張鵬威，蘇文琴，鄺少軼，劉　瑋

（1.海南醫(yī)學院藥學院，海口　571199；2.海南通用三洋藥業(yè)有限公司，?？凇?70312）

0.03%他克莫司軟膏的體外透皮吸收研究Δ

張鵬威1＊，蘇文琴1，鄺少軼1，劉瑋2#

（1.海南醫(yī)學院藥學院，?？?71199；2.海南通用三洋藥業(yè)有限公司，海口570312）

目的：研究0.03%他克莫司軟膏經(jīng)離體裸鼠皮的透皮吸收情況，并比較國產(chǎn)受試制劑與進口參比制劑的差異。方法：采用改良Franz擴散池法進行體外透皮試驗，以高效液相色譜-質(zhì)譜法（HPLC-MS）測定國產(chǎn)受試制劑和進口參比制劑0.03%他克莫司軟膏的體外透皮滲透量、滲透速率和滯后時間。結(jié)果：受試制劑與參比制劑的24 h體外透皮累積滲透量分別為（3 907±1 191）、（3 896±1 064）ng/cm2，滲透速率分別為186.7、182.9 ng（/cm2·h），滯后時間分別為1.95、2.00 h，二者差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。結(jié)論：受試制劑有良好的透皮性能，其在裸鼠離體皮膚的透皮吸收性能與參比制劑相當。

他克莫司軟膏；體外透皮吸收；裸鼠；高效液體色譜-質(zhì)譜法

他克莫司是一種大環(huán)內(nèi)酯類的免疫抑制劑，外用可作為抗菌藥物，其主要通過阻斷鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶活化而抑制皮損處T細胞的活化；另外，亦可通過調(diào)節(jié)其他免疫細胞相關(guān)因子的釋放來改善皮損處的炎癥反應［1］。這種抗炎活性與外用糖皮質(zhì)激素相似，但是外用他克莫司不具有糖皮質(zhì)激素那樣的副作用。他克莫司在特異性皮炎、白癜風、銀屑病等治療中療效良好，目前也無該藥增加局部感染和腫瘤發(fā)生的證據(jù)［2］。臨床上，外用他克莫司軟膏及水凝膠等制劑有0.1%和0.03%兩種規(guī)格，目前國內(nèi)外已有0.1%他克莫司軟膏體外透皮吸收研究報道［2-5］，但0.03%規(guī)格制劑由于藥物濃度低，采用常規(guī)檢測儀器無法測定，因此少見報道。為此，本文建立了高效液相色譜-質(zhì)譜法（HPLC-MS），以研究0.03%他克莫司軟膏體外透皮吸收情況，并以進口他克莫司軟膏為參比制劑進行了對比，為該藥臨床使用提供了試驗依據(jù)。

1　材料

1.1儀器

RYJ-6B透皮試驗儀（上海黃海藥檢儀器有限公司）；Agilent 1200 HPLC-6100 MS儀（美國安捷倫公司）；TDL-80-2B臺式離心機（上海安亭科學儀器廠）；WD-12水浴氮吹儀（杭州奧盛儀器有限公司）；MS105DU電子天平（梅特勒-托利多有限公司）。

1.2藥品與試劑

他克莫司軟膏（受試制劑，批號：20121101，規(guī)格：3 mg∶10 g）、他克莫司對照品（批號：S121001，純度：99.6%）均購自海南皇隆制藥股份有限公司提供；他克莫司軟膏［參比制劑，安斯泰來制藥（中國）有限公司，批號：032330，規(guī)格：3 mg∶10 g］；吉非替尼對照品（內(nèi)標，海口南陸醫(yī)藥科技有限公司，批號：20130901，純度：99.92%）；0.9%氯化鈉注射液（安徽雙鶴藥業(yè)有限責任公司，批號：140304）；純化水和重蒸餾水為自制，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3動物

