汪艷艷，李海霞，巫亞俊，趙修南，麻　浩，劉坤璐，武軍華，單俊杰，王玉霞，王海南（1.貴州大學(xué)藥學(xué)院，貴州貴陽(yáng) 55005；.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院毒物藥物研究所，北京 100850；3.國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局，北京100053）

懷牛膝果寡糖對(duì)H1N1流感疫苗佐劑活性及免疫細(xì)胞功能的影響

汪艷艷1，2，，李海霞2，巫亞俊2，趙修南2，麻浩2，劉坤璐2，武軍華2，單俊杰2，王玉霞2，王海南1，3
（1.貴州大學(xué)藥學(xué)院，貴州貴陽(yáng) 550025；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院毒物藥物研究所，北京 100850；3.國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局，北京100053）

目的 研究牛膝果寡糖ABP-50-FOS對(duì)H1N1流感疫苗的佐劑活性及免疫細(xì)胞功能的影響。方法 采用凝膠滲透色譜、毛細(xì)管電泳、紅外光譜和核磁共振等方法研究ABP-50-FOS的理化性質(zhì)；BALB/c小鼠肌肉注射H1N1流感疫苗3 μg和ABP-50-FOS 200 μg初次免疫，28 d后加強(qiáng)免疫。分別于初次和再次免疫后14 d用ELISA法檢測(cè)小鼠血清特異性IgG，IgG1，IgG2a，IgG2b，IgG3和IgM抗體水平；流式細(xì)胞儀測(cè)定脾細(xì)胞中CD3+，CD19+，CD4+和CD8+淋巴細(xì)胞亞群百分率；MTT法測(cè)定小鼠脾細(xì)胞增殖活性；ELISA法測(cè)定脾細(xì)胞培養(yǎng)上清干擾素γ（IFN-γ）、胸腺細(xì)胞培養(yǎng)上清白細(xì)胞介素4（IL-4）、腹腔巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清腫瘤壞死因子α（TNF-α）和一氧化氮及小鼠骨髓細(xì)胞和DC2.4樹(shù)突狀細(xì)胞培養(yǎng)上清IL-12p70含量。結(jié)果ABP-50-FOS是一種果寡糖，峰高分子質(zhì)量為1885 u，骨架結(jié)構(gòu)為1，2-連接和1，6-連接的果糖。該寡糖能明顯升高H1N1流感疫苗免疫小鼠血清特異性IgG，IgG2a和IgM抗體水平（P＜0.01），提高免疫小鼠脾CD3+，CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞亞群的百分率。體外實(shí)驗(yàn)表明，ABP-50-FOS能促進(jìn)小鼠脾細(xì)胞增殖反應(yīng)和IFN-γ分泌（P＜0.01），促進(jìn)胸腺細(xì)胞IL-4分泌（P＜0.01），刺激腹腔巨噬細(xì)胞分泌TNF-α（P＜0.01）和DC2.4樹(shù)突狀細(xì)胞分泌IL-12p70（P＜0.01），對(duì)巨噬細(xì)胞一氧化氮的分泌有抑制作用。結(jié)論 牛膝果寡糖ABP-50-FOS對(duì)H1N1流感疫苗具有良好的佐劑活性，體外對(duì)小鼠免疫細(xì)胞功能具有促進(jìn)作用。

