王 樂(lè)，劉長(zhǎng)姣，李明春（1.青島大學(xué)藥學(xué)院藥理學(xué)系，山東青島 6601；.大連醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，遼寧大連 116000；.中國(guó)人民解放軍第401醫(yī)院藥劑科，山東青島 66071）

吉非替尼在荷瘤裸小鼠體內(nèi)的時(shí)辰藥動(dòng)學(xué)及其機(jī)制

王 樂(lè)1，3，劉長(zhǎng)姣2，李明春3
（1.青島大學(xué)藥學(xué)院藥理學(xué)系，山東青島 266021；2.大連醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，遼寧大連 116000；3.中國(guó)人民解放軍第401醫(yī)院藥劑科，山東青島 266071）

目的 探討吉非替尼在荷瘤裸小鼠體內(nèi)的時(shí)辰藥動(dòng)學(xué)特點(diǎn)及可能的機(jī)制。方法 將雌性裸鼠于12 h明暗周期中適應(yīng)性飼養(yǎng)2周后，于右腋皮下接種HCC827細(xì)胞，制備荷瘤裸鼠模型。2周后將造模成功的裸鼠隨機(jī)分為2組，分別在8：00或20：00 ig給予吉非替尼1 mg·kg-1，給藥后選取10個(gè)時(shí)間點(diǎn)取血，檢測(cè)血藥濃度，應(yīng)用WinNonlin 6.3計(jì)算藥動(dòng)學(xué)參數(shù)。將造模后未給藥的裸鼠于8：00，12：00，16：00，20：00，24：00及次日4：00處死取肝組織，用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞色素P-4503a11（Cyp3a11）與Cyp3a13基因的mRNA水平，以及調(diào)控其誘導(dǎo)表達(dá)的核受體孕烷X受體（PXR）和組成型雄甾烷受體（CAR）mRNA水平。結(jié)果 荷瘤裸鼠8：00給藥組的藥時(shí)曲線下面積（AUC）和平均滯留時(shí)間（MRT）均高于20：00給藥組（P＜0.05）；8：00給藥組的清除率（Clz/F）低于20：00給藥組（P＜0.05）。荷瘤裸鼠Cyp3a11與Cyp3a13 mRNA水平在20：00表達(dá)最高；PXR與CAR mRNA水平的變化與Cyp3a11和Cyp3a13 mRNA基本一致。結(jié)論吉非替尼在荷瘤裸鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)過(guò)程具有一定的晝夜節(jié)律，可能與CYP3A及調(diào)控基因的時(shí)辰性表達(dá)有關(guān)。

吉非替尼；時(shí)辰藥動(dòng)學(xué)；晝夜節(jié)律；核受體；細(xì)胞色素P-450酶；基因轉(zhuǎn)錄

晝夜節(jié)律是生命活動(dòng)以24 h為周期的波動(dòng)，并依賴于生物鐘基因節(jié)律性的表達(dá)及對(duì)下游信號(hào)分子的活化，是時(shí)辰藥理學(xué)研究中不可或缺的一部分［1］。時(shí)辰治療是運(yùn)用時(shí)辰生物學(xué)與時(shí)辰藥理學(xué)的原理和方法治療或預(yù)防疾病，以獲得最佳療效并減少不良反應(yīng)，其在腫瘤與心血管等疾病治療研究中得到證實(shí)［2］。

