陳　凱，李　收，金　凱，趙　晶，郝吉福#

（1.泰山醫(yī)學院藥學院，山東泰安　271016；2.濟寧醫(yī)學院附屬醫(yī)院藥劑科，山東濟寧　272000；3.棗莊科技職業(yè)學院醫(yī)學技術(shù)系，山東棗莊　277500）

Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化吲哚美辛固體脂質(zhì)納米粒處方Δ

陳凱1，2＊，李收3，金凱1，趙晶1，郝吉福1#

（1.泰山醫(yī)學院藥學院，山東泰安271016；2.濟寧醫(yī)學院附屬醫(yī)院藥劑科，山東濟寧272000；3.棗莊科技職業(yè)學院醫(yī)學技術(shù)系，山東棗莊277500）

目的：優(yōu)化吲哚美辛固體脂質(zhì)納米粒處方。方法：以吲哚美辛為模型藥物、山崳酸甘油酯為油相、泊洛沙姆188和聚乙二醇-12-羥基硬脂酸酯為乳化劑，以濁度、包封率、載藥量為指標，采用Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化處方中油相用量、乳化劑-油相比例、藥物-油相比例。采用掃描電鏡、差示掃描熱分析（DSC）表征固體脂質(zhì)納米粒的理化性質(zhì)。結(jié)果：最優(yōu)處方的油相用量為0.91%，乳化劑-油相比例為1∶1，藥物-油相比例為1∶5；所制吲哚美辛固體脂質(zhì)納米粒的濁度為1 025～1 030 NTU，包封率為98.94%～99.08%，載藥量為2.43%～2.46%，粒徑為181.5～182.3 nm，多分散性指數(shù)（PDI）為0.340～0.341（n=3）；DSC結(jié)果顯示吲哚美辛不是以結(jié)晶狀態(tài)存在于固體脂質(zhì)納米粒中。結(jié)論：成功篩選出最優(yōu)處方，制得吲哚美辛固體脂質(zhì)納米粒。

吲哚美辛；固體脂質(zhì)納米粒；Box-Behnken響應(yīng)面法；優(yōu)化處方

吲哚美辛（Indomethacin，IDM）為非甾體抗炎藥，通過抑制前列腺素的合成而發(fā)揮解熱、鎮(zhèn)痛、消炎作用，臨床上用于治療類風濕性關(guān)節(jié)炎及電光眼、角膜炎、鞏膜炎等多種眼部炎癥［1-2］。近年來，微粒載體在黏膜遞藥系統(tǒng)中發(fā)展迅速，固體脂質(zhì)納米粒（Solid lipid nanoparticles，SLN）是以脂質(zhì)材料包裹或鑲嵌脂溶性藥物形成的粒徑為10～1 000 nm的固態(tài)膠粒。納米級粒徑賦予SLN較好的黏膜附著性與滲透性，使其易于通過融合或穿透機制進入黏膜而具有獨特優(yōu)勢［3-4］。

Box-Behnken設(shè)計是普遍采用的一種優(yōu)化方案［5-7］。本試驗以IDM為模型藥物，擬通過制備成SLN以改善其溶解度低的缺點，利用納米顆粒增加黏膜滲透性與穿透性等作用以提高IDM在治療眼部疾病中的應(yīng)用，并采用Box-Behnken響應(yīng)面法通過數(shù)學模型回歸方程優(yōu)化IDM-SLN處方。

1　材料

1.1儀器

JY92-Ⅱ探頭超聲波細胞粉碎儀（寧波新芝科技股份有限公司）；超速冷凍離心機（美國Sigma公司）；WZS-185濁度計（上海雷磁儀器廠）。

1.2藥品與試劑

IDM對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：100258-200904，純度：99.4%）；IDM原料藥（鄭州德寶精細化工有限公司，批號：20131218，純度：99.3%）；山崳酸甘油酯（Compritol?888 ATO，法國Gattefossé公司）；聚乙二醇-12-羥基硬脂酸酯（HS15）和泊洛沙姆188（北京鳳禮精求商貿(mào)有限公司）；其余試劑均為分析純。