牛膝；多糖；果寡糖；疫苗；佐劑

懷牛膝（Achyranthes bidentata Blume）為莧科多年生草本植物，其干燥根入藥，可用來(lái)治療肝陽(yáng)眩暈、產(chǎn)后腹痛、跌打損傷等病癥［1］。多糖作為牛膝藥材的主要活性成分之一，近年來(lái)對(duì)其研究和報(bào)道較多，如免疫調(diào)節(jié)［2］、抗腫瘤［3］、抗凝血［4］、抗病毒［5］、抗瘧疾［6］和治療關(guān)節(jié)炎［7］等作用。邱妍等［8］采用水煎醇沉法提取懷牛膝粗多糖（糖含量為54%），用該多糖點(diǎn)眼滴鼻免疫雞新支二聯(lián)弱毒苗，同時(shí)分別肌肉注射懷牛膝多糖1.5或3.0 mg。結(jié)果表明，懷牛膝多糖3.0 mg能提高抗體效價(jià)，促進(jìn)T淋巴細(xì)胞增殖。封海波等［9］在室溫下采用超聲輔助水提醇沉法提取牛膝粗多糖（糖含量為78.9%），分別按25，50 和100 mg·kg-1與O型口蹄疫滅活疫苗協(xié)同免疫ICR小鼠2次。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，牛膝粗多糖明顯增強(qiáng)共刺激信號(hào)分子CD40，CD80和CD86的表達(dá)水平，同時(shí)提高主要組織相容性復(fù)合體Ⅰ（major histocompatibility complex-Ⅰ，MHC-Ⅰ）、MHC-Ⅱ、趨化因子受體 4（chemokine receptor 4，CXCR4）和CC趨化因子受體7（CC chemokine receptor 7，CCR7）mRNA表達(dá)水平。上述研究表明，牛膝粗多糖具有顯著的疫苗佐劑活性，但對(duì)其中的活性成分尚未見(jiàn)進(jìn)一步的追蹤和報(bào)道。

本研究在50℃條件下采用水提、醇沉、透析和冷凍干燥方法制備牛膝粗多糖ABP-50。ABP-50 經(jīng)DEAE-纖維素柱層析獲得多糖組分ABP-50-A，再用Sephadex G-50柱純化，獲得果寡糖ABP-50-FOS。繼而采用H1N1流感疫苗評(píng)價(jià)該果寡糖的疫苗佐劑活性，同時(shí)評(píng)價(jià)該寡糖對(duì)疫苗免疫小鼠及正常小鼠免疫細(xì)胞功能的影響，為深入研究牛膝果寡糖佐劑作用機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1藥材、試劑、儀器和動(dòng)物

懷牛膝購(gòu)于北京同仁堂藥店，產(chǎn)地河南，批號(hào)30770101，北京三和藥業(yè)有限公司炮制。牛膝果寡糖ABP-50-FOS由本課題組分離和純化獲得。甲型H1N1流感病毒裂解液由北京科興生物制品有限公司生產(chǎn)；刀豆蛋白（concanavalin A，Con A）和脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；HRP標(biāo)記山羊抗小鼠IgG和兔抗山羊IgG和N-四甲基聯(lián)苯胺（TMB）均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)公司；小鼠抗體及亞類(lèi)（IgG1，IgG2a，IgG2b，IgG3，IgM和IgA）測(cè)定試劑盒購(gòu)于美國(guó)Sigma公司；PerCP標(biāo)記倉(cāng)鼠抗小鼠CD3e、APC標(biāo)記大鼠抗小鼠CD19、PE標(biāo)記大鼠抗小鼠CD4以及FITC標(biāo)記大鼠抗小鼠CD8抗體均購(gòu)于美國(guó)BD Bioscience公司；小鼠干擾素γ（interferon-γ，IFN-γ）、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細(xì)胞介素（interleukin，IL）4、IL-12和一氧化氮（nitrogen monoxide，NO）ELISA試劑盒均購(gòu)于欣博盛生物科技有限公司；胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；RPMI 1640培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司；MTT購(gòu)自Amresco公司。Varioskau Flash version 2.4.3酶標(biāo)儀和F1-01620型洗板機(jī)均為美國(guó)Thermo Scientific公司產(chǎn)品，流式細(xì)胞儀為美國(guó)BD公司產(chǎn)品。BALB/c小鼠，雌性，6～8周齡，合格證號(hào)：軍科院SCXK（軍）2012-001，由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心供給。DC2.4細(xì)胞株購(gòu)于上海研謹(jǐn)生物科技有限公司。

