杜海燕　河南省新鄉(xiāng)市動物疫病預(yù)防控制中心　453000韓俊偉　河南省新鄉(xiāng)市動物衛(wèi)生監(jiān)督所　453000

一例豬圓環(huán)病毒與高致病性豬藍(lán)耳病混合感染的診斷

杜海燕河南省新鄉(xiāng)市動物疫病預(yù)防控制中心453000
韓俊偉河南省新鄉(xiāng)市動物衛(wèi)生監(jiān)督所453000

豬圓環(huán)病毒病主要是以圓環(huán)病毒2-型為病原，常引起以體質(zhì)下降、消瘦、腹瀉、呼吸困難、免疫抑制和多病原繼發(fā)感染為主要特征的一類病毒性傳染病。高致病性豬藍(lán)耳病是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒引起的一種高度接觸性傳染病，以成年豬生殖障礙、早產(chǎn)、流產(chǎn)、死胎，以及呼吸異常為特征。豬藍(lán)耳病和豬圓環(huán)病毒均是引起豬群免疫抑制的疾病，二者混合感染可導(dǎo)致更高的發(fā)病率和死亡率。2015年10月某豬場送檢2頭病死豬組織，經(jīng)實驗室診斷為豬圓環(huán)病毒和豬高致病性藍(lán)耳病混合感染。

1　發(fā)病情況

據(jù)畜主反映，發(fā)病豬多為初產(chǎn)母豬，死亡率達(dá)30%。送檢1號豬產(chǎn)前正常，分娩過程3～4小時，產(chǎn)后3天陰道有白色分泌物流出，隨后用催產(chǎn)素、阿莫西林、魚腥草、復(fù)合維生素B等治療無效，8天后死亡。剖檢可見整個胸、腹腔有消化道內(nèi)容物（胃破裂），肝臟、肺臟表面色澤為褐色。2號豬產(chǎn)前2個月出現(xiàn)呼吸采食困難，飲水正常，體溫39℃。用氨芐青霉素、阿米卡星、氟苯尼考、強力霉素、林可霉素治療均無效，于產(chǎn)后13天死亡，耳、四肢、腹部發(fā)紺，剖檢可見肺部嚴(yán)重出血。所產(chǎn)仔豬現(xiàn)存活10頭。

2　病原核酸檢測

（1）豬圓環(huán)病毒核酸檢測。分別取2頭病死豬的肺、淋巴結(jié)約1g，研磨組織勻漿液，8000rpm離心2分鐘，取上清液采用離心柱提取法提取病料DNA樣本。利用廣州維伯鑫生物科技有限公司生產(chǎn)的豬圓環(huán)病毒通用型（PCV-U）核酸檢測試劑盒（PCR-熒光探針法）對待檢病料進行檢測。擴增體系根據(jù)試劑盒說明進行。標(biāo)記熒光基團種類報告基團FAM，淬滅基團TAMRA。擴增反應(yīng)條件：94℃2分鐘，然后94℃30秒或55℃45秒采集熒光，40個循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，陰性質(zhì)控品Ct值在40以上，Ct值小于35的為陽性，Ct值在35～40之間為灰區(qū)，需要進行重復(fù)試驗。重復(fù)試驗后，Ct值仍在35～40之間，判斷為陽性，沒有熒光值增長為陰性。結(jié)果見圖1。

圖1　豬圓環(huán)病毒核酸檢測結(jié)果

根據(jù)熒光PCR擴增結(jié)果可知，陽性對照Ct值15.67，1號樣Ct值是24.32和2號樣Ct值是30.21，出現(xiàn)特異性熒光曲線，陰性對照未出現(xiàn)特異性熒光曲線。結(jié)果顯示，送檢病料檢測到豬圓環(huán)病毒病原核酸，表明病死豬感染豬圓環(huán)病毒。

（2）高致病性豬藍(lán)耳病病毒核酸檢測。分別取病理變化明顯的肺、淋巴結(jié)研磨組織勻漿液，8000rpm離心2分鐘，取上清液100μL于1.5mL滅菌離心管中，采用離心柱提取法提取病料RNA。采用廣州維伯鑫生物科技有限公司生產(chǎn)的高致病性豬藍(lán)耳病病毒核酸RT-PCR熒光探針法進行。擴增體系和循環(huán)參數(shù)設(shè)置根據(jù)試劑盒說明進行。熒光通道選擇：檢測通道FAM，淬滅通道NONE。檢測樣本Ct值≤35.0，而且曲線有明顯的指數(shù)增長，曲線為陽性檢測樣本Ct值＞35.0，重復(fù)一次實驗，如果Ct值仍大于35.0，而且曲線有明顯的增長曲線，判定為陽性，否則為陰性。檢測不到樣本Ct值為陰性。結(jié)果見圖2。

圖2：高致病性豬藍(lán)耳病病毒核酸檢測結(jié)果

根據(jù)熒光RT-PCR擴增結(jié)果可知，陽性對照Ct 值12.91，1號樣Ct值是21.15，2號樣Ct值是22.89。出現(xiàn)特異性熒光曲線，陰性對照未出現(xiàn)特異性熒光曲線。結(jié)果顯示，送檢豬體內(nèi)檢測到高致病性豬藍(lán)耳病毒核酸，表明病死豬感染高致病性豬藍(lán)耳病毒。

3　結(jié)果討論

通過對送檢病死豬進行豬藍(lán)耳病和豬圓環(huán)病毒病原核酸的實驗室檢測，結(jié)果可判斷該豬群為豬圓環(huán)病毒感染與高致病性豬藍(lán)耳病病毒混合感染。豬場應(yīng)立即選用相關(guān)疫苗進行強化免疫。對病死豬、流產(chǎn)胎兒、環(huán)境污染物等進行無害化處理，嚴(yán)格消毒。淘汰重病豬，消除傳染源。圓環(huán)病毒病和高致病性豬藍(lán)耳病均會造成免疫抑制，使機體抵抗力下降，引起多種病原菌的侵入而發(fā)生多重疫病混合感染。因此，應(yīng)當(dāng)加強對豬場環(huán)境的清潔消毒及飼養(yǎng)管理工作，給豬群服用抗生素，減少其繼發(fā)的幾率。養(yǎng)豬場應(yīng)加強飼養(yǎng)管理，堅持全進全出，自繁自養(yǎng)，嚴(yán)把引種關(guān)，不從疫區(qū)或發(fā)病豬場引進種豬。防重于治，嚴(yán)格落實豬場防疫措施，對引進豬只及時補免相關(guān)疫苗。制定科學(xué)免疫程序，針對性地對圓環(huán)病毒、高致病性豬藍(lán)耳病及豬瘟等病免疫，以免發(fā)生多種疫病混合感染，造成重大的經(jīng)濟損失。