裸鼠，♀，體質(zhì)量為21～25 g，年齡約為6周齡，購于長沙東創(chuàng)實驗動物科技股份有限公司，動物合格證號：43004700008035。

2　方法與結(jié)果

2.1離體鼠皮的處理

取裸鼠，斷頸處死，從頸部環(huán)形剪開皮膚，剝離皮膚，剪下腹部皮膚，小心去除皮膚上的殘留附屬物，檢查皮膚完整性，剔除有皮損皮膚，置于含生理鹽水的封口袋中，隨機編號，于0℃冷藏保存?zhèn)溆?。從處死裸鼠至透皮試驗時間不超過48 h。

2.2透皮滲透試驗

取裸鼠6只，均分為2組進行體外透皮試驗，間隔24 h后，進行交叉試驗。取按“2.1”項下處理后的鼠皮，吸干水分，固定于Franz擴散池的供給池與接收池之間，皮膚角質(zhì)層面向供給池，真皮層面向接收池。分別取1 g受試制劑或參比制劑涂抹于鼠皮（擴散面積2.54 cm2）上，在橡膠皮桌面上用力振動擴散池，使軟膏與鼠皮間氣泡溢出，然后以保鮮膜覆蓋供給池口。以32℃無水乙醇-生理鹽水（3∶7，V/V）為接收液，將接收池置于（32±0.5）℃的透皮試驗儀中，以300 r/min進行攪拌并計時。分別于2、4、6、8、12、24 h抽取全部溶液，并精密測定其體積Vi，同時立即補充32℃空白接收液。所取樣品立即置于-18℃冷凍，集中測定他克莫司含量。按公式計算累積滲透量Q（nng/cm2），其中Qn為第n個時間點累積滲透量，ci為第i時間點藥物濃度，Vi為第i時間點接收液體積，S為有效滲透面積，穩(wěn)態(tài)滲透速率Js［ng（/cm2·h）］為達到穩(wěn)態(tài)滲透后Qn對t的回歸方程斜率。數(shù)據(jù)分析采用SPSS 11.0軟件處理，正態(tài)計量指標采用均數(shù)±標準差（±s）表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2.3接收液中他克莫司含量的測定

2.3.1溶液的制備對照品貯備液：將他克莫司對照品用甲醇制備成104 μg/ml的標準貯備液，置于4℃中保存，使用時用甲醇稀釋至所需濃度。內(nèi)標溶液：將吉非替尼對照品用甲醇制備成203.8 μg/ml的內(nèi)標貯備液，置于4℃中保存，使用時用甲醇稀釋至679.3 ng/ml。空白溶液：取處理好的裸鼠皮膚2 g，剪碎，加適量空白接收液制成勻漿，加2 g空白軟膏基質(zhì)（不含他克莫司），再加入空白接收液至500 ml，超聲30 min，過濾，即得。

2.3.2接收液的處理吸取4 ml接收液，置于10 ml離心管中，加入內(nèi)標溶液15 μl，渦旋混勻；加乙酸乙酯2 ml，渦旋混合2 min，3 500 r/min（離心半徑為80 mm）離心5 min；精密吸取上層有機相于40℃水浴氮氣吹干，殘渣用甲醇100 μl溶解，取3 μl進樣測定。按內(nèi)標法以峰面積計算他克莫司濃度。

2.3.3色譜條件色譜柱：Agilent Eclipse Extend-C18（150 mm×3.0 mm，3.5 μm）；流動相：A為甲醇，B為10 mmol/L醋酸銨水溶液，梯度洗脫［0 min（18%B）→12 min（18%B）→13 min （5%B）→15 min（18%B）］，流速：0.5 ml/min；柱溫：25℃；進樣量：3 μl。

2.3.4質(zhì)譜條件電噴霧電離源（ESI），選擇性正離子監(jiān)測（SIM），［M+H］+質(zhì)荷比（m/z）：821.6（他克莫司）、446.5（吉非替尼）；碰撞誘導解離，干燥氣體流速：10 L/min，干燥氣：氮氣；溫度：350℃；壓力：40 psi；毛細管電壓：3 000 V。吉非替尼和他克莫司的質(zhì)譜圖見圖1。

