蘭　蕊，龔小保，黃利掛，陳　竹，曾　雪，張保順#

（1.西南大學(xué)藥學(xué)院，重慶　400715；2.重慶醫(yī)藥高等專科學(xué)校藥學(xué)系，重慶　400030）

熒光光譜法測(cè)定3種黃酮類(lèi)化合物與人血清白蛋白相互作用的機(jī)制研究Δ

蘭蕊1＊，龔小保1，黃利掛1，陳竹2，曾雪2，張保順1#

（1.西南大學(xué)藥學(xué)院，重慶400715；2.重慶醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校藥學(xué)系，重慶400030）

目的：研究黃酮類(lèi)化合物與人血清白蛋白（HSA）相互作用的機(jī)制，比較化合物B環(huán)不同取代基（羥基、甲氧基）對(duì)大分子物質(zhì)結(jié)合的影響。方法：采用熒光光譜法對(duì)槲皮素、橙皮素、甲基橙皮素3種B環(huán)取代基不同的黃酮類(lèi)化合物與HSA相互作用的規(guī)律進(jìn)行研究，測(cè)定并分析3種黃酮類(lèi)化合物與HSA發(fā)生熒光猝滅的類(lèi)型，計(jì)算相應(yīng)的結(jié)合常數(shù)、結(jié)合位點(diǎn)及熱力學(xué)參數(shù)等。結(jié)果：隨著溫度的升高，猝滅常數(shù)（Ksv）均呈規(guī)律性下降，結(jié)合常數(shù)（KA）相應(yīng)降低，結(jié)合位點(diǎn)數(shù)（n）近似等于1，熱力學(xué)參數(shù)ΔH＜0、ΔS＞0，B環(huán)的取代基不同對(duì)大分子物質(zhì)結(jié)合有影響。結(jié)論：3種黃酮類(lèi)化合物與HSA相互作用發(fā)生熒光猝滅的機(jī)制屬于靜態(tài)猝滅；結(jié)合位點(diǎn)數(shù)為1；3種化合物與HSA之間的作用力以靜電力為主；羥基可能為黃酮類(lèi)化合物與大分子物質(zhì)相互作用的主要活性基團(tuán)，甲氧基與HSA的結(jié)合力小于羥基。

黃酮；熒光猝滅；人血清白蛋白；機(jī)制

人血清白蛋白（HSA）是人體血液循環(huán)中最為豐富的蛋白質(zhì)，約占血漿總蛋白含量的60%，是藥物運(yùn)輸?shù)闹匾d體［1-2］。近年來(lái)，生物大分子與藥物之間的結(jié)合作用成為研究熱點(diǎn)。人體血液中每個(gè)配體與血漿蛋白結(jié)合的過(guò)程，對(duì)藥動(dòng)學(xué)和藥效學(xué)均可產(chǎn)生一定的影響，如減輕藥物毒性、延長(zhǎng)半衰期等。因此，研究血清白蛋白與藥物間的作用關(guān)系，探討不同基團(tuán)對(duì)兩者相互作用的影響［3］，能更好地了解藥物在體內(nèi)的吸收和分布。

自然界存在的黃酮類(lèi)化合物具有重要藥理活性，其廣泛分布于植物的根、莖、葉和果實(shí)中［4］。目前關(guān)于黃酮或類(lèi)黃酮類(lèi)化合物與HSA發(fā)生熒光猝滅的機(jī)制研究，以及金屬離子對(duì)藥物與蛋白質(zhì)親和力的影響有較多報(bào)道，如徐倩等［5］采用熒光法和分子對(duì)接的方法研究黃酮類(lèi)相互作用機(jī)制；蘭玲等［6］利用熒光光譜法，發(fā)現(xiàn)大豆素和葛根素與HSA相互作用均發(fā)生熒光猝滅，且為靜態(tài)猝滅過(guò)程，葛根素與HSA結(jié)合力強(qiáng)于大黃素。而針對(duì)多羥基黃酮類(lèi)化合物中B環(huán)上的不同基團(tuán)與HSA作用后所引起熒光猝滅的差異卻少有報(bào)道。本研究通過(guò)熒光光譜法，在模擬人體pH條件下（pH 7.4），定性地研究槲皮素、橙皮素和甲基橙皮素3種黃酮類(lèi)化合物對(duì)HSA的熒光猝滅反應(yīng)，根據(jù)3種化合物B環(huán)上3′、4′位取代基的不同，初步探究含羥基（-OH）的槲皮素、含1個(gè)甲氧基（-OCH3）的橙皮素、含2個(gè)-OCH3的甲基橙皮素與HSA相互作用的影響。通過(guò)計(jì)算判斷其猝滅類(lèi)型、結(jié)合常數(shù)以及結(jié)合位點(diǎn)，從而更好地了解藥物與HSA分子間的相互作用機(jī)制。槲皮素、橙皮素、甲基橙皮素分子結(jié)構(gòu)詳見(jiàn)圖1。

