王洛臨，吳小斌，周　蓉，張建軍，袁柳萍

（1.廣東省中醫(yī)藥工程技術(shù)研究院/廣東省中醫(yī)藥研究開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州　510095；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)附屬?gòu)V東省第二中醫(yī)院，廣州　510405；3.麗珠集團(tuán)利民制藥廠，廣東韶關(guān)　512000）

復(fù)方芪麻膠囊的提取工藝研究

王洛臨1＊，吳小斌2，周蓉3，張建軍1，袁柳萍2

（1.廣東省中醫(yī)藥工程技術(shù)研究院/廣東省中醫(yī)藥研究開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州510095；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)附屬?gòu)V東省第二中醫(yī)院，廣州510405；3.麗珠集團(tuán)利民制藥廠，廣東韶關(guān)512000）

目的：優(yōu)化復(fù)方芪麻膠囊的提取工藝。方法：采用藥效實(shí)驗(yàn)法，以大鼠血壓降低值為指標(biāo)，篩選樣品制備工藝（A工藝為藥材全煎；B工藝為天麻細(xì)粉與其余煎煮后藥材混合）；采用單因素和正交試驗(yàn)法，以黃芪甲苷含量、毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量和固形物質(zhì)量為指標(biāo)，以加水倍數(shù)、煎煮時(shí)間、煎煮次數(shù)為因素優(yōu)化提取工藝并進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。結(jié)果：藥效實(shí)驗(yàn)表明B工藝樣品降壓作用更優(yōu)；該工藝中其余藥材的最優(yōu)提取工藝為藥材每次加12倍量水煎煮1.5 h，共煎煮3次；驗(yàn)證試驗(yàn)顯示黃芪甲苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷的平均提取率分別為64.02%、51.97%，平均固形物質(zhì)量為5.69 g（RSD≤1.92%，n=3）。結(jié)論：優(yōu)化的提取工藝穩(wěn)定、可行。

復(fù)方芪麻膠囊；降壓作用；提取工藝；黃芪甲苷；毛蕊異黃酮葡萄糖苷；正交試驗(yàn)

高血壓是最常見(jiàn)的慢性病，也是心腦血管病最主要的危險(xiǎn)因素，其腦卒中、心力衰竭及慢性腎臟病等主要并發(fā)癥不僅致殘、致死率高，而且嚴(yán)重消耗醫(yī)療和社會(huì)資源。中醫(yī)將高血壓病歸結(jié)為“脈脹”“眩暈”“肝風(fēng)”“風(fēng)?！钡炔“Y，以氣虛痰濁型為主。復(fù)方芪麻膠囊由黃芪、天麻、橘紅等藥材組成，具有健脾益氣、化痰通絡(luò)、理氣散結(jié)的功效，臨床上用于治療氣虛痰濁型高血壓所致的眩暈、頭痛、苔白膩、脈滑等癥［1-3］。為保證制成制劑后的臨床療效，筆者先對(duì)制劑工藝路線進(jìn)行優(yōu)選，再對(duì)優(yōu)選出的提取工藝的條件進(jìn)行優(yōu)化。

1　材料

1.1儀器

1200高效液相色譜（HPLC）儀（美國(guó)Agilent公司）；Alltech 3300蒸發(fā)光散射檢測(cè)器（德國(guó)Sincere公司）；JJ3000動(dòng)物電子秤（美國(guó)G&G公司）；BS224S電子天平（德國(guó)Sartorius公司，萬(wàn)分之一）；BP-100A全自動(dòng)大鼠無(wú)創(chuàng)血壓測(cè)量系統(tǒng)（成都泰盟軟件有限公司）；PowerLab 8/30多導(dǎo)生理記錄儀（澳大利亞AD Instrument公司）。

1.2藥材、藥品與試劑

黃芪（批號(hào)：140101）、天麻（批號(hào)：140901）、法半夏（批號(hào)：141201）、澤瀉（批號(hào)：141101）均購(gòu)自廣州集和藥品有限公司，經(jīng)廣東省第二中醫(yī)院劉法錦研究員鑒定，均符合現(xiàn)行藥典各藥材項(xiàng)下的規(guī)定，其中黃芪中黃芪甲苷和毛蕊異黃酮葡萄糖苷的含量分別為0.045%（g/g）和0.022%（g/g）；黃芪甲苷對(duì)照品（批號(hào)：110781-200613，純度：95.8%）、毛蕊異黃酮葡萄糖苷對(duì)照品（批號(hào)：11920-201203，純度：97.3%）均來(lái)源于中國(guó)食品藥品檢定研究院；水合氯醛溶液（成都市科龍化學(xué)試劑廠，批號(hào)：20120611，規(guī)格：500 ml/瓶）；依托咪酯（瑞士Adamasbeta公司，批號(hào)：P00459，純度：98.2%）；厄貝沙坦片（杭州賽諾菲民生制藥有限公司，批號(hào)：0901174，規(guī)格：0.15 g/片）；乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純。