圖1　質(zhì)譜圖Fig 1　Mass chromatograms

2.3.5專屬性試驗取空白基質(zhì)滲透接收液、空白溶液+他克莫司對照品+內(nèi)標、滲透12 h的樣品（受試制劑）接收液，按“2.3.2”項下方法處理后進樣測定，記錄色譜。結(jié)果顯示，他克莫司和內(nèi)標峰之間分離良好，溶液中無內(nèi)源性物質(zhì)干擾測定，色譜圖見圖2。

圖2　總離子流色譜圖Fig 2　Total ions chromatograms

2.3.6線性關(guān)系考察用空白溶液將他克莫司貯備液制備成他克莫司質(zhì)量濃度分別為20.8、41.6、104、208、416、832 ng/ml的系列質(zhì)控樣品，按“2.3.2”項下方法處理后，進樣測定。以他克莫司與內(nèi)標峰面積的比值（f）為縱坐標，以他克莫司質(zhì)量濃度（c）為橫坐標進行線性回歸分析，得回歸方程為f=0.013 96c-0.005 4（r=0.999 9）。結(jié)果表明他克莫司檢測質(zhì)量濃度的線性范圍為20.8～832 ng/ml，定量下限為20.8 ng/ml。

2.3.7精密度試驗按“2.3.6”項下方法制備他克莫司質(zhì)量濃度分別為41.6、208、624 ng/ml的質(zhì)控樣品，每個濃度5份，按“2.3.2”項下方法處理后，進樣測定，考察批內(nèi)精密度。結(jié)果低、中、高質(zhì)量濃度質(zhì)控樣品的批內(nèi)RSD分別為3.51%、4.35%、3.92%（n=5），均小于15%，符合生物樣品檢測的要求。

2.3.8儀器精密度試驗取他克莫司質(zhì)量濃度為208 ng/ml的質(zhì)控樣品，按“2.3.2”項下方法處理后，重復進樣5次，記錄峰面積。結(jié)果，他克莫司和內(nèi)標峰面積的比值RSD為0.71%（n= 5），表明儀器精密度良好，符合測定要求。

2.3.9加樣回收率試驗按“2.3.6”項下方法制備他克莫司質(zhì)量濃度分別為41.6、208、624 ng/ml的質(zhì)控樣品，每個濃度5份，分別按“2.3.2”項下方法處理后，進樣測定，計算加樣回收率。結(jié)果，低、中、高質(zhì)量濃度質(zhì)控樣品的平均加樣回收率分別為107.8%、107.2%、107.5%，RSD分別為3.99%、3.20%、3.88% （n=5）。

2.3.10穩(wěn)定性試驗按“2.3.6”項下方法制備他克莫司質(zhì)量濃度分別為41.6、208、624 ng/ml的質(zhì)控樣品，分別于室溫放置8 h和-20℃下放置5 d后，按“2.3.2”項下方法處理后，進樣測定，每個濃度測定5份。結(jié)果，低、中、高質(zhì)量濃度質(zhì)控樣品于室溫放置8 h的RSD分別為15.29%、5.91%、8.17%（n=5），于-20℃放置5 d的RSD分別為7.47%、7.22%、6.79%（n= 5），均符合生物樣品測定要求。

2.4透皮滲透試驗結(jié)果

2種制劑的體外累積滲透量見表1（表中ND表示低于定量下限，視為未檢出）。

表1　2種制劑的體外累積滲透量（±s，n=6，ng/cm2）Tab 1　Accumulative permeation amount in vitro of 2 preparations（±s，n=6，ng/cm2）

表1　2種制劑的體外累積滲透量（±s，n=6，ng/cm2）Tab 1　Accumulative permeation amount in vitro of 2 preparations（±s，n=6，ng/cm2）

樣品受試制劑參比制劑取樣時間2 h ND ND 4 h 102.5±98.4 110.0±66.4 6 h 419.9±147.6 440.0±201.4 8 h 1 168±506 1 151±498 12 h 2 256±961 2 196±861 24 h 3 907±1 191 3 896±1 064