吉非替尼（gefitinib）是一種以表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）為靶點(diǎn)的小分子靶向抗腫瘤藥物，適用于治療EGFR突變的晚期非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）。有研究發(fā)現(xiàn)，荷瘤裸小鼠在不同時(shí)辰點(diǎn)給予厄洛替尼后，該藥的抗腫瘤作用具有晝夜節(jié)律性，表現(xiàn)為8：00組的抗腫瘤效果優(yōu)于20：00組，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義［3］，但是對(duì)于吉非替尼時(shí)辰藥動(dòng)學(xué)的研究報(bào)道甚少。細(xì)胞色素P-450酶3A4 （cytochrome P450 enzyme 3A4，CYP3A4）是人體肝和小腸中最豐富的CYP450同工酶，負(fù)責(zé)大約50%藥物的代謝［4］。吉非替尼在人體內(nèi)的主要代謝酶為CYP3A4。在裸小鼠體內(nèi)，Cyp3a11和Cyp3a13與 Cyp3a4具有很高的同源性［5-6］。Cyp3a11和Cyp3a13基因的表達(dá)受孕烷X受體（pregnane X receptor，PXR）通路的調(diào)控。因組成型雄甾烷受體（constitutive androstane receptor，CAR）和PXR配體結(jié)合域有50%的同源性，CAR核受體通路同樣影響Cyp3a11和Cyp3a13基因的表達(dá)［7-8］。因此，本研究通過(guò)建立NSCLC模型，于各時(shí)間點(diǎn)給予吉非替尼1 mg·kg-1，采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用法（high-performance liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry，HPLC-MS/MS）測(cè)定血藥濃度，用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（real-time quantitative PCR，qRT-PCR）技術(shù)檢測(cè)Cyp3a11和Cyp3a13基因及調(diào)控其誘導(dǎo)表達(dá)的核受體基因PXR和CAR mRNA表達(dá)水平，揭示吉非替尼時(shí)辰給藥的藥動(dòng)學(xué)特點(diǎn)及可能的機(jī)制，以期為臨床合理用藥提供參考。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

BALB/c裸小鼠，SPF級(jí)，雌性，4周齡（28～34 d），體質(zhì)量10～13 g，購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：SCXK（京）2012-0001；將裸小鼠置于22～26℃、濕度40%～60%和嚴(yán)格控制光照（12 h明期7：00～19：00，12 h暗期19：00～7：00）的環(huán)境中，自由攝食與飲水，適應(yīng)性飼養(yǎng)2周后用于實(shí)驗(yàn)。

1.2藥品和試劑

吉非替尼標(biāo)準(zhǔn)品（純度98%）和索拉非尼標(biāo)準(zhǔn)品（純度98%），加拿大TRC公司；吉非替尼片（批號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字J20100014，規(guī)格：0.25 g），阿斯利康制藥有限公司；甲醇和乙腈（色譜純），天津市四友精細(xì)化學(xué)品有限公司；乙酸銨和氫氧化鈉（分析純），天津市瑞金特化學(xué)品有限公司；異丙醇、三氯甲烷、乙酸乙酯和無(wú)水乙醇（分析純），天津市富宇精細(xì)化工有限公司；吐溫80（分析純），美國(guó)索萊寶公司；實(shí)驗(yàn)用蒸餾水，中國(guó)人民解放軍第401醫(yī)院自制。DEPC水、無(wú)RNA酶水、RNAiso Plus、cDNA提取試劑盒和SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ均購(gòu)自TaKaRa公司。

1.3儀器

Alliance 2695高效液相色譜儀和Quattro microTMAPI三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀，美國(guó)Waters公司；色譜柱，Waters XTerraR MS C18（2.1 mm×150 mm，5 μm）；TGL16離心機(jī)，長(zhǎng)沙英泰儀器有限公司；BT125D電子天平，Sartorius公司；DC-24氮吹儀，上海安譜科學(xué)儀器有限公司；MS2迷你型旋渦混合儀，德國(guó)IKA公司；DRD431A微型離心機(jī)，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)儀器開發(fā)有限公司；DCD-215DK冷藏冷凍箱，青島海爾股份有限公司；-86℃低溫冷凍箱，青島澳柯瑪股份有限公司；TL988型qRT-PCR儀，西安天隆科技有限公司。

