于姣姣（綜述）　趙 云（審校）

高分子材料超聲微泡的應(yīng)用研究

于姣姣（綜述）趙 云（審校）

超聲檢查；造影劑；聚合物；綜述

自1968年Gramiak等［1］首次報(bào)道將自制微泡應(yīng)用于臨床超聲心動(dòng)圖檢查以來(lái)，超聲微泡的制備技術(shù)日益革新、應(yīng)用研究不斷擴(kuò)大。目前所用超聲微泡均由外膜和其包裹的氣體所構(gòu)成，直徑均小于8 μm，可通過(guò)肺毛細(xì)血管循環(huán)，在超聲作用下被激發(fā)，產(chǎn)生較強(qiáng)的回波反射性能，從而增強(qiáng)組織回聲，提高組織顯影的清晰度。此外，微泡可作為一種靶向基因或藥物治療的載體，減小對(duì)周?chē)＝M織的損傷，并增強(qiáng)腫瘤治療效果。超聲微泡主要以非離子表面活性劑、蛋白質(zhì)類(lèi)、脂類(lèi)、高分子多聚物等為外膜包裹氟碳?xì)怏w。蛋白質(zhì)類(lèi)是最早的微泡外膜材料，近年來(lái)，以SonoVue為代表的脂質(zhì)微泡應(yīng)用較為廣泛，微泡外膜的穩(wěn)定性及臨床應(yīng)用的高效和安全性仍在探索優(yōu)化中。高分子材料超聲微泡尚未應(yīng)用于臨床，但隨著高分子化學(xué)的發(fā)展，以高分子材料為膜的超聲微泡具有外殼堅(jiān)硬、抗壓性強(qiáng)、穩(wěn)定性高、并能在體內(nèi)自然降解、減少藥物對(duì)人體的毒副反應(yīng)等特點(diǎn)，成為研究的熱點(diǎn)［2］。高分子材料超聲微泡載藥載基因及良好的顯影優(yōu)勢(shì)，在疾病的早期定性、定位診斷及靶向治療的研究中受到更多的關(guān)注。本文擬對(duì)高分子材料超聲微泡的制備、載藥載基因及對(duì)疾病的診療做一綜述，以使更多學(xué)者進(jìn)一步了解高分子材料超聲微泡的現(xiàn)狀及發(fā)展趨勢(shì)，從而加快其應(yīng)用于臨床。

1　高分子材料超聲微泡制備技術(shù)

高分子材料又稱(chēng)為聚合物材料，是以高分子化合物為基體，并配有其他添加劑組成的材料，其作為成膜物質(zhì)的分子量一般在5000以上。目前已應(yīng)用的高分子材料有乳酸羥基乙酸共聚物（PLGA）、多聚糖、聚己內(nèi)酯、聚乙烯乙二醇、聚乳糖等，其中PLGA是經(jīng)美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）批準(zhǔn)而應(yīng)用較為廣泛的一類(lèi)超聲微泡材料［3-4］。根據(jù)高分子聚合物及藥物的不同性質(zhì)，其超聲微泡的制備方法也有很多，目前以采用改良雙乳劑揮發(fā)法與冷凍干燥技術(shù)相結(jié)合的方法較多見(jiàn)［3］。制備時(shí)將高分子多聚物溶解于有機(jī)溶劑中，加入一定的水溶液，通過(guò)機(jī)械攪拌和超聲波振蕩形成油包水初乳，再加入含穩(wěn)定劑的水溶液中，通過(guò)勻質(zhì)機(jī)的乳化作用形成復(fù)乳，然后加入相關(guān)溶液，在磁力攪拌機(jī)作用下使有機(jī)溶劑揮發(fā)，再利用真空冷凍干燥技術(shù)除去水分，加入氟碳?xì)怏w即可得到高分子材料包裹氣體的超聲微泡。

盡管上述制備技術(shù)對(duì)高分子材料超聲微泡，尚未針對(duì)臨床進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)，但相對(duì)于蛋白質(zhì)類(lèi)微泡常使用的乳化固化法及以表面活性劑和磷脂為成膜材料的微泡曾采用的聲振空化法，克服了上述方法不能很好地控制微泡的聲學(xué)性能和理化性質(zhì)這一缺點(diǎn)，而且該制備方法與常規(guī)微泡造影劑不同，更適于載藥或載基因。近年來(lái)，改變高分子材料的種類(lèi)，采用不同聚合條件，調(diào)節(jié)制備過(guò)程中的各項(xiàng)性能參數(shù)，以及利用微泡攜帶不同藥物或基因，已成為超聲微泡造影劑研究的主要方向。

