李薔薇，李　強(qiáng)，鄭　筠，周　亮

（藥食同源植物資源開(kāi)發(fā)四川省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/四川抗菌素工業(yè)研究所/成都大學(xué)，成都　610052）

HPGPC法測(cè)定羧基麥芽糖鐵重均分子質(zhì)量和分子質(zhì)量分布Δ

李薔薇＊，李強(qiáng)#，鄭筠，周亮

（藥食同源植物資源開(kāi)發(fā)四川省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/四川抗菌素工業(yè)研究所/成都大學(xué)，成都610052）

目的：建立測(cè)定羧基麥芽糖鐵重均分子質(zhì)量（Mw）和分子質(zhì)量分布（D）的方法。方法：采用高效凝膠滲透色譜法（HPGPC）檢測(cè)3批羧基麥芽糖鐵注射液（進(jìn)口）和羧基麥芽糖鐵原料（自制）的Mw和D。色譜柱為T(mén)SK G4000 PWXL，流動(dòng)相為0.1%疊氮化鈉溶液，流速為0.5 ml/min，檢測(cè)器為示差折光檢測(cè)器，柱溫為35℃，進(jìn)樣量為20μl。采用GPC軟件計(jì)算結(jié)果。結(jié)果：精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗(yàn)的RSD均小于3.0%（n=6）；進(jìn)口樣品中Mw為157 667，D為1.30；自制品的Mw為162 000，D為1.42。結(jié)論：該方法精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性、耐用性均較好，且操作簡(jiǎn)便，可用于羧基麥芽糖鐵Mw和D的檢測(cè)。

高效凝膠滲透色譜法；羧基麥芽糖鐵；重均分子質(zhì)量；分子質(zhì)量分布

羧基麥芽糖鐵是一種治療缺鐵性貧血的新型補(bǔ)鐵劑，是羧基麥芽糖與氫氧化鐵的絡(luò)合物，化學(xué)名為多核鐵氫氧化物4 （R）-［聚（1→4）-O-α-D-吡喃葡萄糖基］-氧基-2（R），3（S），5（R），6-四羥己酸復(fù)合物，分子式為［FeOX（OH）Y（H2O）Z］n｛［（C6H1005）m（C6H1207）］l｝k，其中n≈103，m≈8，l≈11，k≈4，分子質(zhì)量約16萬(wàn)，CAS號(hào)9007-72-1，一般采用重均分子質(zhì)量（Mw）和分子質(zhì)量分布（D）來(lái)對(duì)本品的分子質(zhì)量進(jìn)行質(zhì)量控制。本課題組參考2015年版《中國(guó)藥典》（二部）［1］的右旋糖酐鐵原料標(biāo)準(zhǔn)、2009版《英國(guó)藥典》［2］右旋糖酐鐵注射液標(biāo)準(zhǔn)的分子質(zhì)量和D檢測(cè)項(xiàng)，建立測(cè)定羧基麥芽糖鐵Mw和D的高效凝膠滲透色譜（HPGPC）法（也稱(chēng)分子排阻色譜法），并對(duì)其進(jìn)行方法學(xué)考察，以期為該品種的質(zhì)量控制提供參考。

1　材料

1.1儀器

LC-10AT型高效液相色譜儀，包括LC-10AT型輸液泵、RID-10A示差折光檢測(cè)器（日本島津公司）；GPC色譜工作站和GPC計(jì)算軟件（北京龍智達(dá)科技開(kāi)發(fā)有限公司）；AE163型電子分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）。

1.2藥品與試劑

右旋糖酐對(duì)照品（分子質(zhì)量D0-即葡萄糖，中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：140637-201203）；系列葡聚糖對(duì)照品（Mw分別為23 800、48 600、147 600、273 000，美國(guó)Sigma-Aldrich公司）；羧基麥芽糖鐵注射液（Vifor Pharma Deutschland GmbH公司，批號(hào)：20150523，規(guī)格：100 mg/2 ml）；羧基麥芽糖鐵原料（四川抗菌素工業(yè)研究所實(shí)驗(yàn)室自制品，批號(hào)：20150907，規(guī)格：100 mg/2 ml）；疊氮化鈉（上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司，分析純）；水為超純水（四川抗菌素工業(yè)研究所實(shí)驗(yàn)室自制）。