1.4血漿樣品中吉非替尼HPLC-MS/MS檢測(cè)方法的建立和驗(yàn)證

1.4.1溶液的制備

精密稱取吉非替尼標(biāo)準(zhǔn)品23.51 mg，用甲醇定容至25 mL，得到濃度為0.9404 g·L-1的儲(chǔ)備液；精密稱取索拉非尼標(biāo)準(zhǔn)品0.67 mg，用甲醇定容至10 mL，得到濃度為0.0670 g·L-1的內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液。儲(chǔ)備液均于-20℃保存?zhèn)溆?。使用前將吉非替尼?chǔ)備液用50%甲醇溶液稀釋成系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，將內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液用50%甲醇溶液稀釋成0.0350 g·L-1的內(nèi)標(biāo)溶液。

吉非替尼片，去包衣，研磨成粉，用1%吐溫80溶液定容至60 mL（含吉非替尼0.1 g·L-1），于4℃保存，用前搖勻。

1.4.2色譜條件和質(zhì)譜條件

本實(shí)驗(yàn)條件在以往文獻(xiàn)報(bào)道的基礎(chǔ)上［9］加以改進(jìn)。流動(dòng)相組成：乙腈∶乙酸銨20 mmol·L-1=65∶35 （V∶V）；流速0.2 mL·min-1；運(yùn)行時(shí)間8 min；柱溫30℃；進(jìn)樣量10 μL。

大氣壓化學(xué)電噴霧源（ESI），離子源溫度為110℃，去溶劑氣溫度為150℃，去溶劑氣流量為550 L·h-1，毛細(xì)管電壓為3 V，二級(jí)錐孔萃取電壓為2 V，射頻透鏡電壓為0.2 V，離子能量1和2均設(shè)置為0.5 eV。碰撞氣為氬氣，流速為2.9 mL·min-1。采用多反應(yīng)離子監(jiān)測(cè)方式在正離子模式下檢測(cè)，吉非替尼離子對(duì)為447 99.7，內(nèi)標(biāo)索拉非尼為465 270。吉非替尼的碰撞誘導(dǎo)裂解電壓為50 V，索拉非尼為24 V。吉非替尼錐孔電壓為25 V，索拉非尼為40 V。

1.4.3血漿樣品處理

取正常裸小鼠血漿樣品150 μL于1.5 mL EP管中，依次加入10 μL含內(nèi)標(biāo)（0.0350 g·L-1）的甲醇溶液和50 μL氫氧化鈉溶液（0.1 mol·L-1），渦旋混合30 s，加入1 mL乙酸乙酯溶液，渦旋5 min，離心（15 000×g，4℃）10 min。取上清液1 mL，于45℃N2吹干，150 μL流動(dòng)相復(fù)溶，渦旋混合3.5 min，0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾后直接進(jìn)樣。

1.4.4方法學(xué)驗(yàn)證

從方法的專屬性、線性、精密度、準(zhǔn)確度、回收率、基質(zhì)效應(yīng)和穩(wěn)定性等方面進(jìn)行系統(tǒng)的方法學(xué)驗(yàn)證。

1.5非小細(xì)胞肺癌模型的制備、分組和給藥

HCC827細(xì)胞（EGFR突變型），購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)，接種細(xì)胞密度為1.0×107L-1，于裸小鼠右腋皮下接種0.2 mL。接種5 d后，肉眼可見裸小鼠右上肢腋下有腫瘤形成（體積為20～35 mm3），即為造模成功。

在預(yù)實(shí)驗(yàn)中，分別于6個(gè)時(shí)辰點(diǎn)（4：00，8：00，12：00，16：00，20：00和24：00）ig給予NSCLC模型裸小鼠1.0 mg·kg-1吉非替尼，給藥第21天處死裸小鼠，取腫瘤組織，稱重，計(jì)算抑瘤率。結(jié)果顯示，8：00組抑瘤率最高，20：00組抑瘤率最低［10］。因此，本研究選取了8：00和20：00組進(jìn)行血藥濃度的檢測(cè)。接種腫瘤2周后，將造模成功的裸小鼠（體質(zhì)量17～23 g）隨機(jī)分為2組，每組40只，分別于8：00 或20：00 ig給予吉非替尼混懸液（0.1 g·L-1）0.2 mL，給藥劑量為1 mg·kg-1，并于0 h（未給藥）及給藥后15和30 min，1，3，5，7，9，16和24 h摘眼球取血，置于含肝素抗凝劑的EP管中，離心（3500×g，4℃）10 min，分離上層血漿，于-86℃保存，用于吉非替尼的藥動(dòng)學(xué)檢測(cè)。

