張艷紅+郭旭東+崔健斌+劉麗東

摘 要：在水溫（12±0.5）℃、鹽度27‰的環(huán)境下，研究了重金屬Hg2+對毛蚶的急性毒性效應(yīng)和肝臟組織結(jié)構(gòu)的影響。結(jié)果表明，Hg2+對毛蚶24、48、96 h LC50分別為9.23、5.43和2.07 mg/L；安全濃度分別為0.09、0.05和 0.02 mg/L。通過對Hg2+暴露在不同濃度96 h的毛蚶肝臟組織切片觀察發(fā)現(xiàn)，Hg2+對毛蚶的肝臟組織結(jié)構(gòu)有明顯影響，肝臟的損傷程度隨著Hg2+濃度的增加而加深，2.91 mg/L為毛蚶肝臟解毒的閾值。

關(guān)鍵詞：重金屬；毛蚶；急性毒性；肝臟

毛蚶（Scapharca subcrenata）屬軟體動物門，雙殼綱，列齒目，蚶科，是我國沿海地區(qū)一種重要的經(jīng)濟(jì)貝類，通常生活在含泥沙較多的潮間帶，在我國南北沿海均有分布，因其肉質(zhì)鮮美，營養(yǎng)價值高，深受國內(nèi)外消費者的歡迎。近幾年，我國沿海地區(qū)的經(jīng)濟(jì)發(fā)展速度較快，隨之而來的是大量工業(yè)廢水和生活污水排入海洋，給海洋生態(tài)環(huán)境帶來極大的負(fù)擔(dān)，在諸多污染物中，重金屬對海洋環(huán)境的影響尤為顯著[1]。重金屬隨沿岸徑流排入海中后，容易在沿海的底泥中沉積，而毛蚶為生活在泥沙中的底棲生物，又具有移動性差的特點，因而最易受到重金屬的影響；重金屬污染物可以在海洋生物體內(nèi)或其某一組織中積累，通過生物富集和放大，直接或間接威脅人類的健康[2]。在利用生物間的共生互補原理、運用生態(tài)學(xué)原理創(chuàng)建環(huán)境友好型養(yǎng)殖模式中，底棲貝類是一個重要的混養(yǎng)組合，通過貝類消耗掉其它養(yǎng)殖動物所排出的N，可以優(yōu)化養(yǎng)殖環(huán)境，同時增加養(yǎng)殖效益，例如海蜇、牙鲆和毛蚶的池塘立體生態(tài)混養(yǎng)。國內(nèi)外已進(jìn)行過許多有關(guān)重金屬對魚類及底棲貝類的急性毒性研究，但有關(guān)重金屬Hg2+對毛蚶的急性毒性效應(yīng)和肝臟組織結(jié)構(gòu)的影響尚未見報道。筆者研究了Hg2+對毛蚶成貝的急性毒性效應(yīng)，得出了24、48和96 h半致死濃度和安全質(zhì)量濃度；同時研究了暴露Hg2+不同濃度96 h的情況下，對毛蚶肝臟組織結(jié)構(gòu)的影響。本實驗可為毛蚶安全養(yǎng)殖和重金屬生態(tài)毒理學(xué)研究提供基礎(chǔ)性數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗對象為成體毛蚶，產(chǎn)地河北省黃驊市。毛蚶進(jìn)入實驗室后，暫養(yǎng)5 d，期間定期投喂單細(xì)胞藻類，連續(xù)充氣，每日換水一次，換水量100%，暫養(yǎng)水溫在（12±0.5）℃。暫養(yǎng)期間貝類日死亡率低于5%后進(jìn)行實驗，實驗前1 d停止投餌，選擇健康、反應(yīng)靈敏、個體均勻的毛蚶隨機(jī)分組進(jìn)行實驗，實驗貝類殼長2.96～3.77 cm，殼高2.39～2.82 cm，濕體質(zhì)量8.62～14.27 g。

HgCl2為貴州省銅仁化工研究所生產(chǎn)，含量99.5%，用雙蒸水分別配制成含有Hg2+質(zhì)量濃度為10 g/L母液，實驗時根據(jù)不同濃度進(jìn)行稀釋。試驗用水為人工配制海水，使用海水晶（天津市塘沽區(qū)海生海水晶廠出品）+雙蒸水配制而來，鹽度27‰，pH值8.30。

1.2 實驗方法

1.2.1 急性毒性預(yù)實驗 使用15 L水槽，加入4 L配制海水和適量藥物母液，混勻后，放入10只毛蚶，保持實驗水溫在（12±0.5）℃，自然光照，實驗期間不換水，不充氣，不投餌。每個預(yù)實驗濃度做一組平行試驗，同時設(shè)一個對照組，取實驗數(shù)據(jù)平均值。24 h、48 h和96 h后觀察死亡情況，以多次刺激無反應(yīng)、雙殼張開、外套膜萎縮為判斷其死亡的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行計數(shù)。通過預(yù)實驗查明重金屬離子不引起死亡的最大濃度（ILL）和最小100%致死濃度（LC100）。