圖1　槲皮素、橙皮素、甲基橙皮素分子結(jié)構(gòu)Fig 1　Molecular structure of quercetin，hesperetin and methyl hesperetin

1　材料

1.1儀器

F-4500熒光分光光度計(jì)（日本日立公司）；AL-104電子分析天平（美國(guó)梅特勒-托利多儀器有限公司）；HH-1恒溫水浴鍋（金壇市萬(wàn)華實(shí)驗(yàn)儀器廠）；FE28-Standard FiveEasy Plus型臺(tái)式pH計(jì)（美國(guó)梅特勒-托利多儀器有限公司）；UV-3150型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（日本Jasco公司）。

1.2藥品與試劑

HSA（同路生物制藥有限公司，批號(hào)：20130946，純度：＞99%）；槲皮素、橙皮素、甲基橙皮素（均為實(shí)驗(yàn)室自制，純度：＞99%）；三羥甲基氨基甲烷（Tris，分析純，北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司，批號(hào)：BT350-500G）；鹽酸（HCl，分析純，重慶川東化工有限公司）；氯化鈉（NaCl，分析純，成都市科龍化工試劑）；水為二次蒸餾水。

2　方法

2.1溶液的配制

2.1.1HSA溶液的配制量取適量HSA溶解于pH為7.4的Tris-HCl緩沖液（0.1 mol/L，含NaCl 0.1 mol/L以維持離子強(qiáng)度），混勻并定容，制成濃度為1.0×10-4mol/L的HSA溶液，低溫保存，備用。

2.1.2黃酮類(lèi)化合物溶液的配制稱取槲皮素、橙皮素、甲基橙皮素適量，分別溶解于pH為7.4的Tris-HCl緩沖液（0.1 mol/ L，含NaCl 0.1 mol/L以維持離子強(qiáng)度），混勻并定容，制成濃度均為1.0×10-4mol/L的槲皮素、橙皮素、甲基橙皮素溶液，低溫保存，備用。

2.2熒光發(fā)射光譜的測(cè)定

吸取“2.1.1”項(xiàng)下HSA溶液1 ml于10 ml量瓶中，分別加入0、1、2、4、6、8 ml槲皮素、橙皮素、甲基橙皮素溶液，用Tris-HCl緩沖液定容，分別于25、31、37℃下恒溫水浴30 min，以280 nm波長(zhǎng)為激發(fā)波長(zhǎng)，340 nm波長(zhǎng)為發(fā)射波長(zhǎng)，激發(fā)狹縫和發(fā)射狹縫的寬度設(shè)為5 nm，在290～500 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)測(cè)定樣品的熒光發(fā)射光譜。分別記錄25、31、37℃溫度下的熒光強(qiáng)度（F），用于判斷并比較3種黃酮類(lèi)化合物與HSA發(fā)生熒光猝滅的類(lèi)型，計(jì)算相應(yīng)的結(jié)合常數(shù)、結(jié)合位點(diǎn)及熱力學(xué)參數(shù)等。

3　結(jié)果與討論

3.1槲皮素、橙皮素和甲基橙皮素對(duì)HSA熒光光譜的影響

按照“2.2”項(xiàng)下方法分別測(cè)定25、31、37℃下槲皮素、橙皮素和甲基橙皮素的熒光猝滅圖譜，結(jié)果，3個(gè)溫度下圖譜相差不大，故選擇便于操作的接近室溫的25℃為恒溫水浴溫度，之后，測(cè)定不同濃度的槲皮素、橙皮素和甲基橙皮素在25℃溫度條件下對(duì)HSA的熒光猝滅光譜，結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可知，隨著3種化合物濃度的增加，其相應(yīng)的HSA熒光圖譜中的特征峰均表現(xiàn)出降低趨勢(shì)，說(shuō)明HSA與3種化合物均發(fā)生相互作用導(dǎo)致規(guī)律性的熒光猝滅。其相應(yīng)特征峰降低趨勢(shì)存在一定差異：隨著槲皮素濃度增大，熒光物質(zhì)的熒光強(qiáng)度降低最顯著；橙皮素次之；甲基橙皮素與HSA發(fā)生熒光猝滅后，其熒光物質(zhì)的熒光強(qiáng)度降低趨勢(shì)最小。由此推斷，黃酮類(lèi)化合物B環(huán)上3′、4′基團(tuán)的不同可影響藥物與蛋白質(zhì)的結(jié)合（圖中a→f代表黃酮類(lèi)化合物的濃度依次為0、1×10-5、2×10-5、4×10-5、6×10-5、8×10-5mol/L）。