將18只造模后未給藥的BALB/c裸小鼠隨機(jī)分為6組，每組3只，分別于8：00，12：00，16：00，20：00，24：00及次日4：00頸部脫臼處死取肝組織，于液氮中迅速冷凍后置于-86℃冰箱中保存，用于Cyp3a11，Cyp3a13，PXR和CAR mRNA水平的檢測(cè)。另外，每個(gè)時(shí)辰點(diǎn)組加3只正常裸小鼠作為對(duì)照組。

1.6qRT-PCR檢測(cè)裸小鼠Cyp3a11和Cyp3a13及調(diào)控其誘導(dǎo)表達(dá)的核受體基因PXR和CAR的mRNA水平

1.6.1總RNA提取

稱取100 mg肝組織置于研缽中，不斷加入液氮使其研磨均勻。加入1 mL RNAiso Plus，冰上手動(dòng)勻漿5 min后，轉(zhuǎn)移至無(wú)RNA酶的EP管中，并用氯仿及異丙醇提取總RNA。取RNA樣品5 μL，按照PrimeScript RT-PCR試劑盒要求配置10 μL反應(yīng)體系，對(duì)提取的RNA進(jìn)行純化。采用紫外分光光度法對(duì)提取純化的RNA進(jìn)行濃度和純度分析。此操作在冰上進(jìn)行。

1.6.2cDNA合成

取純化的RNA反應(yīng)液10 μL，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Primscript RT-PCR）的要求配置20 μL反應(yīng)體系，在37℃15 min，85℃5 s的反應(yīng)條件下，將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。

1.6.3PCR擴(kuò)增

利用特異性引物（表1），取制備的cDNA反應(yīng)液2 μL作為反應(yīng)模板，按照SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒說(shuō)明書配置25 μL反應(yīng)體系，進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增反應(yīng)。用溶解度曲線表示qRT-PCR基因擴(kuò)增的特異性。采用TL988 qRT-PTR儀測(cè)定Ct值，以GAPDH基因作為內(nèi)參，對(duì)目的基因的表達(dá)水平作均一化處理。目的基因相對(duì)表達(dá)水平用2- Ct表示。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用WinNonlin 6.3藥動(dòng)學(xué)程序?qū)λ鶞y(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行c-t曲線擬合，以非房室模型（統(tǒng)計(jì)矩法）計(jì)算主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)：藥物峰濃度（cmax）、達(dá)峰時(shí)間（tmax）、清除速率（Clz/F）、從給藥開始到給藥24 h的藥時(shí)曲線下面積（AUC0-24 h）、從給藥開始到給藥t=∞的藥時(shí)曲線下面積（AUC0-∞）、從給藥開始到給藥24 h的平均駐留時(shí)間（MRT0-24 h）及從給藥開始到給藥t=∞的平均駐留時(shí)間（MRT0-∞）。

2　結(jié)果

2.1專屬性

將空白血漿、（空白血漿＋吉非替尼＋內(nèi)標(biāo)）以及ig給予吉非替尼3 h后的血漿樣品按1.4.3進(jìn)行血漿樣品預(yù)處理，按1.4.2色譜與質(zhì)譜條件進(jìn)樣分析。結(jié)果顯示，吉非替尼和內(nèi)標(biāo)索拉非尼的出峰時(shí)間分別為2.7和4.1 min，血漿中內(nèi)源性物質(zhì)對(duì)檢測(cè)無(wú)干擾（圖1）。