2　方法與結(jié)果

2.1IDM-SLN的制備

采用熔融乳化超聲法制備IDM-SLN。將山崳酸甘油酯、IDM原料藥與適量無水乙醇水浴加熱至85℃融化作為油相。將泊洛沙姆188和HS15溶于蒸餾水中，水浴加熱至85℃左右形成水相。在攪拌下將水相加入熔融的油相中形成初乳，超聲（功率：600 W）10 min，制得淡藍色透明膠體溶液，0℃冰浴，1 000 r/min攪拌至油相脂質(zhì)材料充分冷卻，即得IDM-SLN膠體溶液［8］。

2.2包封率和載藥量的測定

2.2.1IDM的含量測定及方法學考察采用紫外分光光度計測定IDM-SLN中IDM的含量。精密稱取IDM對照品適量，用無水乙醇制備成系列質(zhì)量濃度的標準溶液，于200～400 nm波長范圍內(nèi)進行掃描。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，IDM在319 nm波長處有最大吸收。以IDM的質(zhì)量濃度（c）為橫坐標、吸光度（A）為縱坐標繪制標準曲線，得回歸方程為A=7.234 7c-0.002 4（r=0.999 6），表明IDM質(zhì)量濃度在0.025～4μg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。按相關(guān)方法考察0.025、0.25、2.5 μg/ml的IDM溶液的日內(nèi)RSD分別為3.12%、1.87%、2.64%（n=5），日間RSD分別為3.78%、2.79%、3.17%（n=5），回收率分別為102.32%、99.25%、99.76%（RSD=1.63%），均符合方法學考察要求。

2.2.2包封率的測定采用乙醇溶解破壞和鹽析沉淀的方法測定IDM-SLN的包封率。精密量取1.0 ml IDM-SLN膠體溶液于10 ml量瓶中，加無水乙醇定容至刻度，400 W功率下超聲10 min，1 800×g離心10 min，取上清液在319 nm波長處測定吸光度（A），由標準曲線計算上清液中IDM的總含量（M總量）；另取1.0 ml IDM-SLN膠體溶液加飽和硫酸銨鹽析，1 800×g離心10 min，取下層溶液測定吸光度（A）。由標準曲線計算游離IDM的含量（M游離），計算包封率=（M總量-M游離）/M總量×100%。

2.2.3載藥量的測定［9］采用冷凍干燥法測定IDM-SLN的載藥量。同“2.2.2”項下方法測定M總量和M游離。另精密量取IDMSLN膠體溶液1.0 ml，經(jīng)冷凍干燥后測定凍干粉末中IDM的含量（M凍干），計算載藥量=（M總量-M游離）/（M凍干-M游離）×100%。

2.3濁度的測定

精密量取IDM-SLN膠體溶液5.0 ml，置于50 ml量瓶中，加雙蒸水稀釋至刻度，通過WZS-185濁度計測定濁度。

2.4處方優(yōu)化

2.4.1Box-Behnken設(shè)計試驗根據(jù)預試驗結(jié)果，選擇顯著影響IDM-SLN處方的3個因素，即油相（山崳酸甘油酯）的用量［X1，%（m/m）］、乳化劑（泊洛沙姆188-HS15）-油相的比例（X2）、藥物-油相的比例（X3），每個因素的高、中、低3個水平分別以1、0、-1計，以濁度（Y1）、包封率（Y2）和載藥量（Y3）為響應(yīng)值，采用Box-Behnken設(shè)計試驗建立數(shù)學模型優(yōu)化處方，并用Design Expert軟件對試驗數(shù)據(jù)進行擬合分析［10］。因素與水平見表1，Box-Behnken試驗設(shè)計與響應(yīng)值結(jié)果見表2。

表2　Box-Behnken試驗設(shè)計與響應(yīng)值結(jié)果（n=3）Tab 2　Design and response values of Box-Behnken test（n= 3）

