標(biāo)記連鎖作圖，排除條帶不清與偏分離標(biāo)記，用于作圖引物共計(jì)195對(duì)，如圖11所示，構(gòu)建一張包含12個(gè)連鎖群，覆蓋基因組長(zhǎng)度1 702.55 cM，標(biāo)記間平均距離8.78 cM的甜瓜F2代臨時(shí)群體遺傳圖譜，圖譜中來源于同一條染色體CAPS標(biāo)記均位于相同連鎖群上，將連鎖群依次命名為L(zhǎng)G1～LG12，連鎖群長(zhǎng)度介于105.16～187.34 cM。該圖譜最長(zhǎng)連鎖群為L(zhǎng)G2，長(zhǎng)度為187.34 cM，包含18個(gè)CAPS標(biāo)記，最短連鎖群為L(zhǎng)G10，長(zhǎng)度105.16 cM，包含12個(gè)CAPS標(biāo)記（見表2和圖11），包含最多標(biāo)記連鎖群為L(zhǎng)G4，共23個(gè)標(biāo)記，包含標(biāo)記最少連鎖群為L(zhǎng)G10，共12個(gè)標(biāo)記。連鎖群LG10為包含標(biāo)記最少，長(zhǎng)度最短連鎖群。

2.3果實(shí)相關(guān)性狀QTL定位分析

2.3.1單果重QTL分析

對(duì)于單果重，如表3所示，共定位到3個(gè)QTL，均為微效QTL位點(diǎn)，分別位于連鎖群LG5、LG6和LG11上。其中FW5.1和FW6.1對(duì)單果重起增加作用，而FW11.1起減小作用。這3個(gè)QTL位點(diǎn)中貢獻(xiàn)率最大的是位于連鎖群LG5上的FW5.1，貢獻(xiàn)率為6.8534%，定位在標(biāo)記M5-37和M5-22之間，距離M5-37距離1.02 cM，距離M5-22距離0.33 cM，距離兩標(biāo)記距離均相對(duì)較近。貢獻(xiàn)率最小的為定位在連鎖群LG11的FW11.1，貢獻(xiàn)率僅3.7775%，位于標(biāo)記M11-2和M11-22之間，距離兩標(biāo)記距離分別為9.65和0.28 cM，該位點(diǎn)只與一端標(biāo)記距離近，而與另一端標(biāo)記距離則較遠(yuǎn)。

2.3.2果實(shí)長(zhǎng)度QTL分析

通過田間數(shù)據(jù)與分子數(shù)據(jù)結(jié)合分析，共檢測(cè)到與果實(shí)長(zhǎng)度相關(guān)的QTL位點(diǎn)5個(gè)（見表4），其中包含1個(gè)貢獻(xiàn)率>10%的QTL位點(diǎn)，其余QTL位點(diǎn)貢獻(xiàn)率3.4974%～4.6475%。這5個(gè)QTL分別位于連鎖群LG3、LG5、LG6、LG9和LG11上。除FL5.1對(duì)增加甜瓜果實(shí)長(zhǎng)度表現(xiàn)為正的加性效應(yīng)外，其余4個(gè)QTL位點(diǎn)對(duì)增加甜瓜果實(shí)長(zhǎng)度表現(xiàn)為負(fù)的加性效應(yīng)，即降低果實(shí)長(zhǎng)度。定位在連鎖群LG3 的FL3.1，定位在連鎖群LG6的FL6.1和定位在連鎖群LG11的FL11.1這3個(gè)QTL位點(diǎn)均與一側(cè)標(biāo)記距離較近，分別為0.04、0.39和0.28 cM，而距另一側(cè)標(biāo)記相對(duì)較遠(yuǎn)，分別為13、10.93和9.65 cM。貢獻(xiàn)率最大的FL5.1定位距離與其他QTL位點(diǎn)相比，與相鄰標(biāo)記間距離相對(duì)較遠(yuǎn)，分別為14和10.01 cM。