2.2線性關(guān)系

取空白血漿135 μL，準(zhǔn)確加入15 μL吉非替尼系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，使其終濃度分別為0.1，0.5，2.0，10.0，50.0，100.0和200.0 μg·L-1，按1.4.3方法進(jìn)行樣品處理，按1.4.2色譜與質(zhì)譜條件進(jìn)樣分析。將測(cè)得的吉非替尼與內(nèi)標(biāo)峰面積之比（Y）對(duì)吉非替尼濃度（X）進(jìn)行線性回歸計(jì)算（加權(quán)系數(shù)1·X-2），回歸方程為Y=0.0112X+0.0147（r=0.9969）。血漿中吉非替尼濃度在0.1～200.0 μg·L-1范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好，其定量限為0.09 μg·L-1（S/N=10）。

Tab.1 PCR primers used for mRNA analysis of target genes

Fig.1 Multiple reaction monitoring chromatograms for gefitinib and sorafenib（internal standard，IS）.A：blank nude mouse plasma；B：blank nude mouse plasma containing gefitinib 200 μg·L-1and IS 2.33 mg·L-1；C：quantification limit of gefitinib was 0.09 μg·L-1and the concentration of IS was 2.33 mg·L-1；D：plasma sample（3 h after ig administration of gefitinib at the dose of 1 mg·kg-1at 12：00，the concentration of gefitinib and IS was 75.40 μg·L-1and 2.33 mg·L-1，respectively）.

2.3精密度和準(zhǔn)確度

用空白血漿配置含吉非替尼0.2，10.0和200.0 μg·L-1的質(zhì)控樣品各6份，于同日內(nèi)按1.4.3 及1.4.2方法進(jìn)行樣品處理后進(jìn)樣，計(jì)算日內(nèi)精密度和準(zhǔn)確度。將以上3種濃度的質(zhì)控樣品各測(cè)定1次，連續(xù)測(cè)定3 d，根據(jù)隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算日間精密度和準(zhǔn)確度（表2）。精密度以相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）表示，準(zhǔn)確度以相對(duì)誤差（relative error，RE）表示。

Tab.2 Accuracy and precision of gefitinib in nude mouse plasma

2.4回收率和基質(zhì)效應(yīng)

用空白血漿配置含吉非替尼0.2，10.0和200.0 μg·L-1的質(zhì)控樣品各6份，按1.4.3及1.4.2方法進(jìn)行樣品處理后進(jìn)樣，求得吉非替尼與內(nèi)標(biāo)峰面積之比，并計(jì)算相同濃度吉非替尼對(duì)照品溶液按相同方法處理進(jìn)樣的峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積比的比值，得到提取回收率；將質(zhì)控樣品中吉非替尼與內(nèi)標(biāo)峰面積比值代入隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線所得的回歸方程，求得吉非替尼的測(cè)定濃度，以測(cè)定濃度/理論濃度× 100%即得相對(duì)回收率（表3）。

配置吉非替尼0.2，10.0和200.0 μg·L-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液15 uL，45℃N2吹干，150 μL流動(dòng)相復(fù)溶進(jìn)樣，得到吉非替尼的峰面積（As）；精密吸取135 μL空白血漿，依次加入50%甲醇溶液25 μL和NaOH溶液（0.1 mol·L-1）50 μL，渦旋混合，加入1 mL乙酸乙酯，渦旋5 min，離心（15 000×g，4℃）10 min。取上清液，分別加入濃度為0.2，10.0和200.0 μg·L-1的吉非替尼標(biāo)準(zhǔn)溶液15 μL，渦旋混合后45℃N2吹干，流動(dòng)相150 μL復(fù)溶進(jìn)樣，得到吉非替尼的峰面積（Ax）；基質(zhì)效應(yīng)=Ax/As。內(nèi)標(biāo)索拉非尼溶液（0.0350 g·L-1）同樣進(jìn)行考察。吉非替尼0.2，10.0 和200.0 μg·L-1的基質(zhì)效應(yīng)分別為94.5%，99.6%和91.1%；內(nèi)標(biāo)的基質(zhì)效應(yīng)分別為93.2%，96.4%和92.0%。以上結(jié)果表明，基質(zhì)效應(yīng)不影響吉非替尼的準(zhǔn)確測(cè)定。