圖23　種黃酮類(lèi)化合物與HSA的熒光猝滅圖譜A.槲皮素；B.橙皮素；C.甲基橙皮素Fig 2　The fluorescence quenching spectra of HSA by three kinds of flavonoidsA.quercetin；B.hesperetin；C.methyl hesperetin

3.2熒光猝滅類(lèi)型

蛋白質(zhì)等生物大分子熒光猝滅根據(jù)其機(jī)制不同可分為動(dòng)態(tài)猝滅、靜態(tài)猝滅和非輻射能量轉(zhuǎn)移［7］。陳科力等［8］曾報(bào)道藥物對(duì)大分子物質(zhì)HSA的熒光猝滅機(jī)制主要分為激發(fā)態(tài)反應(yīng)、能量轉(zhuǎn)移、形成復(fù)合物以及碰撞導(dǎo)致的熒光猝滅。動(dòng)態(tài)猝滅過(guò)程與擴(kuò)散有關(guān)，在一定范圍內(nèi)，隨著溫度升高，擴(kuò)散系數(shù)隨之增大，從而使雙分子猝滅常數(shù)Kq增大；靜態(tài)猝滅則反之，溫度升高將降低化合物-大分子物質(zhì)形成的復(fù)合物穩(wěn)定性，從而減小猝滅的程度。動(dòng)態(tài)猝滅一般遵循Stern-Volmer方程［9］。

式（1）中，F(xiàn)0為無(wú)猝滅劑時(shí)熒光物質(zhì)的熒光強(qiáng)度，F(xiàn)為加入猝滅劑時(shí)熒光物質(zhì)的熒光強(qiáng)度，Ksv為動(dòng)態(tài)猝滅常數(shù)（稱為Stern-Volmer猝滅常數(shù)），［Q］為猝滅劑的濃度，Kq為由擴(kuò)散過(guò)程控制的雙分子動(dòng)態(tài)猝滅速率常數(shù)，τ0為無(wú)猝滅劑時(shí)生物大分子的平均熒光壽命（約為10-8s［10］）。

以［Q］為橫坐標(biāo)，以F0/F為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，可以得到Stern-Volmer曲線，斜率即為動(dòng)態(tài)猝滅常數(shù)Ksv，詳見(jiàn)圖3。槲皮素、橙皮素和甲基橙皮素的Ksv和Kq見(jiàn)表1。理論上，猝滅劑對(duì)大分子物質(zhì)的最大碰撞猝滅常數(shù)為2.00×1010L/（mol·s）。若化合物與HSA熒光猝滅屬于動(dòng)態(tài)猝滅類(lèi)型，則應(yīng)當(dāng)符合Stern-Volmer方程，即Ksv隨著溫度升高而增大，而靜態(tài)猝滅常數(shù)則減小，可由此判斷熒光猝滅類(lèi)型［11］。由圖3可知，隨著溫度的升高，Ksv值均減小，且Kq遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出擴(kuò)散碰撞過(guò)程中的最大碰撞猝滅常數(shù)約3個(gè)數(shù)量級(jí)，說(shuō)明上述3種化合物與HSA發(fā)生熒光猝滅均不符合動(dòng)態(tài)猝滅規(guī)律，可能是化合物與HSA形成新復(fù)合物而發(fā)生的靜態(tài)猝滅。

圖3　不同溫度下3種黃酮類(lèi)化合物對(duì)HSA熒光猝滅的Stern-Volmer曲線A.槲皮素；B.橙皮素；C.甲基橙皮素Fig 3　Stern-Volmer curves of three kinds of flavonoids on HSAunder different temperaturesA.quercetin；B.hesperetin；C.methyl hesperetin

表1　不同溫度下槲皮素、橙皮素、甲基橙皮素與HSA的猝滅常數(shù)Tab 1　Interaction constants of quercetin，hesperetin，methyl hesperetin to HSAunder different temperatures