2.4.2數(shù)據(jù)處理利用Box-Behnken試驗軟件對各指標數(shù)據(jù)進行回歸分析，將數(shù)據(jù)擬合為二項式方程模型。結(jié)果Y1= 926.09+390.88X1+75.12X2-103.62X3+159.37X1X2-200.88X1X3-120.12X2X3-235.38X1X2X3，經(jīng)F檢驗顯示方程具有顯著性（P=0.039 8），表明該回歸模型的擬合情況良好，能準確預測實際濁度；Y2=0.95+0.022X1-7.051×10-4X2+0.02X3-5.09×10-3X1X2-6.682×10-3X1X3+2.452×10-3X2X3+4.138×10-3X1X2X3，經(jīng)F檢驗顯示方程無顯著性（P=0.406），說明該回歸模型的擬合情況不佳，不能準確預測實際包封率；Y3=0.018+ 1.767×10-4X1-2.072×10-3X2+6.214×10-3X3-4.875×10-4X1X2+ 1.16×10-3X1X3-2.23×10-4X2X3-3.891×10-5X1X2X3，經(jīng)F檢驗顯示方程具有顯著性（P=0.031 4），表明該回歸模型的擬合情況良好，能準確預測實際載藥量。

2.4.3響應(yīng)面法優(yōu)化根據(jù)制劑設(shè)計需要，目標參數(shù)要求獲得Y1較小而Y2、Y3較大的處方。應(yīng)用Design Expert設(shè)計軟件繪制因素對響應(yīng)值影響的三維圖，結(jié)果見圖1。

由圖1中可知，油相的增加會使?jié)岫让黠@增大，而增大乳化劑的量會使?jié)岫冉档?；當乳化?油相的比例增加時，包封率呈增加趨勢；乳化劑和藥物含量對載藥量影響顯著。在影響載藥量的各因素中，不同因素作用不盡相同：隨乳化劑的增加，載藥量呈降低趨勢；當藥物含量增加時，載藥量呈增加趨勢；但當乳化劑量固定時，隨油相增加載藥量呈略減小趨勢［11-12］。用Design Expert設(shè)計軟件對目標限定條件進行優(yōu)化，將代碼數(shù)值轉(zhuǎn)化成優(yōu)化的實際數(shù)值，優(yōu)化后的處方為：油相（山崳酸甘油酯）用量為0.91%、乳化劑（泊洛沙姆188-HS15）-油相的比例為1∶1、藥物與油相的比例為1∶5。

2.5驗證試驗及形態(tài)觀察

按“2.4”項下優(yōu)化后的處方制備3批IDM-SLN，測定濁度、包封率、載藥量、粒徑大小及多分散指數(shù)（Polydispersity index，PDI），并用電鏡觀察形態(tài)。驗證試驗結(jié)果見表3，粒徑分布見圖2，掃描電鏡圖見圖3。

2.6表征

將IDM原料藥、山崳酸甘油酯、IDM-SLN以及物理混合物進行差示掃描量熱法分析，升溫速度為10℃/min，升溫至230℃，氮氣保護。記錄差示掃描量熱曲線，結(jié)果見圖4。

由圖4可知，IDM的熔點為160.68℃，而IDM-SLN中并未出現(xiàn)IDM的吸熱峰，表明IDM在IDM-SLN中可能不是以結(jié)晶形態(tài)存在；物理混合物中表現(xiàn)出典型的山崳酸甘油酯的吸熱峰，但并未表現(xiàn)出顯著的IDM的熔融峰，這可能與差示掃描量熱測試環(huán)節(jié)溫度持續(xù)升高的過程中IDM與熔融的脂質(zhì)載體形成低共融混合物有關(guān)。

3　討論

目前在藥劑學處方優(yōu)化過程中，可以采用多種方法對處方進行設(shè)計，常用的有正交試驗設(shè)計和均勻試驗設(shè)計等方法，這兩種方法具有試驗次數(shù)少、使用普遍等優(yōu)點，但所選擇的變量為一個點，不能對處方設(shè)計過程中形成的連續(xù)變量進行分析與預測處理。而Box-Behnken設(shè)計屬于響應(yīng)面試驗設(shè)計的一種，可以在各設(shè)計的因素點與響應(yīng)值之間連接成曲面，預測與分析在某個曲面過程中所選擇因素對響應(yīng)值變化的影響，因而可以更直觀、更形象地分析因素與目標響應(yīng)值之間的關(guān)系；同時還可以在因素與響應(yīng)值之間建立數(shù)學模型，通過對數(shù)學模型的擬合進行分析，從而更準確地獲得最優(yōu)工藝條件；其局限性在于試驗次數(shù)較多［13］。