圖11　甜瓜遺傳連鎖圖譜及果皮與果實(shí)相關(guān)性狀定位位點(diǎn)Fig.11　Genetic linkage map and locus for pericarp-related and fruit-related traits of melon

表2　甜瓜遺傳連鎖圖譜基本參數(shù)Table 2　Parameter of melon genetic linkage map

表3　甜瓜單果重QTL遺傳效應(yīng)分析Table 3　Genetic effects analysis of QTLs for fruit weight in melon

2.3.3果實(shí)寬度QTL分析

如表5所示，關(guān)于果實(shí)寬度僅定位到兩個(gè)QTL位點(diǎn)，分別位于連鎖群LG5和LG6上，兩標(biāo)記貢獻(xiàn)率分別達(dá)7.1447%和9.4046%，同時(shí)對(duì)于果實(shí)寬度均起增加作用。在連鎖群LG5上定位到的FWID5.1距離標(biāo)記M5-48距離為3.01 cM，距離標(biāo)記M5-49距離為0.64 cM。在連鎖群LG6上定位到的FWID6.1距離兩標(biāo)記距離分別為2.99和3.07 cM。與定位到的關(guān)于果實(shí)長(zhǎng)度QTL位點(diǎn)相比，關(guān)于果實(shí)寬度的QTL位點(diǎn)定位距離相對(duì)較近。

2.3.4果形指數(shù)QTL分析

定位到與果形指數(shù)相關(guān)的QTL位點(diǎn)共計(jì)7個(gè)（見表6），分別位于連鎖群LG1、LG2、LG4、LG7、LG9和LG10。其中貢獻(xiàn)率為17.9684%的主效QTL，位于連鎖群LG7上，該位點(diǎn)被定位在標(biāo)記M7-39和M7-24之間，距離兩標(biāo)記分別為1.06 和1.80 cM。在連鎖群LG4上，共檢測(cè)到兩個(gè)與果形指數(shù)有關(guān)QTL位點(diǎn)，兩位點(diǎn)貢獻(xiàn)率為7個(gè)QTL中最小。這7個(gè)關(guān)于果形指數(shù)的QTL貢獻(xiàn)率累計(jì)達(dá)41.55%。在LG2上定位到的FSI2.1與標(biāo)記M2-12緊密連鎖，距離僅為0.16 cM。在定位到與果形指數(shù)相關(guān)的QTL位點(diǎn)中，定位結(jié)果與果實(shí)長(zhǎng)度QTL位點(diǎn)一樣，也存在QTL位點(diǎn)只與一側(cè)標(biāo)記緊密連鎖，與另一標(biāo)記距離相對(duì)較遠(yuǎn)的情況。

表5　 甜瓜果實(shí)寬度QTL遺傳效應(yīng)分析Table 5　Genetic effects analysis of QTLs for fruit width in melon

表6　甜瓜果形指數(shù)QTL遺傳效應(yīng)分析Table 6　Genetic effects analysis of QTLs for fruit shape index in melon

2.3.5種腔QTL分析

種腔體積既影響果實(shí)食用率同時(shí)也影響產(chǎn)量，種腔越小，食用率越高，產(chǎn)量也越高。在種腔定位中，共定位到3個(gè)QTL位點(diǎn)，分別位于連鎖群LG4、LG5和LG6（見表7），其中定位在連鎖群LG5上的QTL位點(diǎn)SC5.1與相鄰兩標(biāo)記距離最近，分別為0.67和0.95 cM。定位在LG6上的QTL位點(diǎn)SC6.1貢獻(xiàn)率最大，達(dá)7.8495%。但并未定位到關(guān)于種腔的主效QTL位點(diǎn)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)種腔和果實(shí)寬度共同定位在標(biāo)記M6-39和M6-22之間。