2　方法與結(jié)果

2.1溶液的制備

2.1.1對(duì)照品A溶液分別精密稱(chēng)取系列葡聚糖對(duì)照品，加流動(dòng)相溶解并稀釋制成10 mg/ml的溶液，用0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，即得。

2.1.2對(duì)照品B溶液精密稱(chēng)取右旋糖酐對(duì)照品（D0），加流動(dòng)相溶解并稀釋制成10 mg/ml的溶液，用0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，即得。

2.1.3羧基麥芽糖鐵注射液溶液精密量取羧基麥芽糖鐵注射液1 ml，置于50 ml量瓶中，加流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，搖勻，用0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，即得。

2.1.4羧基麥芽糖鐵原料溶液取羧基麥芽糖鐵原料，加流動(dòng)相溶解，稀釋制成含鐵（Fe）1 mg/ml的溶液，搖勻，即得。

2.2色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

以TSK G4000 PWXL（300 mm×7.8 mm，10μm）為色譜柱，以0.1%疊氮化鈉溶液為流動(dòng)相，柱溫為35℃，流速為0.5 ml/min，采用示差折光檢測(cè)器；理論板數(shù)按葡萄糖峰（即右旋糖酐D0對(duì)照品峰）計(jì)算，應(yīng)不小于5 000，標(biāo)樣為已知分子質(zhì)量的系列葡聚糖對(duì)照品。

2.3標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制作

取對(duì)照品A溶液，按2015年版《中國(guó)藥典》（二部）［1］附錄ⅤH分子排阻色譜法測(cè)定，取20 μl注入液相色譜儀中，記錄色譜圖及保留時(shí)間，結(jié)合已知的葡聚糖對(duì)照品的Mw，以lgMi對(duì)tRi作圖，結(jié)果見(jiàn)圖1?；貧w方程為lgMi=0.33tRi-10.48，相關(guān)系數(shù)r 為0.999 8。

圖1　標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)Fig 1　Standard curves

2.4專(zhuān)屬性試驗(yàn)

取“2.1.4”項(xiàng)下的羧基麥芽糖鐵原料溶液和空白溶劑（流動(dòng)相），分別按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣20 μl檢測(cè)，空白溶劑譜圖在羧基麥芽糖鐵色譜峰保留時(shí)間處無(wú)色譜峰出現(xiàn)，說(shuō)明溶劑無(wú)干擾。

2.5精密度試驗(yàn)

取對(duì)照品A溶液中的葡聚糖對(duì)照品Mw值為147 600的對(duì)照品溶液，進(jìn)樣質(zhì)量濃度為10 mg/ml，按“2.2”項(xiàng)下的方法連續(xù)測(cè)定6次，記錄色譜圖。Mw值測(cè)定結(jié)果分別為147 000、148 000、147 200、146 500、146 800、147 000，平均值為147 083，RSD 為0.34%（n=6），說(shuō)明本測(cè)定方法精密度好。

2.6穩(wěn)定性考察

取羧基麥芽糖鐵原料，加流動(dòng)相制成質(zhì)量濃度為10 mg/ ml的溶液，按“2.2”項(xiàng)下的方法測(cè)定溶液在24 h內(nèi)的穩(wěn)定性，記錄色譜圖。結(jié)果，0、2、4、8、12、16、20、24 h Mw分別為162 000、160 000、160 000、161 000、162 000、161 000、160 000、160 000，RSD為0.55%（n=8），說(shuō)明樣品溶液在24 h內(nèi)測(cè)定是穩(wěn)定的。

2.7重復(fù)性試驗(yàn)

取羧基麥芽糖鐵原料6份，分別加流動(dòng)相制成質(zhì)量濃度為10 mg/ml的溶液，按“2.2”項(xiàng)下的方法測(cè)定，記錄色譜圖。Mw值測(cè)定結(jié)果分別為161 000、162 000、161 000、160 000、160 000、161 000，RSD為0.47%（n=6），說(shuō)明測(cè)定方法重復(fù)性好。

2.8耐用性考察

取“2.1.2”項(xiàng)下系統(tǒng)適用性溶液，采用安捷倫1200高效液相色譜儀、安捷倫示差折光檢測(cè)器、賽分科技SRT?SEC-100凝膠色譜柱（300 mm×7.8 mm，10 μm），按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣20 μl測(cè)定，樣品Mw與D的測(cè)定結(jié)果和TSK G4000 PWXL色譜柱相比無(wú)明顯差別，證明該方法耐用性良好。