1.3動(dòng)物

SPF級(jí)SD大鼠70只，♀♂各半，體質(zhì)量約300 g，鼠齡3個(gè)月，購(gòu)自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)：No.4407207906。

2　方法與結(jié)果

2.1制備工藝的確定

本處方中黃芪和天麻均為君藥，根據(jù)處方中藥味所含已知成分及相關(guān)藥理作用，以及天麻的習(xí)慣用法，采用降壓藥效模型進(jìn)行制備工藝的篩選。

2.1.1樣品的制備 （1）樣品A的制備（工藝A）：全方藥材煎煮2次，每次加10倍水，煎煮1.5 h，濾過(guò)，合并濾液，減壓濃縮成稠膏，真空干燥，制成1 g干浸膏，相當(dāng)于2.775 g生藥。（2）樣品B的制備（工藝B）：方中天麻粉碎成細(xì)粉；黃芪等其余藥材煎煮2次，每次加10倍水，煎煮1.5 h，濾過(guò)，合并濾液，減壓濃縮成稠膏，真空干燥；加入天麻細(xì)粉，混勻，制成1 g混合物，相當(dāng)于6.989 g生藥。

2.1.2藥效對(duì)比實(shí)驗(yàn)取大鼠70只，♀♂各半，隨機(jī)留取10只大鼠作為正常對(duì)照組，其余60只大鼠作為模型組。用10%水合氯醛（0.4 ml/100 g）腹腔注射麻醉模型組大鼠后，將大鼠仰臥固定于手術(shù)臺(tái)上，剪去其腹部體毛，用5%碘伏消毒、75%乙醇脫碘，蓋上孔巾。沿腹正中線作手術(shù)切口打開腹腔，按無(wú)菌操作，小心鈍性分離出左腎動(dòng)脈后，穿入無(wú)菌絲線，將直徑為0.25 mm的針灸針與腎動(dòng)脈血管長(zhǎng)軸緊貼、平行放置，用無(wú)菌絲線扎緊腎動(dòng)脈和針灸針后抽出針灸針，造成大鼠單側(cè)腎動(dòng)脈狹窄，而且不觸及側(cè)腎臟和動(dòng)脈［4］。正常對(duì)照組大鼠除不結(jié)扎腎動(dòng)脈外，其余手術(shù)操作均同上。術(shù)后3 d內(nèi)腹腔注射青霉素3×104u/d預(yù)防感染。造模4周后模型組大鼠再均分為6組，分別為厄貝沙坦組（陽(yáng)性對(duì)照，0.027 g/kg，經(jīng)人用臨床劑量換算的等效劑量），模型對(duì)照組，樣品A高、低劑量組［7.432、1.858 g（生藥）/kg，分別相當(dāng)于成人日服生藥80、20 g，其中低劑量組與臨床用藥劑量相近］，樣品B高、低劑量組［7.432、1.858 g（生藥）/kg］，每組10只，♀♂各半。正常對(duì)照組大鼠給予等體積生理鹽水。給藥方法：生理鹽水溶解藥物，每天1次，連續(xù)灌服給藥8周。測(cè)定方法：第8周末，各組大鼠末次給藥后1 h，以100 mg/kg依托咪酯水溶液腹腔注射麻醉后，分離右頸總動(dòng)脈，插入注有125 u/ml肝素鈉溶液的聚乙烯導(dǎo)管中，通過(guò)壓力換能器連接多導(dǎo)生理記錄儀及生理信號(hào)處理系統(tǒng)，測(cè)量大鼠收縮壓、舒張壓。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示；多組間均數(shù)的比較采用單因素方差分析，組間均數(shù)兩兩比較；方差齊時(shí)采用SNK法，方差不齊時(shí)采用Dunnett's T3法。統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)由SPSS 2.0軟件完成。大鼠血壓測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。

表1　各組大鼠血壓測(cè)定結(jié)果（±s，n=10）Tab 1　Blood pressure of rats in each group（±s，n=10）