1.2ABP-50-FOS的制備

懷牛膝1 kg粉碎，加入15 L去離子水浸泡，在50℃條件下提取4 h。離心，殘?jiān)捎猛瑯訔l件重復(fù)提取1次，合并上清液，55℃減壓濃縮至2 L，然后加入95%乙醇8 L進(jìn)行醇沉48 h。離心，沉淀部分加入1 L水?dāng)嚢枞芙狻㈦x心。沉淀部分再重復(fù)加水2次溶解，合并上清液，裝入透析袋（截留分子質(zhì)量＞1000 u），流水透析48 h，去離子水透析24 h。袋內(nèi)溶液離心、減壓濃縮和冷凍干燥，獲得粗多糖ABP-50。ABP-50 500 mg溶于20 mL水，上樣于DEAE-纖維素層析柱，連續(xù)采用水和NaHCO30.25 mol·L-1洗脫，蒽酮-硫酸法檢測(cè)含糖流份，收集、透析、冷凍干燥，分別獲得ABP-50-A和ABP-50-B組分。ABP-50-A 200 mg溶于2 mL水，上樣于Sephadex G-50層析柱，水洗脫，蒽酮-硫酸法檢測(cè)含糖流分，收集、冷凍干燥，獲得分子質(zhì)量均一的多糖成分ABP-50-FOS。

1.3ABP-50-FOS的理化性質(zhì)

采用凝膠過(guò)濾色譜法測(cè)定果寡糖ABP-50-FOS的純度和分子質(zhì)量［10］，毛細(xì)管電泳法測(cè)定其單糖組成［11-12］。IR，［1H］NMR和［13C］NMR確定其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。

1.4H1N1流感疫苗免疫方案

BALB/c小鼠隨機(jī)分為4組：生理鹽水組、H1N1抗原組、H1N1+ABP-50-FOS組和H1N1+鋁佐劑組，每組6只。H1N1抗原的免疫劑量為每只小鼠3 μg，ABP-50-FOS和鋁佐劑的劑量均為每只小鼠200 μg。采用后肢內(nèi)側(cè)肌內(nèi)注射途徑，初次免疫28 d進(jìn)行再次免疫，分別在初次和再次免疫后14 d小鼠尾靜脈采血，分離血清，測(cè)定血清特異性IgG抗體及亞類(lèi)抗體滴度。

1.5ELISA法檢測(cè)血清IgG類(lèi)抗體滴度

小鼠血清用含0.1%吐溫-20的磷酸緩沖溶液（PBST，pH 7.4）按1∶400的比例稀釋。采用抗原2 g·L-1包被96孔板，每孔100 μL，4℃包被過(guò)夜。每孔再加入1%牛血清白蛋白200 μL，37℃孵育封閉1 h。封閉后用PBST洗3次，然后每孔加入100 μL倍比稀釋的血清（以1∶400稀釋液為原液），再37℃繼續(xù)孵育1 h。用PBST洗板3次后，每孔加入1∶1000稀釋的HRP標(biāo)記山羊抗小鼠IgG抗體100 μL，37℃孵育1 h。再用PBST洗板5次，TMB底物顯色，用酶標(biāo)儀測(cè)定波長(zhǎng)450 nm處的吸光度（A450nm）。

1.6ELISA法檢測(cè)血清IgM，IgA和IgG亞類(lèi)抗體滴度

抗原用碳酸鹽緩沖液0.5 mol·L-1（pH 9.6）稀釋?zhuān)K濃度為3 mg·L-1，加入96孔板中，每孔100 μL，4℃包被過(guò)夜。每孔用PBST洗3次后加入5%脫脂奶粉37℃封閉1 h。PBST洗滌3次，加入100 μL倍比稀釋的血清（以1：400稀釋液為原液），37℃繼續(xù)孵育1 h。PBST再洗滌3次，每孔加入山羊抗小鼠（IgG1，IgG2a，IgG2b，IgG3，IgM和IgA）抗體100 μL（用PBST 1∶1000倍稀釋?zhuān)?7℃孵育1 h。PBST洗滌3次，加入HRP標(biāo)記的兔抗山羊IgG抗體100 μL（用PBST 1∶1000倍稀釋?zhuān)?7℃孵育1 h。再用PBST洗滌5次，加入TMB顯色底物，每孔100 μL，室溫避光顯色15 min。最后每孔加入0.2 mol·L-1硫酸溶液50 μL終止顯色，酶標(biāo)儀測(cè)定A450 nm。