2.3.6果實(shí)可溶性固形物含量QTL分析

如表8所示，共定位到關(guān)于可溶性固形物含量QTL位點(diǎn)5個(gè)，連鎖群LG2上存在1個(gè)，LG6上存在1個(gè)，LG7上存在2個(gè)，LG9上存在1個(gè)。5個(gè)QTL貢獻(xiàn)率達(dá)3.8933%-5.7898%，BRC6.1和BRC9.1加性效應(yīng)值為負(fù)值，表明對(duì)果實(shí)可溶性固形物含量起減小作用，其余QTL加性效應(yīng)值為正值，對(duì)果實(shí)可溶性固形物含量起增加作用。

2.3.7種腔與果實(shí)比QTL分析

種腔與果實(shí)比可從側(cè)面反映果皮厚度及可食用率，比值越小可食用率越大。結(jié)合表型數(shù)據(jù)與分子數(shù)據(jù)，共計(jì)定位到3個(gè)QTL位點(diǎn)，分別位于連鎖群LG4、LG8和LG9上。其中CFR4.1加性效應(yīng)為正，表明增加種腔與果實(shí)比，即對(duì)可食用率起降低作用，而其余位點(diǎn)加性效應(yīng)為負(fù)，表明對(duì)可食用率起增加作用。

在定位距離上，CFR4.1和CFR8.1出現(xiàn)與一側(cè)標(biāo)記緊密連鎖的情況，與另一側(cè)標(biāo)記距離相對(duì)較遠(yuǎn)。CFR9.1與兩標(biāo)記間距離分別為4.87和2.08 cM（見表9）。

表7　 甜瓜種腔QTL遺傳效應(yīng)分析Table 7　Genetic effects analysis of QTLs for seed cavity in melon

表8　 甜瓜可溶性固形物QTL遺傳效應(yīng)分析Table 8　Genetic effects analysis of QTLs for brix content in melon

表9　甜瓜果實(shí)與種腔比QTL遺傳效應(yīng)分析Table 9　Genetic effects analysis of QTLs for seed cavity and fruit ratio in melon

3　討　論

3.1基于重測(cè)序的分子標(biāo)記開發(fā)

本研究用于構(gòu)建遺傳連鎖圖譜的195個(gè)CAPS分子標(biāo)記均源于甜瓜基因組重測(cè)序數(shù)據(jù)開發(fā)，是該圖譜最顯著的特點(diǎn)。

與其他標(biāo)記相比，CAPS標(biāo)記具有以下優(yōu)勢(shì)：①兩親本材料序列比對(duì)后設(shè)計(jì)的CAPS引物具有更強(qiáng)針對(duì)性和更高多態(tài)性，本試驗(yàn)中CAPS引物多態(tài)性達(dá)43.8%。②用瓊脂糖凝膠電泳即能對(duì)CAPS標(biāo)記檢測(cè)，方便且易于觀測(cè)。③基因組中數(shù)量龐大的單堿基突變?yōu)闃?gòu)建高飽和遺傳連鎖圖譜提供更大可能性。④多數(shù)單堿基突變位點(diǎn)位于基因編碼區(qū)及功能區(qū)，利于對(duì)相關(guān)性狀精細(xì)定位。⑤所構(gòu)建遺傳連鎖圖譜與實(shí)際染色體相對(duì)應(yīng)，基因定位更有實(shí)際意義。

3.2果實(shí)相關(guān)性狀分析及QTL定位

通過相關(guān)性分析結(jié)果顯示，甜瓜果實(shí)性狀大部分均顯著相關(guān)，在定位分析中，這些性狀也均在相同連鎖群上，有的甚至定位在相同區(qū)域。這種現(xiàn)象存在于甜瓜中[7]，也存在于其他作物中，如西瓜、茄子、辣椒、番茄、玉米、紅麻等[11-19]。Ramamurthy等研究表明，與甜瓜果實(shí)長(zhǎng)度、果實(shí)寬度、果形指數(shù)、單果重、果肉厚度等相關(guān)QTL位點(diǎn)富集于連鎖群LG8上[7]，本研究結(jié)果也出現(xiàn)QTL簇，QTL聚集在連鎖群LG6和LG9上，在LG6上同時(shí)定位到關(guān)于果實(shí)形狀、產(chǎn)量及食用果皮厚度和裂果等相關(guān)性狀位點(diǎn)，在LG9上定位到果實(shí)形狀、產(chǎn)量以及外果皮類型等相關(guān)性狀位點(diǎn)。對(duì)于這種現(xiàn)象，有學(xué)者認(rèn)為與基因多因一效和一因多效遺傳機(jī)制有關(guān)[20-21]，為聚合多種優(yōu)良性狀分子育種手段奠定理論基礎(chǔ)。