表1　各組大鼠血壓測(cè)定結(jié)果（±s，n=10）Tab 1　Blood pressure of rats in each group（±s，n=10）

注：與正常對(duì)照組比較，＊P＜0.01；與模型對(duì)照組比較，#P＜0.01Note：vs.normal control group，＊P＜0.01；vs.model control group，#P＜0.01

舒張壓，mmHg 74.58±4.24 113.38±12.77＊76.82±8.86#85.91±313.69#103.88±12.04 82.99±9.69#92.88±13.31#組別正常對(duì)照組模型對(duì)照組厄貝沙坦組樣品A高劑量組樣品A低劑量組樣品B高劑量組樣品B低劑量組劑量，g/kg 0.027 7.432 1.858 7.432 1.858收縮壓，mmHg 104.03±6.58 175.03±8.99＊128.64±14.58#138.94±10.65#154.80±6.54#140.28±19.57#154.41±12.41#

由表1可見(jiàn)，與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組大鼠收縮壓和舒張壓顯著升高（P＜0.01）；與模型對(duì)照組比較，各藥物組收縮壓降低（P＜0.01）；從降低舒張壓的效果來(lái)看，樣品B優(yōu)于樣品A，故確定本品的制備工藝路線為工藝B，即方中除天麻粉碎入藥外，其余藥材以煎煮后提取物入藥。

2.2考察指標(biāo)的測(cè)定

2.2.1固形物質(zhì)量的測(cè)定精密取煎煮后濃縮液50 ml，置于99℃水浴鍋上蒸干，在105℃下干燥至恒質(zhì)量，按照2015年版《中國(guó)藥典》干燥失重法［5］測(cè)定，計(jì)算固形物質(zhì)量。

2.2.2黃芪甲苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷的含量測(cè)定采用HPLC法測(cè)定。

（1）色譜條件。黃芪甲苷：色譜柱為Thermo ODS Hypersil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為乙腈-水（32∶68），流速為1.0 ml/min；蒸發(fā)光散射檢測(cè)器檢測(cè)；柱溫為25℃；漂移管溫度為45℃；氮?dú)饬魉贋?.5 L/min；進(jìn)樣量為20 μl。

毛蕊異黃酮葡萄糖苷：色譜柱為XBridgeTMC18（250 mm× 4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為乙腈（A）-0.2%甲酸溶液（B），梯度洗脫（0～20 minA為20%～40%，20～30 minA為40%）；流速為1.0 ml/min；二極管陣列檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)為260 nm；柱溫為25℃；進(jìn)樣量為10 μl。

（2）溶液的制備。對(duì)照品溶液的制備：取對(duì)照品適量，精密稱定，分別加甲醇制成每1 ml含0.420 0 mg黃芪甲苷的溶液和每1 ml含0.251 8 mg毛蕊異黃酮葡萄糖苷的溶液，即得。

供試品溶液的制備：精密量取煎煮后濃縮液25 ml，照2015年版《中國(guó)藥典》（一部）黃芪項(xiàng)下［5］，從“用水飽和的正丁醇振搖提取4次”內(nèi)容起依法操作，制成黃芪甲苷供試品溶液。另精密量取濃縮液1 ml，置于蒸發(fā)皿中蒸干，殘?jiān)蛹状既芙?，轉(zhuǎn)移至5 ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，制成毛蕊異黃酮葡萄糖苷供試品溶液。

陰性對(duì)照溶液的制備：按處方比例稱取除黃芪以外的藥材112 g，煎煮2次，每次加10倍量水，煎煮1.5 h，濾過(guò)，濃縮至約250 ml，按上述供試品溶液的制備方法分別制備黃芪甲苷和毛蕊異黃酮葡萄糖苷的陰性對(duì)照溶液。

（3）專屬性試驗(yàn)。分別吸取2種對(duì)照品溶液、2種供試品溶液、2種陰性對(duì)照溶液進(jìn)樣測(cè)定。試驗(yàn)結(jié)果表明，陰性對(duì)照溶液在毛蕊異黃酮葡萄糖苷和黃芪甲苷相應(yīng)位置無(wú)色譜峰出現(xiàn)，毛蕊異黃酮葡萄糖苷和黃芪甲苷主峰與鄰峰分離度均大于1.5。色譜圖見(jiàn)圖1、圖2。

圖1　黃芪甲苷的的高效液相色譜圖A.供試品溶液；B.陰性對(duì)照溶液；C.對(duì)照品溶液；1.黃芪甲苷Fig 1　HPLC chromatograms of astragalosideA.test sample；B.negative control；C.substance control；1.stragaloside