2.9樣品測(cè)定

按2015年版《中國(guó)藥典》（二部）［1］附錄ⅤH分子排阻色譜法測(cè)定，Mw應(yīng)在115 000～175 000之間，D應(yīng)小于2.0。取本品適量，加流動(dòng)相稀釋成每1 ml約含10 mg的溶液，搖勻，濾過(guò)，作為供試品溶液。取20μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，采用GPC專(zhuān)用軟件計(jì)算出供試品的Mw與D。取羧基麥芽糖鐵注射液3份及羧基麥芽糖鐵原料3份，按“2.2”項(xiàng)下方法測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1　羧基麥芽糖鐵重均分子質(zhì)量及分子質(zhì)量分布檢測(cè)結(jié)果Tab 1　Mwand D of ferric carboxymaltose

表1結(jié)果顯示，自制品的Mw、D與進(jìn)口樣品基本一致。

3　討論

3.1檢測(cè)器的選擇

示差折光檢測(cè)器是一種通用型檢測(cè)器，具有廣泛的適用范圍；同時(shí)該檢測(cè)器對(duì)糖類(lèi)檢測(cè)靈敏度較高、穩(wěn)定性好、操作方便。另查閱2015年版《中國(guó)藥典》（二部）［1］，絕大多數(shù)天然高分子藥物或者高分子聚合物藥物的檢測(cè)均使用示差折光檢測(cè)器，故選擇其作為本研究的檢測(cè)器。

3.2流動(dòng)相比例的選擇

凝膠色譜的分離原理是分子篩原理，根據(jù)分子的大小不同進(jìn)行分離。羧基麥芽糖鐵注射液pH值介于5.0～6.5之間，確定具有一定離子強(qiáng)度的0.1%疊氮化鈉溶液為流動(dòng)相，既可以減少樣品在柱上的吸附，也可防止在色譜分離過(guò)程中樣品分子之間相互締合，以保持其溶液中正常的分子形態(tài)。

3.3分子排阻色譜法

凝膠色譜技術(shù)又稱(chēng)分子排阻色譜法，是20世紀(jì)60年代初發(fā)展起來(lái)的一種快速、簡(jiǎn)單的分離分析技術(shù)，主要用于高聚物的相對(duì)分子質(zhì)量分級(jí)分析以及相對(duì)分子質(zhì)量分布測(cè)試［4］。分子排阻色譜法是根據(jù)待測(cè)組分的分子大小進(jìn)行分離的一種液相色譜技術(shù)。分子排阻色譜法的分離原理為凝膠色譜柱的分子篩機(jī)制。色譜柱多以親水硅膠、凝膠或經(jīng)修飾凝膠如葡聚糖凝膠（Sephadex）和聚丙烯酰胺凝膠（Sepharose）等為填充劑，這些填充劑表面分布著不同尺寸的孔徑，藥物分子進(jìn)入色譜柱后，其中的不同組分按其分子大小進(jìn)入相應(yīng)的孔徑內(nèi)，大于所有孔徑的分子不能進(jìn)入填充劑顆粒內(nèi)部，在色譜過(guò)程中不被保留，最早被流動(dòng)相洗脫至柱外，表現(xiàn)為保留時(shí)間較短；小于所有孔徑的分子能自由進(jìn)入填充劑表面的所有孔徑，在色譜柱中滯留時(shí)間較長(zhǎng)，表現(xiàn)為保留時(shí)間較長(zhǎng)；其余分子則按分子大小依次被洗脫。