4　結(jié)論

4.1甜瓜遺傳圖譜構(gòu)建

利用生物信息學(xué)分析軟件挖掘SNP位點(diǎn)，對(duì)M4-5和M1-15兩親本間存在SNP突變位點(diǎn)序列作CAPS檢測(cè)，共設(shè)計(jì)CAPS標(biāo)記523對(duì)，篩選出在親本間有多態(tài)性CAPS標(biāo)記223對(duì)，多態(tài)率43.8%。利用多態(tài)性引物對(duì)F2代群體作標(biāo)記分析，構(gòu)建甜瓜遺傳連鎖圖譜，該圖譜包含195個(gè)標(biāo)記，12個(gè)連鎖群，覆蓋基因組長(zhǎng)度1 702.55 cM，標(biāo)記間平均距離8.78 cM。該圖譜最長(zhǎng)連鎖群為L(zhǎng)G2，最短連鎖群為L(zhǎng)G10。

4.2甜瓜果實(shí)相關(guān)性狀遺傳分析

果實(shí)相關(guān)性狀包括果實(shí)形狀、產(chǎn)量、可溶性固形物，研究表明這些與果實(shí)相關(guān)性狀均為數(shù)量性狀。通過遺傳分析和相關(guān)性研究發(fā)現(xiàn)果皮及果實(shí)相關(guān)性狀密切相關(guān)。結(jié)合表型數(shù)據(jù)與分子數(shù)據(jù)，共計(jì)定位到果皮及果實(shí)相關(guān)性狀位點(diǎn)28個(gè)，并明確其在連鎖群上分布情況及位點(diǎn)遺傳效應(yīng)。在果實(shí)相關(guān)性狀定位中，與形狀相關(guān)位點(diǎn)共計(jì)14個(gè)，與產(chǎn)量相關(guān)位點(diǎn)共計(jì)9個(gè)，與可溶性固形物含量相關(guān)位點(diǎn)5個(gè)。

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Construction of genetic linkage map and QTL location for fruit-related

traits in melon/LUAN Feishi1,2,LU Bingyang1,2,ZHOU Huiwen1,2,WANG Xuezheng1,2(1.Ministry of Agriculture KeyLaboratory of Biology and Germplasm Enhancement of Horticultural Crops in Northeast China,Harbin 150030,China;2.School of Horticulture,Northeast Agricultural University, Harbin 150030,China)

The present study was to develop SNPs based on the resequencing data and bioinformatics methods of M4-5 and M1-15 and convert them into cleaved amplified polymorphic sequence (CAPS)markers.In this study,we developed 523 CAPS markers totally and 223 markers showed polymorphism between parents,the polymorphism rate was 43.8%.We markered F2generation using CAPS markers and constructed a genetic map.The map contained 195 markers and grouped on 12 linkage groups,spanning a total length of 1 702.55 cM,with an average of 8.78 cM between markers.A total of 28 locus for friut-related traits which contained 14 locus for fruit,nine locus for yield and five locus brix content with contribution rate ranged from 3.4974%to 17.9684%.

melon;fruit trait;genetic linkage;QTL

S652

A

1005-9369（2016）08-0009-12

2016-04-11

國(guó)家西甜瓜產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（CARS-026-02)

欒非時(shí)（1964-），女，教授，博士，研究方向?yàn)槲鞴咸鸸线z傳育種。E-mail:luanfeishi@sina.com