由表1可知，他克莫司在2 h時累積滲透量較少，均低于定量下限，到4 h才有較明顯的藥物滲透，但需要到6 h才能達到穩(wěn)態(tài)滲透。2種制劑間24 h的累積滲透量差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。將達到滲透平衡時的第6、8、12、24 h累積滲透量Q對時間t進行線性回歸，所得直線斜率即滲透速率Js，將線性回歸方程外延至Q=0，以其對應時間t作為滯后時間Tlag，結(jié)果見表2。

表2　2種制劑的體外滲透速率和滯后時間（±s，n=6）Tab 2　Permeation rate in vitro and delay time of 2 preparations（±s，n=6）

表2　2種制劑的體外滲透速率和滯后時間（±s，n=6）Tab 2　Permeation rate in vitro and delay time of 2 preparations（±s，n=6）

樣品受試制劑參比制劑Tlag，h 1.95 2.00回歸曲線方程Q=183.7t-358.0 Q=182.9t-365.8 Js，ng/（cm2·h）186.7 182.9 r 0.978 20.982 2

由表2可知，受試制劑和參比制劑的Js和Tlag均無明顯差異。

3　討論

一般認為，豬皮結(jié)構(gòu)與人皮膚相似，體外透皮試驗采用豬皮能較好地預測藥物經(jīng)人體皮膚吸收情況，但豬成本相對較高。根據(jù)2012年歐盟發(fā)布的《透皮貼劑質(zhì)量指南》，透皮制劑在體外滲透試驗中，在無法采用人體皮膚時，可以采用人造皮膚、豬皮、豚鼠皮、裸鼠皮等［6］。由于本研究受試制劑與參比制劑采用相同試驗條件，故可以采用裸鼠皮比較不同制劑間的體外滲透差異，為體內(nèi)吸收提供依據(jù)。

由于透皮接收溶液里含有皮膚組織浸出物，因此本文含量測定方法學參照生物樣品定量分析方法驗證指導原則進行。由于接收池容積較小，不同時段接收液成分略有不同，而方法學考察需要大量空白接收液，因此將皮膚組織用空白接收液做成勻漿，加入空白基質(zhì)充分溶解后過濾，因此其成分與空白基質(zhì)的接收液近似，故以此用于方法學考察用溶劑。

由于他克莫司在水中幾乎不溶，易溶于乙醇。進行體外透皮試驗時，接收液需要形成漏槽條件（Sink condition），另外要求接收液盡量不破壞或影響正常皮膚的生理功能［6］。在他克莫司體外滲透試驗中，相關(guān)文獻分別選用生理鹽水-無水乙醇（50∶50）、生理鹽水-無水乙醇（70∶30）、生理鹽水-無水乙醇（75∶25）、磷酸鹽溶液-無水乙醇（70∶30）為透皮接收介質(zhì)［2-4，7］，筆者在考慮到他克莫司溶解性基礎上，選用生理鹽水-無水乙醇（70∶30）作為接收液。該接收液滿足漏槽條件，其基本成分與體液接近。

根據(jù)2012年歐盟發(fā)布的《透皮貼劑質(zhì)量指南》，透皮制劑在體外滲透試驗中，取樣點需要滿足表征滲透行為要求，通常不少于5個取樣點，并且最小取樣時間要盡可能早，如15 min 或30 min［6］。通常認為，第1個取樣點要盡可能早的原因是為了驗證皮膚是否存在破損，因為一般藥物經(jīng)皮滲透都有一定的滯后時間Tlag，若皮膚破損則在很短時間內(nèi)即可檢測到較顯著量的滲透藥物。在預試驗中筆者曾進行過0.5、1、2 h時間點取樣，然而由于本制劑里藥物濃度本身較低（0.03%），因此在120 min內(nèi)的接收液中藥物濃度均低于檢測限，無法檢測。因此將第1個取樣時間點確定為2 h。