3.4羧基麥芽糖鐵Mw與D的控制

羧基麥芽糖鐵屬于高分子聚合物的范疇，所以Mw與D是該品種質(zhì)量控制的重要指標(biāo)，在一定程度上可以反映出國(guó)產(chǎn)樣品與進(jìn)口上市品之間的質(zhì)量差異。在靜脈補(bǔ)鐵劑第一代產(chǎn)品右旋糖酐鐵注射液的臨床使用過(guò)程中，過(guò)敏反應(yīng)是主要的不良反應(yīng)，主要為過(guò)敏性休克和過(guò)敏性皮炎，也有過(guò)敏反應(yīng)引起死亡的報(bào)道［3］。章蘊(yùn)毅等［5］報(bào)道，制劑1中右旋糖酐鐵峰位分子質(zhì)量約為15萬(wàn)，而制劑2的峰位分子質(zhì)量約為42萬(wàn)，兩者差別巨大。因此，可推測(cè)制劑1吸收快，在體內(nèi)分布利用也快［5］。作為一種大分子多聚物的注射液，羧基麥芽糖鐵注射液與右旋糖酐鐵注射液一樣，其分子質(zhì)量的大小與產(chǎn)品的致敏性以及體內(nèi)吸收和分布有直接關(guān)系。一般不建議樣品的分子質(zhì)量過(guò)大，因?yàn)闀?huì)增加其在體內(nèi)安全性方面的風(fēng)險(xiǎn)。

由于2015年版《中國(guó)藥典》（二部）［1］的右旋糖酐原料和注射液標(biāo)準(zhǔn)中只規(guī)定測(cè)定右旋糖酐的分子質(zhì)量與D，而2009版《英國(guó)藥典》［2］未對(duì)分子質(zhì)量與D進(jìn)行規(guī)定。《中國(guó)藥典》的方法為將右旋糖酐鐵水解，測(cè)定右旋糖酐的分子質(zhì)量。右旋糖酐本身為葡萄糖聚合物，水解是否對(duì)其結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響、水解前后的分子質(zhì)量是否一致、不同的絡(luò)合工藝在此水解條件下是否完全，有待研究。進(jìn)口藥品標(biāo)準(zhǔn)考察的是整個(gè)右旋糖酐鐵絡(luò)合物的分子質(zhì)量，從對(duì)人體組織吸收的角度看，更合理些［6］。另外，由于各個(gè)生產(chǎn)企業(yè)工藝控制的差異，僅僅通過(guò)控制起始原料的分子質(zhì)量，應(yīng)不能完全控制最終產(chǎn)品右旋糖酐鐵的分子質(zhì)量的范圍［7-8］。同理，羧基麥芽糖鐵作為右旋糖酐鐵的升級(jí)換代產(chǎn)品，其Mw與D仍然是其質(zhì)量控制的重要指標(biāo)，故建議在廠(chǎng)家生產(chǎn)羧基麥芽糖鐵原料及注射液時(shí)應(yīng)由廠(chǎng)家自行增加Mw與D項(xiàng)的檢測(cè)，以更好地控制產(chǎn)品質(zhì)量，降低其安全性風(fēng)險(xiǎn)。

4　結(jié)語(yǔ)

目前供臨床使用的靜脈補(bǔ)鐵劑有以下7種：高分子右旋糖酐鐵、低分子右旋糖酐鐵、葡萄糖酸鈉鐵、蔗糖鐵、羧基麥芽糖鐵、Ferumoxytol、Iron isomal-toside 1000。所有的靜脈補(bǔ)鐵劑均為膠體溶液，化學(xué)機(jī)構(gòu)大體相近，均由鐵-碳水化合物納米微粒組成，微粒中心為氫氧化鐵核心，不同的糖類(lèi)配體包裹形成外殼，糖類(lèi)配體外殼可以穩(wěn)定鐵核心，控制鐵的釋放，維持微粒處于懸浮的膠體狀態(tài)。核心大小的不同及糖類(lèi)配體構(gòu)成、密度上的差異決定了不同鐵劑的藥理生物學(xué)的不盡相同［9］。所以，Mw與D將成為該類(lèi)藥物最重要的質(zhì)量控制指標(biāo)之一。黃一新等［10］報(bào)道，靜脈鐵劑在治療血液透析貧血患者鐵缺乏時(shí)安全有效，并優(yōu)于口服鐵劑［10］；徐維國(guó)等［11］報(bào)道，靜脈注射右旋糖酐鐵可有效糾正消化性潰瘍出血致缺鐵性貧血患者的鐵缺乏、提高鐵利用率，且不良反應(yīng)發(fā)生率低、患者依從性好［11］。相信隨著新型靜脈補(bǔ)鐵劑不斷進(jìn)入國(guó)內(nèi)外臨床，其今后會(huì)有更加廣闊的應(yīng)用前景［8］。

綜上所述，該方法精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性、專(zhuān)屬性和耐用性均較好，且操作簡(jiǎn)便，可用于羧基麥芽糖鐵Mw和D的檢測(cè)。

［1］國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典：二部［S］.2015年版.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2015：171-172.