Tab.3 Recovery of gefitinib in nude mouse plasma

2.5穩(wěn)定性

本實(shí)驗(yàn)考察了吉非替尼質(zhì)控樣品在室溫（20℃）放置24 h、-86℃到室溫反復(fù)凍融3次、-86℃低溫儲(chǔ)存1個(gè)月以及處理后的樣品在自動(dòng)進(jìn)樣器（4℃）中放置24 h的穩(wěn)定性。結(jié)果表明，吉非替尼在上述條件下均保持穩(wěn)定（表4）。

Tab.4　Stability of gefitinib in nude mouse plasma under different storage conditions

2.6吉非替尼ig給藥后的藥時(shí)曲線和藥動(dòng)學(xué)參數(shù)

8：00和20：00給藥組藥時(shí)曲線及藥動(dòng)學(xué)參數(shù)分別見圖2和表5。由表5可見，8：00組的AUC和MRT0-24 h均高于20：00組（P＜0.01）。8：00組的Clz/F低于20：00組（P＜0.01），表明相對(duì)于20：00組，8：00組給藥后吉非替尼在裸小鼠體內(nèi)清除緩慢，駐留時(shí)間長(zhǎng)。

Fig.2 Plasma concentration- time profile of gefitinib after administration at two different time points in nude mice of non- small cell lung cancer（NSCLC） model. x±s，n=40.

Tab.5 Plasma pharmacokinetic parameters of each group after gefitinib administration in NSCLC nude mouse

2.7Cyp3a11，Cyp3a13，PXR和CAR mRNA在裸小鼠肝組織中表達(dá)水平的晝夜節(jié)律性

從對(duì)Cyp3a11，Cyp3a13，PXR以及CAR的mRNA基因表達(dá)檢測(cè)（圖3）可以看出，Cyp3a11，Cyp3a13，PXR以及CAR均在明期的早期和暗期的晚期表達(dá)較低，在明期的晚期和暗期的早期表達(dá)較高，各基因均在20：00表達(dá)最高。

Fig.3 Variation tendency of relative expression levels of PXR，CAR，Cyp3a11 and Cyp3a13 mRNA in nude mice of NSCLC model by real- time quantitative PCR during 24 h. The livers were taken from mice at different circadian times. The mRNA expression of Cyp3a11，Cyp3a13，PXR and CAR was detected by qRT-PCR. x±s，n=3.

3　討論

本研究中，裸小鼠體內(nèi)吉非替尼的藥動(dòng)學(xué)特點(diǎn)表現(xiàn)為8：00組AUC和MRT高于20：00組，8：00組的Cl低于20：00組，表明8：00給藥后吉非替尼在裸小鼠體內(nèi)清除緩慢，駐留時(shí)間延長(zhǎng)。裸小鼠體內(nèi)的CYP3A代謝酶及其調(diào)控基因在明期的早期和暗期的晚期表達(dá)較低，明期的晚期和暗期的早期表達(dá)較高，與藥動(dòng)學(xué)特點(diǎn)相吻合。

在吉非替尼和厄洛替尼的時(shí)辰藥效學(xué)研究中，8：00組的抑瘤率均明顯高于20：00組［3，10］。其藥效學(xué)的時(shí)辰節(jié)律性可能與磷酸化的EGFR的晝夜節(jié)律性表達(dá)有關(guān)，也可能與EGFR下游相關(guān)的信號(hào)通路有關(guān)。此藥效學(xué)研究與本研究均表明，在明期的早期或暗期的晚期給予厄洛替尼或吉非替尼效果較好。