2　高分子材料超聲微泡載藥或載基因制備

近年來(lái)，高分子材料作為超聲微泡包膜用于載藥或載基因方面的研究較多。Hou等［5］以聚乳酸為外膜，包裹10-羥基喜樹(shù)堿，成功制得載藥微泡，藥物包封率達(dá)62.2%，載藥量達(dá)1.69%，其體外試驗(yàn)中，超聲聯(lián)合載藥微泡提高細(xì)胞膜的通透性，增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)藥物吸收。Teng等［6］選擇mPEGPLGA-PLL為成膜材料包載乳腺癌耐藥蛋白-siRNA制得納米微泡，基因包封率高于98%，在體外試驗(yàn)中，利用超聲靶向破壞微泡，siRNA得到有效轉(zhuǎn)染，與裸siRNA相比，相應(yīng)蛋白表達(dá)顯著下調(diào)。Deng等［7］制備以PLGA為外膜包裹阿霉素的納米微泡，電鏡下微泡分布均勻，表面光滑，平均粒徑為（270±3）nm。在體外試驗(yàn)中，該載藥微泡比單獨(dú)使用阿霉素對(duì)HeLa細(xì)胞生長(zhǎng)表現(xiàn)出更大的抑制作用。Chen等［8］設(shè)計(jì)了天然高分子聚合物環(huán)糊精和低分子量聚乙烯亞胺（PEI）的納米載體，包封反義寡聚核苷酸的Bcl-xl，轉(zhuǎn)染人肺腺癌細(xì)胞，結(jié)果表明，該載體有效抑制Bcl-xl mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并優(yōu)于分枝狀PEI（25 kD）和脂質(zhì)體2000。Luo等［9］將兩親性的高分子聚合物合成納米微泡，并在表面連接乳鐵蛋白，通過(guò)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)超聲成像的評(píng)估，與SonoVue微泡相比對(duì)腫瘤的顯影效果更強(qiáng)、更持久。

高分子材料作為微泡的包膜具有較高的負(fù)載能力和良好的生物相容性。此外，構(gòu)成共聚物兩嵌段的疏水端和親水端結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，易于改造。共聚物疏水端與相容性較高的藥物結(jié)合，可有效提高微泡載藥量和穩(wěn)定性，親水端通過(guò)避免網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)對(duì)微泡的識(shí)別，使其在體內(nèi)的半衰期延長(zhǎng)，可連接水溶性物質(zhì)和靶向基因。因此，高分子材料微泡更適宜作為基因或藥物的載體。高分子超聲微泡攜帶藥物或基因的方式主要存在以下幾種（圖1）［10］：①基因或藥物附著于微泡表面；②基因或藥物直接作為微泡外膜材料的成分；③基因或藥物嵌入雙分子層微泡的內(nèi)外膜之間；④基因或藥物包裹在微泡內(nèi)部；⑤利用靜電相互作用，基因或藥物被非共價(jià)結(jié)合至微泡表面。超聲設(shè)備參數(shù)與微泡相關(guān)特性參數(shù)的設(shè)定、藥物的溶解性及藥物或基因與微泡的連接方式均可能影響微泡攜藥能力及基因轉(zhuǎn)染效率。目前，高分子材料微泡在載藥載基因方面的研究與臨床應(yīng)用并不如脂質(zhì)微泡廣泛，但是脂質(zhì)微泡的單層殼膜載藥能力有限，常難以達(dá)到腫瘤治療所需的有效劑量，高分子聚合物可以通過(guò)調(diào)節(jié)其聚合比例改變微泡的直徑及釋放速度，載藥量有所提高，且更易制得納米級(jí)微泡，同時(shí)高分子材料易進(jìn)行表面修飾，攜帶特異性抗體或基因，其靶向性更強(qiáng)，在臨床應(yīng)用中具有更廣闊的前景。