3.3結(jié)合常數(shù)（KA）及結(jié)合位點(diǎn)數(shù)（n）的測(cè)定

靜態(tài)猝滅中熒光體系的熒光強(qiáng)度（F）、KA、n及猝滅劑的濃度［Q］之間的關(guān)系可以用式（2）表示。

以lg（c［Q］）為橫坐標(biāo)，以lg［（F0-F）/F］為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，結(jié)果見(jiàn)圖4。不同溫度下槲皮素、橙皮素和甲基橙皮素與HSA結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)見(jiàn)表2。由表2可知，槲皮素、橙皮素和甲基橙皮素與HSA結(jié)合位點(diǎn)數(shù)均接近1，進(jìn)一步證明了上述3種化合物對(duì)HSA的猝滅方式為靜態(tài)猝滅；隨著溫度的升高，其結(jié)合常數(shù)KA相應(yīng)地降低，說(shuō)明溫度對(duì)上述化合物與HSA形成的新復(fù)合物的穩(wěn)定性有一定影響；同一溫度下，3種化合物與HSA的結(jié)合常數(shù)KA存在一定差異，KA由大到小依次為：槲皮素＞橙皮素＞甲基橙皮素，說(shuō)明B環(huán)上3′、4′位取代基對(duì)化合物與HSA結(jié)合有一定影響。隨著B(niǎo)環(huán)3′、4′位羥基數(shù)目減少、甲氧基數(shù)目增加，結(jié)合力相應(yīng)減弱，說(shuō)明羥基可能是與大分子物質(zhì)結(jié)合的活性基團(tuán)，而甲氧基與蛋白質(zhì)結(jié)合力小于羥

圖4　不同溫度下3種黃酮類(lèi)化合物對(duì)HSA熒光猝滅的雙對(duì)數(shù)曲線A.槲皮素；B.橙皮素；C.甲基橙皮素Fig 4　Double-log plots of three kinds of flavonoids quenching on HSAunder different temperaturesA.querceti；B.hesperetin；C.methyl hesperetin

表2　不同溫度下槲皮素、橙皮素、甲基橙皮素與HSA的結(jié)合常數(shù)及結(jié)合位點(diǎn)數(shù)Tab 2　The binding constant and binding sites of quercetin，hesperetin，methyl hesperetin with HSA under different temperatures

3.43種化合物與HSA結(jié)合的作用力及熱力學(xué)參數(shù)

生物大分子與小分子之間的作用力包括范德華力、靜電力、疏水相互作用力等。當(dāng)溫度變化不大時(shí)，反應(yīng)焓變（ΔH）可認(rèn)為是一個(gè)常數(shù)。根據(jù)反應(yīng)前后的熱力學(xué)參數(shù)焓變（ΔH）和熵變（ΔS）的相對(duì)大小，可以確定分子間的相互作用力類(lèi)型［12］：當(dāng)ΔH＜0、ΔS＜0時(shí)，分子間作用力為氫鍵和范德華力；當(dāng)ΔH＜0、ΔS＞0時(shí)，分子間作用力為靜電引力；ΔH＞0、ΔS＞0時(shí)，分子間作用力為疏水作用力［13］。熱力學(xué)公式如式（3）、式（4）。

利用式（3）分別計(jì)算出不同溫度（T）下3種化合物對(duì)HSA作用的焓變?chǔ)和熵變?chǔ)（式中K為KA，下同）。由式（4）計(jì)算吉布斯自由能ΔG，結(jié)果見(jiàn)表3。根據(jù)Ross PD等［14］總結(jié)出的判斷生物大分子與小分子結(jié)合力性質(zhì)和生物大分子自身結(jié)合力性質(zhì)的熱力學(xué)規(guī)律，推斷出3種化合物與HSA之間的作用力均以靜電力為主，但各自又存在一定差異，吉布斯自由能ΔG由大到小依次為甲基橙皮素＞橙皮素＞槲皮素；ΔH均小于0，說(shuō)明反應(yīng)是一個(gè)放熱過(guò)程。

表3　槲皮素、橙皮素、甲基橙皮素與HSA作用的熱力學(xué)參數(shù)Tab 3　Thermodynamic parameters of the interaction of quercetin，hesperetin，methyl hesperetin with HSA