PXR和CAR調(diào)控CYP3A的節(jié)律性表達(dá)可能導(dǎo)致吉非替尼體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)變化的晝夜節(jié)律性。另外，藥物在體內(nèi)的吸收、分布和排泄的每一過(guò)程都可能存在晝夜節(jié)律變化。

生物晝夜節(jié)律的基本分子機(jī)制是時(shí)辰基因及其蛋白產(chǎn)物構(gòu)成的自主調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄-翻譯反饋回路。在此機(jī)制中，生物鐘循環(huán)輸出蛋白（circadian locomotor output cycles kaput，Clock）與生物鐘基因Bmal1（brain and muscle Arnt-like protein-1）形成Clock/Bmal 1異二聚體，通過(guò)與隱花色素（cryptochrome，Cry）基因、周期蛋白（period，Per）基因和孤兒核受體（nuclear recaptor Re-Erbalpha， Re-Erbα）基因啟動(dòng)子部位的e盒結(jié)合，激活這些基因的轉(zhuǎn)錄，從而形成Per及Cry蛋白反饋抑制基因的繼續(xù)轉(zhuǎn)錄［11-12］。研究發(fā)現(xiàn)，CAR基因與時(shí)辰基因Bmal 1的表達(dá)趨勢(shì)相同，與Re-Erbα基因的表達(dá)趨勢(shì)相反［13］。CYP3A代謝酶表達(dá)的晝夜節(jié)律性可能與時(shí)辰基因Bmal 1的時(shí)辰性表達(dá)有關(guān)。代謝酶與時(shí)辰基因之間的關(guān)系有待于進(jìn)一步研究。

本研究表明，吉非替尼在荷瘤裸小鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)過(guò)程具有晝夜節(jié)律性，此節(jié)律性可能與代謝酶，PXR和CAR核受體通路及時(shí)辰基因的時(shí)辰性表達(dá)有關(guān)。該研究有助于進(jìn)行吉非替尼時(shí)辰藥理學(xué)的臨床研究，為臨床合理用藥提供理論參考。

［1］ Li R，Cheng S，Wang Z.Circadian clock gene plays a key role on ovarian cycle and spontaneous abortion［J］.Cell Physiol Biochem，2015，37（3）：911-920.

［2］Takane H，Ohdo S，Yamada T，Yukawa E，Higuchi S. Chronopharmacology of antitumor effect induced by interferon-β in tumor-bearing mice［J］.J Pharmacol Exp Ther，2000，294（2）：746-752.

［3］Lin P，An F，Xu X，Zhao L，Liu L，Liu N，et al. Chronopharmacodynamicsandmechanismsof antitumor effect induced by erlotinib in xenographtbearing nude mice［J］.Biochem Biophys Res Commun，2015，460（2）：362-367.

［4］Patoine D，Petit M，Pilote S，Picard F，Drolet B，Simard C.Modulation of CYP3a expression and activity in mice models of type 1 and type 2 diabetes ［J］.Pharmacol Res Persp，2014，2（6）：e00082.

［5］Aueviriyavit S，Kobayashi K， Chiba K.Species differences in mechanism-based inactivationof CYP3A in humans，rats and mice［J］.Drug Metab Pharmacokinet，2010，25（1）：93-100.

［6］Komura H，Iwaki M.In vitro and in vivo small intestinal metabolism of CYP3A and UGT substrates in preclinical animals species and humans：species differences［J］.Drug Metab Rev，2011，43（4）：476-498.

［7］Jin T，Zhang D，Xu YQ，Xu SF，Liu J，Lu YF. Circadian rhythm variation of cytochrome CYP1A gene expression in liver of Kunming mice［J］. Chin J Pharmacol Toxicol（中國(guó)藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志），2013，27（3）：406-410.

［8］Huang L，Kuang SY，Zhang L.Effects of evodiamine and rutecarpine on human CYP3A4 throughPXR and CAR pathway［J］.China Pharmacy（中國(guó)藥房），2013，24（35）：3274-3279.