［2］ British Pharmacopoeia Commission.British Pharmacopoeia：VolumeⅡ：2000［M］.London：the Stationery Office，2009：2 040-2 041.

［3］程春雷，范治云，祝清芬，等.右旋糖酐鐵注射液不良反應(yīng)文獻(xiàn)分析［J］.中國(guó)藥業(yè)，2013，22（8）：79.

［4］楊立偉，肖樹(shù)雄，謝海燕，等.凝膠色譜法測(cè)定參芪扶正注射液中的高分子物質(zhì)［J］.中國(guó)藥房，2011，22（15）：1 400.

［5］章蘊(yùn)毅，李佩芬，杜一鳴，等.2種右旋糖酐鐵給藥后的家兔體內(nèi)血清鐵濃度及毒性比較［J］.中國(guó)新藥與臨床雜志，2005，24（6）：444.

［6］萬(wàn)丹晶，陳妙芬，陳鋼.右旋糖酐鐵注射液峰位相對(duì)分子質(zhì)量和重均相對(duì)分子質(zhì)量的HPGPC測(cè)定［J］.藥物分析雜志，2007，27（5）：708.

［7］翟晨淏，陳東英，郜盡.右旋糖酐鐵注射液中右旋糖酐鐵峰位相對(duì)分子質(zhì)量的測(cè)定［J］.中國(guó)新藥與臨床雜志，2005，24（6）：438.

［8］范慧紅，劉金秀，徐康森.高效凝膠滲透色譜法在右旋糖酐鐵質(zhì)控中的應(yīng)用［J］.藥物分析雜志，2000，20（4）：254.

［9］毛凱，馬怡璇，潘紅春，等.新型靜脈補(bǔ)鐵劑的研究進(jìn)展［J］.中國(guó)新藥雜志，2015，24（6）：659.

［10］黃一新，張政，黃振飛，等.靜脈注射右旋糖酐鐵優(yōu)于口服琥珀酸亞鐵治療血液透析鐵缺乏貧血［J］.中國(guó)新藥與臨床雜志，2003，22（7）：420.

［11］徐維國(guó)，崔蓉，冷小輝.靜脈用右旋糖酐鐵注射液治療消化性潰瘍出血患者缺鐵性貧血的臨床研究［J］.四川省衛(wèi)生管理干部學(xué)院學(xué)報(bào)，2007，26（4）：241.

（編輯：余慶華）

Determination of Weight Average Molecular Weight and Molecular Weight Distribution of Ferric Carboxymaltose by HPGPC

LI Qiangwei，LI Qiang，ZHENG Yun，ZHOU Liang
（Key Laboratory of Medicinal and Edible Plants Resources Development of Sichuan Education Department/Sichuan Industrial Institute of Antibiotics/Chengdu University，Chengdu 610052，China）

OBJECTIVE：To establish a method for the determination of weight average molecular weight（Mw）and molecular weight distribution（D）of ferric carboxymaltose.METHODS：HPGPC method was adopted to detect the Mwand D of 3 batches of Ferric carboxymaltose injection（imported）and its raw material（self-made）.The determination was performed on TSK G4000 PWXL column with 0.1%sodium azide solution with the flow rate of 0.5 ml/min.The detector was refractive index detector；the column temperature was set at 35℃，and sample size was 20μl.The results were calculated with GPC software.RESULTS：RSDs of precision，stability and reproducibility tests were all lower than 3.0%（n=6）；Mwand D of 3 imported samples were 157 667 and 1.30；those of self-made samples were 162 000 and 1.42.CONCLUSIONS：The method has high precision，good stability，repeatability and durability.It can be used for the determination of Mwand D of ferric carboxymaltose.

HPGPC method；Ferric carboxymaltose；Weight average molecular weight；Molecular weight distribution

R917

A

1001-0408（2016）22-3066-03

10.6039/j.issn.1001-0408.2016.22.13

藥食同源植物資源開(kāi)發(fā)四川省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放基金項(xiàng)目（No.10Y201504）

＊助理研究員。研究方向：藥物制劑、藥物分析。電話(huà)：028-84216070。E-mail：liqiangwei@cdu.edu.cn

助理研究員。研究方向：藥物合成。電話(huà)：028-84216070。E-mail：liqiang@cdu.edu.cn

2015-12-17

2016-05-06）