圖1　微泡攜帶藥物或基因的幾種方式。圖片摘自參考文獻(xiàn)［10］

3　高分子材料超聲微泡診斷研究

超聲微泡通過(guò)靜脈注射后，可隨體內(nèi)血液循環(huán)到達(dá)各組織器官，因內(nèi)含氣體易于壓縮和膨脹，在超聲場(chǎng)下產(chǎn)生較強(qiáng)的回波反射性能，可以顯著增強(qiáng)組織回聲及醫(yī)學(xué)超聲檢測(cè)信號(hào)。早期研究發(fā)現(xiàn)，激活的單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞在黏附吞噬微泡以后，微泡仍然完好無(wú)損，且可以保持超聲聲學(xué)特性不變，因此可以通過(guò)超聲微泡顯影發(fā)現(xiàn)炎癥的發(fā)生部位［11］。Wang等［12］已使用P和E選擇素靶向超聲微泡，在小鼠急性結(jié)腸炎模型中對(duì)炎癥水平進(jìn)行檢測(cè)和定量。Schumann等［13］研究發(fā)現(xiàn)微泡表面結(jié)合特異性寡肽，可識(shí)別血小板糖蛋白IIb/IIIa受體，活化連接位點(diǎn)，黏附在新鮮血栓表面使血栓顯影，提高血栓檢出率。此后，有較多學(xué)者對(duì)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體2（VEGFR2）這一靶點(diǎn)進(jìn)行研究。Bachawal等［14］將VEGFR2作為靶點(diǎn)與超聲微泡結(jié)合，在小鼠乳腺癌中成像信號(hào)顯著增加，提高了超聲早期檢測(cè)小鼠乳腺癌和乳腺導(dǎo)管原位癌的診斷準(zhǔn)確率，并為女性早期乳腺癌的檢測(cè)奠定了基礎(chǔ)。Mancini等［15］的實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，攜帶抗VEGFR2單克隆抗體的靶向超聲微泡可用于體內(nèi)非侵入性的早期癌癥的檢測(cè)和量化，VEGFR2在小鼠甲狀腺癌中的表達(dá)，并可以此來(lái)區(qū)分甲狀腺結(jié)節(jié)的良惡性。

隨著超聲醫(yī)學(xué)與現(xiàn)代分子生物學(xué)的交叉發(fā)展，在超聲微泡表面結(jié)合特異性配體，通過(guò)體內(nèi)配體與受體選擇性的結(jié)合，使微泡到達(dá)特定部位增強(qiáng)顯影，從而提高超聲的診斷水平。常規(guī)微泡由于其直徑范圍易停留于血液系統(tǒng)而不穿過(guò)血管內(nèi)皮組織間隙，對(duì)于血管內(nèi)病變?nèi)缪装Y、血栓、新生血管等的成像有較大優(yōu)勢(shì)。在炎癥發(fā)生過(guò)程中，組織異常表達(dá)某些標(biāo)志分子，而將微泡表面耦連上能識(shí)別這些配體的受體，使微泡選擇性地滯留于炎癥病灶的局部，即可增強(qiáng)炎癥部位的超聲顯像。形成血栓的血小板表面可表達(dá)較高濃度的糖蛋白IIb/IIIa受體，對(duì)微泡表面物質(zhì)加以修飾或成分加以改變，可提高微泡與血栓的親和力，使微泡到達(dá)血栓內(nèi)部，同樣能實(shí)現(xiàn)超聲下血栓顯像的增強(qiáng)。腫瘤新生血管過(guò)程中，血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)大量黏附分子、生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子等［16］，成為超聲微泡的作用位點(diǎn)，從而增強(qiáng)腫瘤血管和組織的顯影。納米級(jí)微泡的出現(xiàn)，以其獨(dú)特的尺寸和較高的穿透力，能通過(guò)血管進(jìn)入腫瘤，以區(qū)分病變組織和正常組織，從而大大提高了超聲對(duì)腫瘤診斷的準(zhǔn)確性。盡管脂質(zhì)微泡不必受?chē)?yán)格條件控制，比蛋白類(lèi)微泡更易連接其配體，比高分子材料微泡聲學(xué)響應(yīng)性更好，但高分子材料微泡穩(wěn)定性更好，在體內(nèi)顯影時(shí)間更長(zhǎng)，在疾病的診斷方面優(yōu)勢(shì)明顯。