圖1　因素與響應(yīng)值關(guān)系的三維圖Ⅰ.濁度；Ⅱ.包封率；Ⅲ.載藥量Fig 1　Three-dimensional response surface plot of factors to response valueⅠ.turbidity；Ⅱ.entrapment efficiency；Ⅲ.drug loading amount

表3　驗證試驗結(jié)果（n=3）Tab 3　Results of validation test（n=3）

圖2　IDM-SLN的粒徑分布Fig 2　Particle size distribution of indomethacin-loading SLNs

圖3　IDM-SLN的掃描電鏡圖Fig 3　SEM photography of indomethacin-loading SLNs

圖4　4種樣品的差示掃描量熱圖Fig 4　DSC of 4kinds of sample

濁度是液體中懸浮物質(zhì)對光線透過時所形成的阻礙程度，通過對濁度的測定可以間接反映粒徑大小。

由于SLN屬于高分散體系，乳化劑的增加能降低兩相之間表面張力，提高系統(tǒng)的穩(wěn)定性，這與采用熔融乳化分散法形成SLN的機制有關(guān)。當脂質(zhì)材料在加熱至其熔點后，形成液態(tài)的脂質(zhì)載體，能夠溶解脂溶性藥物，故當脂質(zhì)材料增加時能夠包載或鑲嵌更多的藥物，導致其包封率增加。在乳化劑對包封率的影響過程中，由于隨著乳化劑含量的增加系統(tǒng)穩(wěn)定性增強，而使包載的藥量增大；但對載藥量而言，隨乳化劑濃度的增加，在體系中能形成膠團而促進藥物的溶解，因而使載藥量降低［14-15］。

本文應(yīng)用Box-Behnken設(shè)計對IDM-SLN處方進行優(yōu)化，并通過對數(shù)學模型的分析處理得出因素與響應(yīng)值之間的相互關(guān)系，使其能夠方便、快捷、準確地獲得最優(yōu)工藝條件，為IDMSLN的進一步研究奠定基礎(chǔ)。

［1］ Ghanbarzadeh S，Hariri R，Kouhsoltani M，et al.Enhanced stability and dermal delivery of hydroquinone using solid lipid nanoparticles［J］.Colloids Surf B Biointerfaces，2015，doi：10.1016/j.colsurfb.2015.10.041.

［2］Limón D，Amirthalingam E，Rodrigues M，et al.Novel nanostructured supramolecular hydrogels for the topical delivery of anionic drugs［J］.Eur J Pharm Biopharm，2015，doi：10.1016/j.ejpb.2015.09.007.

［3］Hippalgaonkar K，Adelli GR，Hippalgaonkar K，et al.Indomethacin-loaded solid lipid nanoparticles for ocular delivery：development，characterization，and in vitro evaluation［J］.J Ocul Pharmacol Ther，2013，29（2）：216.

［4］ Muller RH，Shegokar R，Keck CM.20 years of lipid nanoparticles（SLN and NLC）：present state of development and industrial applications［J］.Curr Drug Discov Technol，2011，8（3）：207.

［5］劉澤玉，蘇柘僮，楊明，等.青黛炮制過程中靛藍定向生成的工藝設(shè)計與優(yōu)化［J］.中草藥，2011，42（1）：56.

［6］Das S，Ng WK，Kanaujia P，et al.Formulation design，preparation and physic-chemical characterizations of solid lipid nanoparticles containing a hydrophobic drug：effects of process variables［J］.Colloids Surf B Biointerfaces，2011，88（1）：483.

［7］Wang F，Chen L，Jiang S，et al.Optimization of methazolamide-loaded solid lipid nanoparticles for ophthalmic delivery using Box-Behnken design［J］.J Liposome Res，2014，24（3）：171.