4　結(jié)論

通過(guò)熒光光譜試驗(yàn)結(jié)果得知，槲皮素、橙皮素、甲基橙皮素與HSA的熒光猝滅類(lèi)型屬于靜態(tài)猝滅，結(jié)合位點(diǎn)數(shù)均為1，即藥物分子與生物大分子形成1∶1的復(fù)合物；通過(guò)對(duì)3種化合物的熱力學(xué)參數(shù)計(jì)算可知，ΔG＜0，反應(yīng)可自發(fā)進(jìn)行，其與HSA相互作用類(lèi)型以靜電力為主。3種化合物B環(huán)上3′、4′位取代基對(duì)化合物與HSA結(jié)合力有一定影響，即同一溫度下，隨濃度升高，3種化合物各自對(duì)應(yīng)的熒光圖譜的特征峰降低趨勢(shì)有明顯差異：槲皮素F值降低最顯著，橙皮素次之，甲基橙皮素F值降低趨勢(shì)較小。同一溫度時(shí)對(duì)應(yīng)的Ksv由大到小依次為槲皮素＞橙皮素＞甲基橙皮素，其結(jié)合常數(shù)KA大小由大到小依次為槲皮素＞橙皮素＞甲基橙皮素；溫度一定時(shí)，吉布斯自由能ΔG由大到小依次為甲基橙皮素＞橙皮素＞槲皮素。以上均說(shuō)明羥基可能是與大分子物質(zhì)結(jié)合的主要基團(tuán)，而甲氧基與生物大分子結(jié)合能力比羥基弱，羥基的數(shù)目影響黃酮類(lèi)化學(xué)物與人血清白蛋白相互作用的結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)。馬康等［15］報(bào)道，3種黃酮類(lèi)化合物（高良姜素、山萘酚、槲皮素）隨B環(huán)上羥基數(shù)目增加，與牛血清蛋白（BSA）結(jié)合能力增強(qiáng)。本試驗(yàn)針對(duì)黃酮類(lèi)化合物B環(huán)3′、4′位的基團(tuán)不同，比較其與HSA結(jié)合的差異，進(jìn)一步驗(yàn)證了羥基可能是與大分子物質(zhì)結(jié)合的活性基團(tuán)，同時(shí)推測(cè)甲氧基與大分子物質(zhì)結(jié)合的能力弱于羥基，但是關(guān)于結(jié)合力強(qiáng)弱的原因有待進(jìn)一步探討。因此，可利用羥基比甲氧基結(jié)合能力強(qiáng)這一特點(diǎn)，為后續(xù)藥物與大分子物質(zhì)結(jié)合以及藥物分子活性基團(tuán)的修飾改性提供理論依據(jù)。

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（編輯：劉明偉）

Study on Interaction Mechanism between 3 Kinds of Flavonoids Compounds and Human Serum Albumin by Fluorescence Spectrometry

LAN Rui1，GONG Xiaobao1，HUANG Ligua1，CHEN Zhu2，ZENG Xue2，ZHANG Baoshun1
（1.School of Pharmacy，Southwest University，Chongqing 400715，China；2.Dept.of Pharmacy，Chongqing Medical and Pharmaceutical College，Chongqing 400030，China）

OBJECTIVE：To study the interaction mechanism between flavonoids and human serum albumin（HSA），and to compare the effects of different B-ring substitutions（hydroxyl，methoxyl group）of flavonoids on macromolecular receptor.METHODS：The interaction regularity between three flavonoids with different B-ring substitutions（quercetin，hesperetin，methyl hesperetin）and HSA was studied with fluorescence spectroscopy，the fluorescence quenching types between 3 flavonoids and HSA were determined and analyzed，and the velated binding constant，binding site and thermodynamic parameters were calculated.RESULTS：The quenching constants（Ksv）and binding constants（KA）were decreased with the increase of temperatures.The number of binding site（n）was approximately equal to one，and the thermodynamic parameters ΔH＜0，ΔS＞0，the binding interaction of these compounds with macromolecules was influenced because of the difference of the B-ring substituents.CONCLUSIONS：The quenching mechanism between three flavonoids and HSA was static quenching；the number of binding site was one；the interaction force of the three compounds with HSA was mainly static electricity，and hydroxyl group in the B-ring was likely the major active group and exerted stronger binding force than methoxyl group to connect with macromolecules.

Flavonoids；Fluorescence quenching；Human serum albumin；Mechanism

O0657.32

A

1001-0408（2016）22-3054-04

10.6039/j.issn.1001-0408.2016.22.10

重慶市基礎(chǔ)與前沿研究計(jì)劃項(xiàng)目（No.cstc2013jcyjA10070，cstc2014jcyjA10125）；西南大學(xué)基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金項(xiàng)目（No.XDJK2013B040）；重慶市教委科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目（No. KJ132501）；重慶市衛(wèi)生局醫(yī)學(xué)科研項(xiàng)目（No.2011-1-114）

＊本科生。研究方向：藥學(xué)專業(yè)。E-mail：424070743@qq.com

副教授，碩士生導(dǎo)師，博士。研究方向：天然活性物質(zhì)的提取分離、結(jié)構(gòu)修飾及藥理活性研究。電話：023-68251225。E-mail：zbs360@swu.edu.cn

2016-05-06

2016-06-27）