4　高分子材料超聲微泡靶向治療研究

在靶向超聲造影技術(shù)發(fā)展中，越來(lái)越多的學(xué)者致力于超聲微泡對(duì)腫瘤的靶向治療，開(kāi)發(fā)新的治療靶點(diǎn)及藥物等方面的研究。Rapoport等［17］制備PLLA-PEG為膜包裹紫杉醇的微泡，與吉西他濱聯(lián)合用藥，作用于接種過(guò)人胰腺癌MiaPaCa-2細(xì)胞（癌細(xì)胞經(jīng)紅色熒光蛋白標(biāo)記）的小鼠，在1 MHz超聲輻射下，其對(duì)胰腺癌治療效果明顯。Niu等［18］在抗腫瘤藥物研究中，以PLGA微泡包封氧化鐵納米顆粒和化療藥物（阿霉素）制得多功能聚合物微泡（圖2），并將接種過(guò)VX2腫瘤的家兔隨機(jī)分為生理鹽水對(duì)照組、空白微泡組、單獨(dú)阿霉素組、空白微泡聯(lián)合超聲組、阿霉素聯(lián)合超聲組和多功能聚合物微泡聯(lián)合超聲組，通過(guò)組織學(xué)和免疫組化檢查對(duì)其抗腫瘤作用進(jìn)行評(píng)估發(fā)現(xiàn)，多功能聚合物微泡聯(lián)合超聲組中增殖指數(shù)、微血管密度和微淋巴管密度計(jì)數(shù)均較其他組顯著降低，凋亡指數(shù)較其他組顯著增高，表明超聲微泡在介導(dǎo)化療藥物抗腫瘤治療方面具有積極有效的作用。Sorace等［19］利用微泡攜帶紫杉醇注射于患乳腺癌的小鼠體內(nèi)，超聲輻射瘤體，發(fā)現(xiàn)化療藥物聯(lián)合超聲微泡抑制腫瘤生長(zhǎng)并提高癌細(xì)胞死亡率。靶向超聲微泡的治療能夠通過(guò)增加局部藥物的吸收，提高患者對(duì)化療的耐受性，從而降低化療藥物的劑量和全身毒性。Li等［20］研究發(fā)現(xiàn)，采用mPEG-PLGA-PLL三嵌段共聚物為材料的納米微泡攜帶針對(duì)人VEGF的siRNA，并在表面連接相關(guān)配體，可識(shí)別在PC-3前列腺癌細(xì)胞中高表達(dá)的整合素αvβ3，利用超聲靶向破壞微泡，能夠使PC-3細(xì)胞中的VEGF表達(dá)下調(diào)，抑制腫瘤細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，與對(duì)照組相比顯示出較低的細(xì)胞毒性和較高的基因轉(zhuǎn)染效率。Zhang等［21］以PLGA為材料包裹氨甲蝶呤制得納米微泡，并將單克隆抗-HLA-G抗體連接于微泡表面，注射于患絨毛膜癌的裸雌鼠體內(nèi)，高強(qiáng)度聚焦超聲輻照后，發(fā)現(xiàn)從微泡內(nèi)靶向釋放氨甲蝶呤，作用于腫瘤細(xì)胞發(fā)生最嚴(yán)重的凝固性壞死、最低的增殖指數(shù)和最高的凋亡指數(shù)。高強(qiáng)度聚焦超聲聯(lián)合包載化療藥物的靶向微泡可以最大限度地治愈腫瘤和阻止腫瘤在高強(qiáng)度聚焦超聲消融后復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移。微泡的特殊物理聲學(xué)性質(zhì)已成為用于高強(qiáng)度聚焦超聲增效治療腫瘤的研究熱點(diǎn)［22］。