1.7流式細(xì)胞儀檢測(cè)脾B淋巴細(xì)胞和T細(xì)胞亞群

H1N1流感疫苗免疫后28 d小鼠眼球取血，頸椎脫臼處死。無(wú)菌條件下取脾制備脾細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為2×1010L-1。取脾細(xì)胞懸液100 μL，加入100 μL混合抗體（含PerCP-倉(cāng)鼠抗小鼠CD3e抗體0.25 μg，APC-大鼠抗小鼠CD19抗體0.5 μg，PE-大鼠抗小鼠CD4抗體0.125 μg，F(xiàn)ITC-大鼠抗小鼠CD8a抗體0.5 μg），每組設(shè)3平行管。另外設(shè)4個(gè)相應(yīng)的單標(biāo)抗體對(duì)照。室溫下避光孵育25 min，各管加入洗液1.5 mL，混勻，4℃離心10 min（600×g），棄上清，再重復(fù)離心和洗滌3次，重懸細(xì)胞，加入PBS 500 μL搖勻，進(jìn)行流式細(xì)胞儀分析，測(cè)定CD3+，CD19+，CD4+和CD8+細(xì)胞的百分率。

1.8體外脾細(xì)胞增殖活性的測(cè)定

正常BALB/c小鼠眼球取血，頸椎脫臼處死。無(wú)菌條件下取出脾，制備脾細(xì)胞懸液，用錐蟲(chóng)藍(lán)染色法檢測(cè)細(xì)胞存活率＞95%，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度為5×109L-1。將計(jì)數(shù)后的脾細(xì)胞懸液按每孔100 μL加入到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，各孔分別加入50 μL細(xì)胞培養(yǎng)液、Con A（終濃度4 mg·L-1）或LPS（終濃度15 mg·L-1）溶液，各孔再分別加入50 μL ABP-50-FOS溶液（終濃度分別為0，2，10和50 mg·L-1）。每組設(shè)3復(fù)孔。將培養(yǎng)板置于含5%CO2培養(yǎng)箱中，37℃孵育48 h。加入20 μL MTT（5 g·L-1），繼續(xù)孵育4 h。棄上清液，每孔中加入150 μL DMSO，酶標(biāo)儀檢測(cè)A570 nm，計(jì)算細(xì)胞增殖百分率。

1.9脾細(xì)胞分泌IFN- 和胸腺細(xì)胞分泌IL-4水平的測(cè)定

BALB/c小鼠眼球取血，頸椎脫臼處死，無(wú)菌摘取脾和胸腺，分別制備脾細(xì)胞懸液（5×109L-1）和胸腺細(xì)胞懸液（2×1010L-1）。將脾細(xì)胞和胸腺細(xì)胞懸液分別加入24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔500 μL。細(xì)胞樣品孔中加500 μL培養(yǎng)液、Con A（終濃度為2 mg·L-1）或ABP-50-FOS溶液（終濃度分別為2，10和50 mg·L-1），每組設(shè)3復(fù)孔。然后置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。脾細(xì)胞培養(yǎng)48 h，胸腺細(xì)胞培養(yǎng)72 h，然后取出細(xì)胞培養(yǎng)液，離心10 min（600×g）收集上清，按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)分別測(cè)定脾細(xì)胞培養(yǎng)上清IFN-γ含量和胸腺細(xì)胞培養(yǎng)上清IL-4含量。