［9］Masters AR，Sweeney CJ，Jones DR.The quantification of erlotinib（OSI-774）and OSI-420 in human plasmaby liquid chromatography-tandem mass spectrometry［J］.J Chromatogr B，2007，848（2）：379-383.

［10］Liu L，Li MC，Lin PP，Liu N，Wang L.Study on the pharmacodynamics of gefitinib in tumor-bearing nude mice according to time［J］.China Pharmacy（中國(guó)藥房），2015，26（16）：2205-2208.

［11］Shimomura K， Kumar V，Koike N，Kim TK，Chong J，Buhr ED，et al.Usf1，a suppressor of the circadian Clock mutant，reveals the nature of the DNA-binding of the CLOCK：BMAL1 complex in mice［J］.Elife，2013，2：e00426.

［12］Eckel-Mahan K，Sassone-Corsi P.Metabolism and the circadian clock converge［J］.Physiol Rev，2013，93（1）：107-135.

［13］Kanno Y，Otsuka S，Hiromasa T，Hiromasa T，Nakahama T，Inouye，Y.Diurnal difference in CAR mRNA expression［J］.Nucl recept，2004，2（1）：6.

Chronopharmacokinetics of gefitinib and its mechanisms in tumor-bearing nude mice

WANG Le1，3，LIU Chang-jiao2，LI Ming-chun3
（1.Department of Pharmacology，College of Pharmacy，Qingdao University，Qingdao 266021，China；2.College of Pharmacy，Dalian Medical University，Dalian 116000，China；3.Department of Pharmacology，The 401st Hospital of PLA，Qingdao 266071，China）

OBJECTIVE To investigate the effect of the dosing time on the pharmacokinetics of gefitinib and its potential mechanism.METHODS Female BALB/c nude mice were housed under standardized 12 h light/dark circadian conditions（light on at 7：00，off at 19：00）for two weeks before a non-small cell lung cancer（NSCLC）model was established.Two weeks later，they were divided into 2 groups（8：00，20：00）randomly.Gefitinib was orally administered at the dose of 1 mg·kg-1to the mice in each group at 8：00 or 20：00，respectively.Blood was collected at 10 different time points after each administration.Livers were collected every 4 h during the 24 h period from the non-administrated nude mice of NSCLC model.The plasma concentration of gefitinib was determined through an HPLC-MS/MS and the parameters were calculated by WinNonlin 6.3.The total RNA was extracted from livers，purified，synthesized to cDNA that was subjected to qRT-PCR analysis for mRNA expression levels of cytochrome P450 enzymes（Cyp）3a11，Cyp3a13，pregnane X receptor（PXR）and constitutive androstane receptor（CAR）.RESULTS The area under the plasma concentration-time curve（AUC）and mean residence time（MRT）of 8：00 administration group were higher than those of 20：00 administration group（P＜0.05）.The clearance（Clz/F）of 8：00 administration group was lower than that of 20：00 administration group（P＜0.05）.The mRNA expression levels of PXR and CAR were consistent with those of Cyp3a11 and Cyp3a13.CONCLUSIONCircadian rhythm exists in the pharmacokinetics of gefitinib and it may be closely related to CYP3A and its regulator genes.

gefitinib；chronopharmacokinetics；circadian rhythm；nuclear receptors；cytochrome P450 enzymes；gene transcription

LI Ming-chun，Tel：（0532）51870086，E-mail：lmc401y@163.com

R969.1

A

1000-3002（2016）02-0144-07

10.3867/j.issn.1000-3002.2016.02.009

2015-10-23接受日期：2015-12-29）

（本文編輯：沈海南）

王 樂(lè)，女，碩士研究生，主要從事藥理學(xué)研究，E-mail：wangle1106@163.com

李明春，E-mail：lmc401y@163.com，Tel：（0532）51870086