圖2　包載化療藥物的多功能微泡的結(jié)構(gòu)及其在超聲介導(dǎo)下抗腫瘤治療。圖片摘自參考文獻(xiàn)［18］

在諸多實(shí)驗(yàn)研究中，攜帶藥物或基因的超聲微泡造影劑到達(dá)靶組織或靶器官后，在超聲波的照射下發(fā)生空化效應(yīng)，當(dāng)超聲波能量達(dá)到一定強(qiáng)度時(shí)，微泡破裂，藥物或基因被釋放，在病灶局部濃度升高，達(dá)到體內(nèi)定點(diǎn)釋放和靶向治療的目的［23］。此外，由于超聲的空化效應(yīng)，微泡在發(fā)生破裂時(shí)產(chǎn)生的高速微射流、高能沖擊波和巨大切應(yīng)力，能使細(xì)胞膜的通透性增強(qiáng)，內(nèi)皮細(xì)胞間隙增大，更有利于藥物的吸收和基因的轉(zhuǎn)染。近年來(lái)，隨著人類(lèi)基因組及分子生物的發(fā)展，基因治療將目的基因?qū)胩囟ǖ慕M織或細(xì)胞并進(jìn)行表達(dá)，以治療因基因異?；蛉毕菟鸬募膊?，在人類(lèi)疾病的治療上具有無(wú)可爭(zhēng)議的前景，成為醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。然而，裸露的基因治療藥物卻存在以下缺點(diǎn)［24］：①易被核酸酶降解；②在血液中半衰期短，降解快；③缺乏靶向性，細(xì)胞吸收率低；④自身負(fù)電荷與細(xì)胞膜上的負(fù)電荷相互排斥，致使其通過(guò)細(xì)胞內(nèi)吞作用入胞能力及逃離內(nèi)涵體能力較差。上述缺點(diǎn)均影響基因治療的效果。因此，需要尋求恰當(dāng)?shù)妮d體來(lái)攜帶基因治療藥物，以克服基因治療過(guò)程中所遇到的問(wèn)題，從而提高靶向治療效果。病毒載體雖然轉(zhuǎn)染率高，但其在體內(nèi)存在的安全性問(wèn)題受到高度關(guān)注［25-26］，大規(guī)模的生產(chǎn)也將很難實(shí)現(xiàn)。高分子材料微泡使藥物釋放時(shí)間及降解時(shí)間延長(zhǎng)，并減少藥物毒性及對(duì)組織的損傷，其作為基因或藥物載體，在體內(nèi)及體外實(shí)驗(yàn)中均表現(xiàn)出良好的靶向釋藥能力及藥物治療作用［27］。近來(lái)，光熱治療（利用光熱轉(zhuǎn)換試劑從吸收的光產(chǎn)生的熱能有效地治療各種惡性疾?。┖投喙δ芨叻肿釉煊皠┑奶剿饕仓饾u興起，趙雅靜等［28］構(gòu)建了一種具有超聲和磁共振雙模態(tài)顯像的可相變的高分子造影劑，在溫度作用下發(fā)生相變可增強(qiáng)雙模態(tài)顯像效果；并在體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中采用近紅外光誘導(dǎo)光熱治療，以增強(qiáng)腫瘤消融，也取得了一定的效果［29］。由于高分子材料微泡外殼較硬，在治療方面，脂質(zhì)微泡在較低的聲學(xué)輸出下即能引起微泡破裂，達(dá)到治療效果，對(duì)超聲具有更強(qiáng)的反應(yīng)靈敏性，但脂質(zhì)微泡在體內(nèi)穩(wěn)定性差、維持時(shí)間短、易受網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)吞噬。高分子材料微泡在體內(nèi)粒徑分布更集中，生物降解性良好，耐受性好，不僅克服了脂質(zhì)微泡的不足，而且對(duì)組織具有更強(qiáng)的特異性和靶向性，將會(huì)盡可能在治療中減少其對(duì)正常組織、血管和細(xì)胞的損害，使其更具有潛力應(yīng)用于臨床治療。

5　問(wèn)題與展望

高分子材料超聲微泡在組織顯像及載藥載基因?qū)膊〉脑\斷與治療方面已經(jīng)取得一定的成果，但其仍然存在一些亟需解決的問(wèn)題：①高分子材料作為外殼，在低機(jī)械指數(shù)的超聲造影下顯影較差；②多聚體材料在體內(nèi)可自然降解，但其降解過(guò)程較慢，易停留于血管影響局部血液循環(huán)；③超聲輻照下對(duì)微泡的破壞、各項(xiàng)參數(shù)設(shè)置不當(dāng)，也可能對(duì)鄰近組織產(chǎn)生損傷；④以高分子材料為膜其成本較高，在生產(chǎn)使用中可存在一定的限制。盡管在疾病的診斷與治療中，很多方面仍處于實(shí)驗(yàn)室階段，但高分子材料超聲微泡的穩(wěn)定性、安全性、可塑性、有效性等特點(diǎn)所存在的潛力，將使其具有良好的臨床應(yīng)用前景。

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10.3969/j.issn.1005-5185.2016.07.022

R445.1

2015-12-01

2016-04-17

（本文編輯 張春輝）

三峽大學(xué)醫(yī)學(xué)院 湖北宜昌 443002

趙 云 E-mail： zhaoyun@ctgu.edu.cn