在進行滲透接收液藥物濃度檢測時，本課題組首先考察了樣品處理方法比較簡單的HPLC-紫外檢測器法，然而由于藥物濃度較低，而且本藥的紫外吸收較弱，因此其色譜峰較小，無法滿足定量測定要求。因此改用HPLC-MS法測定，本法靈敏度高，然而本法要求樣品和流動相里無可揮發(fā)性成分，否則影響檢測靈敏度［8］。因此，筆者根據(jù)藥物性質(zhì)，將接收液用乙酸乙酯萃取，將其中的氯化鈉和皮膚組織浸出物分離。方法學驗證表明，該法靈敏度高，精密度和準確度符合生物樣品檢測要求。

［1］Kino T，Hatanaka H，Miyata S，et al.FK-506，a novel immunosuppressant isolated from a Streptomyces.Ⅱ.immunosuppressive effect of FK-506 in vitro［J］.J Antibiotics，1987，40（9）：1 256.

［2］楊建強，宋穎.他克莫司軟膏治療局限性慢性單純性苔蘚臨床觀察［J］.中國藥房，2010，21（10）：915.

［3］李龍年.FK506-SLN水凝膠的制備及其體外透皮和藥效學研究［D］.廣州：南方醫(yī)科大學，2012：17.

［4］Nam SH，Ji XY，Park JS.Investigation of tacrolimus loaded nanostructured lipid carriers for topical drug delivery ［J］.Bull Korean Chem Soc，2011，32（3）：956.

［5］Pople PY，Singh KK.Development and evaluation of colloidal modified nanolipid carrier：application to topical delivery of tacrolimus［J］.Eur J Pharm Biopharm，2011，79（1）：82.

［6］Quality Working Party，European Medicines Agency.Guideline on quality of transdermal patches［EB/OL］.（2012-08-23）［2016-04-23］.http：//www.damienbove.com/pdf/ wc500132404.pdf.

［7］汪宏，王維，張建華，等.他克莫司軟膏的體外透皮吸收研究［J］.華西藥學雜志，2014，29（2）：119.

［8］黃艷，吳月，郭曉烽，等.LC-MS法測定人血漿中賴諾普利樣品前處理方法改進［J］.藥學與臨床研究，2008，16 （2）：104.

（編輯：鄒麗娟）

Study on Percutaneous Absorption in vitro of 0.03% Tacrolimus Ointment

ZHANG Pengwei1，SU Wenqin1，KUANG Shaoyi1，LIU Wei2
（1.School of Pharmacy，Hainan Medical University，Haikou 571199，China；2.Hainan Tongyong-Sanyo Pharmaceutical Co.，Ltd.，Haikou 570312，China）

OBJECTIVE：To study the percutaneous absorption of 0.03%Tacrolimus ointment，and to compare the difference of domestic test preparation and imported reference preparation.METHODS：Modified Franz diffusion cells were adopted in transdermal test in vitro；HPLC-MS method was used to determine permeation amount and rate in vitro，delay time of domestic test preparation and imported reference preparation 0.03%Tacrolimus ointment.RESULTS：24 h in vitro permeation amount of test and reference preparations were（3 907±1 191）and（3 896±1 064）ng/cm2；permeation rates were 186.7 and 182.9 ng（/cm2·h）；delay time were 1.95 and 2.00 h，respectively（P＞0.05）.CONCLUSIONS：Test preparation shows good percutaneous property，and is similar to reference preparation in penetration absorbency through nude mice skin.

Tacrolimus ointment；Percutaneous absorption in vitro；Nude mice；HPLC-MS

R965

A

1001-0408（2016）22-3051-03

10.6039/j.issn.1001-0408.2016.22.09

海南省應用技術(shù)研發(fā)與示范推廣專項（No. ZDXM2015122）

＊副教授，博士。研究方向：藥物制劑開發(fā)和藥物質(zhì)量標準研究。電話：0898-31350722。E-mail：zpw0803@163.com

高級工程師。研究方向：藥物制劑開發(fā)。電話：0898-68710202。E-mail：13519891999@139.com

2016-05-06

2016-06-08）