［8］Gokce EH，Korkmaz E，Dellera E，et al.Resveratrol-loaded solid lipid nanoparticles versus nanostructured lipid carriers：evaluation of antioxidant potential for dermal applications［J］.Int J Nanomedicine，2012，doi：10.2147/IJN. S29710.

［9］Hao J，F(xiàn)ang X，Zhou Y，et al.Development and optimization of solid lipid nanoparticle formulation for ophthalmic delivery of chloramphenicol using a Box-Behnken design［J］.Int J Nanomedicine，2011，doi：10.2147/IJN. S17386.

［10］郝吉福，王建筑，郭豐廣，等.基于Box-Behnken實驗優(yōu)化龍血竭固體脂質(zhì)納米粒的制備［J］.中成藥，2011，33 （10）：1 713.

［11］Zhang C，Gu C，Peng F，et al.Preparation and optimization of triptolide-loaded solid lipid nanoparticles for oral delivery with reduced gastric irritation［J］.Molecules，2013，18（11）：13 340.

［12］丁立新，楊珊珊，張楠楠，等.毛蕊花苷固體脂質(zhì)納米粒的處方優(yōu)化及其質(zhì)量評價［J］.中國藥房，2014，25（3）：231.

［13］Dejaegher B，Heyden YV.Experimental designs and their recent advances in set-up，data interpretation，and analytical applications［J］.J Pharm Biomed Anal，2011，56（2）：141.

［14］Wang S，Chen T，Chen R，et al.Emodin loaded solid lipid nanoparticles：preparation，characterization and antitumor activity studies［J］.Int J Pharm，2012，430（1/2）：238.

［15］Gidwani B，Vyas A.Preparation，characterization，and optimization of altretamine-loaded solid lipid nanoparticles using Box-Behnken design and response surface methodology［J］.Artif Cells Nanomed Biotechnol，2016，44（2）：571.

（編輯：鄒麗娟）

Formulation Optimization of Indomethacin-loading Solid Lipid Nanoparticles by Box-Behnken Response Surface Methodology

CHEN Kai1，2，LI Shou3，JIN Kai1，ZHAO Jing1，HAO Jifu1
（1.College of Pharmacy，Taishan Medical University，Shandong Tai'an 271016，China；2.Dept.of Pharmacy，the Affiliated Hospital of Jining Medical University，Shandong Jining 272000，China；3.Dept.of Medical Technology，Zaozhuang Vocational College of Science and Technology，Shandong Zaozhuang 277500，China）

OBJECTIVE：To optimize the formulation of indomethacin-loading solid lipid nanoparticle（SLN）.METHODS：Using indomethacin as model drug，glyceryl behenate as oil phase，poloxamer 188 and polyethylene glycol-12-hydroxystearic acid as emulsifier，with turbidity，entrapment efficiency and drug loading amount as index，Box-Behnken response surface methodology was used to optimize the amount of oil phase，emulsifier-oil phase ratio，drug-oil phase ratio.The physicochemical properties of SLNs were characterized by SEM and DSC.RESULTS：The optimal formulation was as follows as oil phase of 0.91%，emulsifieroil ratio of 1∶1，drug-oil phase ratio of 1∶5.The turbidity，entrapment efficiency and drug loading amount of prepared nanoparticle were 1 025-1 030 NTU，98.94%-99.08%，2.43%-2.46%，respectively；particle size and polydispersity index（PDI）were 181.5-182.3 nm and 0.340-0.341（n=3）.The results of DSC showed that indomethacin was not present in crystalline state dispersed into SLNs.CONCLUSIONS：The optimal formulation is screened successfully，and indomethacin-loaded SLNs have been prepared.

Indomethacin；Solid lipid nanoparticle；Box-Behnken response surface methodology；Formulation optimization

R943

A

1001-0408（2016）22-3118-04

10.6039/j.issn.1001-0408.2016.22.28

2013年地方高校國家級大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目（No.201310439013）

＊學士。研究方向：臨床藥學。電話：0538-6229751

副教授，碩士。研究方向：藥劑學、藥物新劑型研究與開發(fā)。E-mail：haojifu@163.com

2016-02-01

2016-05-26）