圖2　毛蕊異黃酮葡萄糖苷的高效液相色譜圖A.供試品溶液；B.陰性對(duì)照溶液；C.對(duì)照品溶液；1.毛蕊異黃酮葡萄糖苷Fig 2　HPLC chromatogram of isoflavone grape glycosidesA.test sample；B.negative control；C.substance control；1.isoflavone grape glycosides

（4）標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立。按規(guī)定方法操作，得黃芪甲苷和毛蕊異黃酮葡萄糖苷的線性回歸方程分別為lny=1.487 1lnx+ 4.501 4、y=3 318.33x+31.36（r均為0.999 6，其中y為峰面積、x為質(zhì)量濃度），二者檢測(cè)質(zhì)量濃度線性范圍分別為0.840 0～8.400、0.755 4～2.014 mg/ml。

（5）靈敏度、精密度、穩(wěn)定性和準(zhǔn)確度試驗(yàn)。按相關(guān)方法進(jìn)行操作，結(jié)果靈敏度試驗(yàn)中黃芪甲苷和毛蕊異黃酮葡萄糖苷定量限分別為0.584 1、0.675 3 μg/μl；精密度試驗(yàn)中二者峰面積的RSD分別為0.61%、0.85%（n=3）；穩(wěn)定性試驗(yàn)中二者含量的RSD分別為0.84%、0.91%（n=3，12 h內(nèi)）；重復(fù)性試驗(yàn)中二者含量的RSD分別為0.99%、1.37%（n=3）；準(zhǔn)確度試驗(yàn)中二者加樣回收率平均值分別為99.74%、98.56%（RSD分別為1.79%、1.85%，n=3）。

2.3水煎煮提取工藝的單因素試驗(yàn)

以黃芪甲苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，考察不同浸泡時(shí)間、加水倍數(shù)、煎煮時(shí)間以及煎煮次數(shù)對(duì)2個(gè)指標(biāo)的影響。

2.3.1浸泡時(shí)間按照處方比例稱取藥材5份，每份152 g，分別浸泡不同時(shí)間（0.5、1、1.5、2、2.5 h），然后加10倍量水，煎煮2次，每次提取1.5 h。

2.3.2煎煮時(shí)間按照處方比例稱取藥材5份，每份152 g，加10倍量水，煎煮2次，煎煮提取不同時(shí)間（0.5、1、1.5、2、2.5 h）。

2.3.3加水倍數(shù)按照處方比例稱取藥材5份，每份152 g，分別加入不同倍量（6、8、10、12、14倍）的水，煎煮2次，每次1.5 h。

2.3.4提取次數(shù)按照處方比例稱取藥材4份，每份152 g，分別加入10倍量水，分別煎煮1、2、3、4次，每次1.5 h。

分別將上述各條件下的提取液過(guò)濾，濃縮定容至250 ml，分別測(cè)定黃芪甲苷和毛蕊異黃酮葡萄苷含量，結(jié)果見(jiàn)表2。

由二者含量結(jié)果可見(jiàn)，浸泡時(shí)間對(duì)各指標(biāo)成分無(wú)明顯影響，故藥材提取前無(wú)需浸泡；確定正交試驗(yàn)水平范圍為煎煮時(shí)間1.5～2.5 h、加水倍數(shù)8～12倍、煎煮次數(shù)1～3次。

2.4水煎煮提取工藝的正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素考察結(jié)果確定的水平范圍，以黃芪甲苷含量（X1）、毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量（X2）和固形物質(zhì)量（X3）為評(píng)價(jià)指標(biāo)，并分別賦予權(quán)重系數(shù)為0.3、0.3、0.4，計(jì)算綜合評(píng)分值［Y，Yi=（X1i/X1max×0.3+X2i/X2max×0.3+X3i/X3max×0.4）×100］；以加水倍數(shù)、煎煮時(shí)間和煎煮次數(shù)為考察因素。按照處方比例稱取藥材9份，每份152 g，按正交試驗(yàn)安排進(jìn)行提取，濾過(guò)，濃縮并定容至250 ml，依法測(cè)定。因素與水平見(jiàn)表3、正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4、方差分析結(jié)果見(jiàn)表5。