1.2.2 急性毒性實驗 經(jīng)預(yù)實驗，Hg2+對毛蚶不引起死亡的ILL為0.53 mg/L，LC100為15.93 mg/L。在此Hg2+實驗濃度范圍內(nèi)，按照等比級數(shù)設(shè)定9個濃度組，每組設(shè)3個平行，1個對照，每個水槽內(nèi)隨機(jī)放入10只毛蚶，實驗條件與預(yù)實驗條件保持一致，24 h、48 h和96 h后觀察死亡情況并及時清除死亡個體。實驗重復(fù)一次，最終數(shù)據(jù)取平均值。

改進(jìn)寇氏法計算LC50及95%可信限。安全濃度為LC50×AF，其中AF為應(yīng)用系數(shù)，對于穩(wěn)定且又易于在生物體內(nèi)積累的污染物，其系數(shù)多選在0.01～0.05范圍內(nèi)。本實驗中重金屬離子屬于難分解、積累性強(qiáng)的物質(zhì)，AF值取0.01。

1.2.3 肝臟組織切片的制備與觀察 取暴露不同濃度Hg2+ 96 h的活體毛蚶，解剖，取肝臟組織，用Bouin氏液固定、經(jīng)自來水沖洗、梯度酒精脫水、透明、透蠟和石蠟包埋等步驟；后進(jìn)行切片，切片厚度5 μm；采用蘇木精-伊紅染色法（ H. E）染色，BK5000顯微鏡觀察并拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 結(jié)果

2.1.1 中毒癥狀 不同實驗濃度下毛蚶的中毒反應(yīng)有所不同。實驗開始24 h內(nèi)，低濃度組的毛蚶大部分都伸出了斧足和水管，而高濃度組中的毛蚶雙殼緊閉，其中高于10.42 mg/L濃度組的部分個體黏液分泌明顯，最高濃度組的個體在24 h全部死亡；24～48 h內(nèi)，0.81 mg/L濃度組中的毛蚶有少數(shù)伸出斧足，0.53 mg/L濃度組的個體則幾乎全部伸出斧足，高濃度組則雙殼緊閉，刺激無反應(yīng)，水中漂浮大量粘絲，拿起毛蚶，可見大量粘液掛在殼面上；48～96 h內(nèi)，受試毛蚶的中毒現(xiàn)象越來越嚴(yán)重，出現(xiàn)外套膜脫落現(xiàn)象，高濃度組的死亡率接近100%，但0.53 mg/L濃度組的個體則仍有部分個體伸出斧足，但相比對照組中的毛蚶所伸出的斧足相對要小?？傮w上，Hg2+濃度越高，毛蚶所排黏液就越多。中毒死亡的個體少部分雙殼張開，大部分雙殼緊閉，但幾乎均是外套膜、水管脫落。

2.1.2 急性毒性實驗結(jié)果 Hg2+對毛蚶的急性毒性實驗具體結(jié)果見表1，Hg2+對毛蚶的半致死濃度、安全濃度及95%可信限見表2。

2.1.3 Hg2+對毛蚶肝臟組織結(jié)構(gòu)的影響 當(dāng)Hg2+0.53 mg/L暴露96 h時，肝臟組織只有輕微損傷，表現(xiàn)為胃粘膜層的柱狀細(xì)胞有增生現(xiàn)象但不明顯，肝小管有空泡化現(xiàn)象；Hg2+0.81 mg/L暴露96 h，毛蚶的胃粘膜層的柱狀細(xì)胞有輕微增生現(xiàn)象，肝小管有空泡化現(xiàn)象；Hg2+1.24 mg/L暴露96 h，毛蚶的胃粘膜層的柱狀細(xì)胞有輕微增生現(xiàn)象，肝小管上皮細(xì)胞腫脹、細(xì)胞界限模糊，有空泡化現(xiàn)象；Hg2+1.90 mg/L暴露96 h，毛蚶的胃粘膜層的柱狀細(xì)胞有輕微增生現(xiàn)象，肝小管上皮細(xì)胞腫脹，同時部分肝小管有壞死現(xiàn)象；Hg2+2.91 mg/L暴露96 h，毛蚶的肝小管上皮細(xì)胞略微腫脹，同時部分肝小管有廣泛壞死現(xiàn)象；Hg2+4.45 mg/L暴露96 h，毛蚶的肝小管上皮細(xì)胞界限模糊，出現(xiàn)了廣泛壞死現(xiàn)象，血細(xì)胞浸潤；Hg2+6.81 mg/L暴露96 h，毛蚶的胃變化并不明顯，肝小管上皮細(xì)胞界限模糊，細(xì)胞明顯萎縮，廣泛壞死，出現(xiàn)了大面積空白區(qū)。