表2　單因素試驗(yàn)考察結(jié)果Tab 2　Results of single factor test

表3　因素與水平Tab 3　Levels and factors

表4　正交試驗(yàn)結(jié)果Tab 4　Results of orthogonal test

結(jié)果表明，各因素影響大小為C＞A＞B，并且C、A因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果有顯著性影響（P＜0.05）。最終確定最優(yōu)工藝條件為A3B1C3，即藥材每次加12倍量水煎煮3次，每次1.5 h。

2.5驗(yàn)證試驗(yàn)

表5　方差分析結(jié)果Tab 5　Analysis results of variance

按照處方比例稱取藥材3份，每份152 g，根據(jù)優(yōu)化的提取工藝條件進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，計(jì)算黃芪甲苷和毛蕊異黃酮葡萄糖苷的提取率［（提取液體積×提取液中有效成分含量）/（處方中黃芪藥材質(zhì)量×黃芪藥材中有效成分含量）×100%］，結(jié)果見(jiàn)表6。

表6　驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果Tab 6　Results of verification test

表6結(jié)果表明，黃芪甲苷和毛蕊異黃酮葡萄糖苷的平均提取率分別為64.02%、51.97%，固形物平均值為5.69 g，其平均綜合評(píng)分值為96.54，與正交試驗(yàn)最大值97.50接近，提示優(yōu)化的工藝穩(wěn)定、可行。

3　討論

黃芪為方中君藥之一，所含黃芪甲苷具有擴(kuò)張血管、降低血壓、保護(hù)血腦屏障等作用［6-7］，毛蕊異黃酮葡萄糖苷具有舒張血管、保護(hù)局部缺血器官、減輕血管緊張素引起的內(nèi)皮細(xì)胞損傷等作用［8］。試驗(yàn)結(jié)果表明，在最優(yōu)提取工藝條件下，黃芪甲苷和毛蕊異黃酮葡萄糖苷的平均提取率均較高，提示該工藝條件穩(wěn)定、可行，為本制劑的下一步研究奠定了良好的基礎(chǔ)。

天麻為方中君藥之一，所含化學(xué)成分有天麻素、天麻苷元、倍半萜類等。文獻(xiàn)報(bào)道天麻藥材有明顯的鎮(zhèn)靜、降壓、降低血管阻力等作用［9-10］，但是其作用物質(zhì)基礎(chǔ)尚不清楚。經(jīng)初步藥效學(xué)研究證實(shí)，就降血壓作用而言，天麻粉碎入藥優(yōu)于與其他藥材共煎入藥，但這是否與天麻藥材中降壓成分的脂溶性或熱不穩(wěn)定性有關(guān)，還有待進(jìn)一步研究證實(shí)。

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（編輯：劉萍）

Study on the Extraction Technology of Compound Qima Capsules

WANG Luolin1，WU Xiaobin2，ZHOU Rong3，ZHANG Jianjun1，YUAN Liuping2
（1.Guangdong Province Engineering and Technology Research Institute of Chinese Medicine/Guangdong Provincial Key Laboratory of Chinese Medicine Research and Development，Guangzhou 510095，China；2.Guangdong Second Traditional Chinese Medicine Hospital，Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou 510405，China；3.Livzon Group Limin Pharmaceutical Factory，Guangdong Shaoguan 512000，China）

OBJECTIVE：To optimize the extraction technology of Compound qima capsules.METHODS：With the blood pressure lowering of rats as index，pharmacological efficacy test was used to screen the preparation technology（A was whole herb decoction；B was Gastrodia elata fine powder mixed with other decocted medical materials）.The extraction technology was optimized by single factor and orthogonal test using the contents of astragaloside and isoflavone grape glycosides and the quality of solid as indexes，with added water，decoction time，decoction times as factors；and the verification test was carried out.RESULTS：Pharmacological efficacy test showed that antihypertensive effect of sample by technology B was superior.The optimal extraction condition of other medical materials of technology B was as follows as 12-fold water per time，decocting for 1.5 h，for 3 times.In verification test，average extraction rates of astragaloside and isoflavone grape glycosides were 64.02%and 51.97%，and average value of the quality of solid was 5.69 g（RSD≤1.92%，n=3）.CONCLUSIONS：The optimized extraction technology is stable and feasible.

Compound qima capsules；Antihypertensive effect；Extraction technology；Astragaloside；Isoflavone grape glycosides；Orthogonal test

R284.2；R285

A

1001-0408（2016）22-3128-04

10.6039/j.issn.1001-0408.2016.22.31

＊主任中藥師，碩士生導(dǎo)師。研究方向：中藥制劑。電話：020-83501292。E-mail：luolin_w@163.com

2015-11-03

2016-03-02）