2.2 分析

2.2.1 重金屬Hg2+對毛蚶的急性毒性效應(yīng)及毒性機(jī)理 本實驗在水溫（12±0.5）℃、鹽度27‰的環(huán)境下，研究了重金屬Hg2+對毛蚶的急性毒性效應(yīng)。結(jié)果表明，Hg2+對毛蚶24、48、96 h LC50分別為9.23、5.43和2.07 mg/L；安全濃度分別為0.09、0.05和 0.02 mg/L。閻波等[3]研究了Cd2+對毛蚶的急性毒性，96 h LC50為6.20 mg/L，他們所用毛蚶的個體略小于本次實驗，另外報道中沒有標(biāo)明實驗水溫，但在室內(nèi)實驗，應(yīng)該實驗水溫高于（12±0.5）℃；因此，這與重金屬毒性的眾多研究報道趨勢（Hg2+>Cd2+）是一致的。王曉宇等[4]研究了Hg2+對四角蛤蜊的急性毒性，96 h LC50為0.207 mg/L，遠(yuǎn)低于本次實驗值，但他們的實驗水溫為（15±2）℃，而本實驗水溫為（12±0.5）℃，而多數(shù)重金屬的毒性與水溫呈正相關(guān)；隋國斌等[5]研究了Hg2+對皺紋盤鮑的急性毒性，96 h LC50為0.123 mg/L，也遠(yuǎn)低于本次實驗值，但其實驗水溫為（15±1）℃，另外，實驗所用皺紋盤鮑的體質(zhì)量只有本實驗所用毛蚶的5%左右。

實驗開始后，低濃度組的毛蚶除最初受到人為刺激緊閉雙殼外，2 h后大部分個體都伸出了斧足和水管；而高濃度組中的毛蚶則始終雙殼緊閉，說明其受到Hg2+刺激后以閉殼的方式進(jìn)行避毒。目前，汞對水生生物的毒害機(jī)理還未真正研究清楚，汞的毒理研究較多地集中在對水生生物（主要是魚類和貝類）的致死濃度和體內(nèi)汞積累量等方面。但汞可誘導(dǎo)活性氧自由基的形成并改變細(xì)胞的抗氧化能力，對水生生物構(gòu)成脅迫作用，使多種酶類及活性因子失去活性，從而破壞生物體的酶系統(tǒng)，阻斷其各種生化反應(yīng)和新陳代謝活動，導(dǎo)致生物體死亡。

2.2.2 Hg2+對毛蚶肝臟組織結(jié)構(gòu)的影響 雙殼貝類分布廣、遷移性差、能高度富集水中污染物，因而是生物監(jiān)測和毒理學(xué)最常被研究的群體之一。肝臟是毛蚶的主要解毒和代謝功能器官，是重金屬Hg2+進(jìn)入其體內(nèi)的主要富集部位，當(dāng)Hg2+進(jìn)入體內(nèi)后會誘導(dǎo)活性氧自由基的形成并改變細(xì)胞的抗氧化能力，一旦超過肝臟的解毒能力，就會對肝臟的組織結(jié)構(gòu)產(chǎn)生不同程度的影響，其組織病理學(xué)評價可用于鑒定Hg2+的污染程度。

本研究發(fā)現(xiàn)，Hg2+對毛蚶肝臟組織結(jié)構(gòu)的影響有明顯的濃度依賴性，Hg2+濃度越高，對肝臟的損傷就越明顯。當(dāng)暴露Hg2+0.53 mg/L時，肝臟組織只有輕微損傷，表現(xiàn)為胃粘膜層的柱狀細(xì)胞有增生現(xiàn)象，但不明顯；肝小管有空泡化現(xiàn)象；但暴露Hg2+2.91 mg/L時，肝臟組織損傷明顯，表現(xiàn)為肝小管上皮細(xì)胞腫脹，同時部分肝小管有廣泛壞死；而暴露Hg2+4.45 mg/L時，肝小管上皮細(xì)胞界限模糊，出現(xiàn)了廣泛壞死和血細(xì)胞浸潤現(xiàn)象；暴露Hg2+6.81 mg/L時，肝臟組織大范圍壞死后已經(jīng)完全失去消化腺的結(jié)構(gòu)，只有部分肝小管留有輪廓，此時毛蚶的肝臟已完全失去其生理功能。高于6.81 mg/L濃度組的毛蚶在96 h前已全部死亡，因此沒有取樣切片。從實驗結(jié)果可以看出，Hg2+2.91 mg/L濃度暴露96 h時達(dá)到了毛蚶肝臟解毒的閾值，高于此濃度會導(dǎo)致肝臟逐漸失去其代謝、解毒生理功能。

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[4] 王曉宇，王清，楊紅生.鎘和汞兩種重金屬離子對四角蛤蜊的急性毒性[J].海洋科學(xué)，2009，33（12）：24-29

[5] 隋國斌，楊鳳，孫丕海，等. 鉛、鎘、汞對皺紋盤鮑幼鮑的急性毒性試驗[J].大連水產(chǎn)學(xué)院學(xué)報，1999，14（1）：22-26

（收稿日期：2016-04-21）