1.10腹腔巨噬細(xì)胞分泌TNF- 和NO水平的測(cè)定

正常BALB/c小鼠，頸椎脫臼處死，無(wú)菌條件下腹腔注射含5%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)液，然后抽取腹腔溶液，離心10 min（600×g），棄上清，加入紅細(xì)胞溶脹液后，用細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌3次。用含10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度，加入24孔培養(yǎng)板每孔0.5 mL，含5×105個(gè)細(xì)胞，置于37℃，5%CO2，飽和濕度孵溫箱培養(yǎng)2 h。吸去上清，用0.9%NaCl去除未貼附的細(xì)胞，每孔分別加入0.5 mL細(xì)胞培養(yǎng)液、LPS（終濃度30 mg·L-1）和ABP-50-FOS（終濃度分別為2，10和50 mg·L-1）。每組設(shè)3復(fù)孔，然后置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。離心，收集培養(yǎng)液上清，用ELISA試劑盒測(cè)定細(xì)胞上清液的TNF-α和NO含量。

1.11小鼠骨髓細(xì)胞和DC2.4樹(shù)突狀細(xì)胞分泌IL-12p70含量的測(cè)定

正常BALB/c小鼠，頸椎脫臼處死，無(wú)菌條件下剝離和剪斷股骨，向骨髓腔內(nèi)注射細(xì)胞培養(yǎng)液，沖洗3次。沖洗液過(guò)篩、離心，然后加入Tris-NH4Cl緩沖液裂解紅細(xì)胞。再用細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌2次，重懸細(xì)胞、計(jì)數(shù)，然后用含20%FBS的培養(yǎng)液調(diào)制密度為4×109L-1骨髓細(xì)胞懸液。24孔培養(yǎng)板中加入骨髓細(xì)胞懸液（終密度4×108L-1），然后分別加入生理鹽水、LPS（終濃度30 mg·L-1）或ABP-50-FOS（終濃度2，10和50 mg·L-1），37℃，5%CO2孵育48 h。離心，測(cè)定上清液IL-12p70含量。

取傳代培養(yǎng)DC2.4樹(shù)突狀細(xì)胞，加入含10%FBS 的RPMI 1640培養(yǎng)液，調(diào)整細(xì)胞密度為2.5×109L-1。24孔培養(yǎng)板中加入樹(shù)突狀細(xì)胞懸液（終密度1.25× 108L-1），分別加入生理鹽水、LPS（終濃度30 mg·L-1）及ABP-50-FOS（終濃度2，10和50 mg·L-1），37℃，5%CO2孵育48 h。離心，測(cè)定上清液IL-12p70含量。

1.12統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2　結(jié)果

2.1ABP-50-FOS的得率和理化性質(zhì)

在50℃條件下牛膝經(jīng)水提、醇沉、透析和冷凍干燥獲得粗多糖ABP-50，淡黃色，得率5.76%。ABP-50經(jīng)DEAE-纖維素柱層析分別得到ABP-50-A 和ABP-50-B組分，得率分別為69.6%和3.2%。ABP-50-A再經(jīng)Sephadex G-50純化，獲得果寡糖ABP-50-FOS，呈白色片狀粉末，得率為85%。

HPGPC分析表明，ABP-50-FOS呈單一對(duì)稱(chēng)色譜峰，峰高分子質(zhì)量為1885 u。IR，［1H］NMR和［13C］NMR圖譜與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致［13］，提示ABP-50-FOS可能為已知結(jié)構(gòu)的果寡糖。

2.2ABP-50-FOS對(duì)H1N1流感疫苗免疫小鼠體液免疫反應(yīng)的影響

ABP-50-FOS與H1N1流感疫苗聯(lián)用初次免疫后14 d，所有免疫組小鼠血清IgG抗體滴度均很低，各組之間無(wú)明顯差異（圖1A）。加強(qiáng)免疫14 d后，與生理鹽水組相比，單獨(dú)H1N1疫苗組血清特異性IgG，IgG1和IgM滴度顯著升高（P＜0.01），同時(shí)IgG2a和IgG2b滴度也明顯升高（P＜0.01）。與單獨(dú)H1N1疫苗組相比，聯(lián)用ABP-50-FOS能進(jìn)一步升高IgG，IgG2a和IgM滴度（P＜0.05，P＜0.01）；相反，鋁佐劑顯著降低IgG，IgG1和IgM水平（P＜0.01），推測(cè)原因之一是鋁佐劑可能吸附抗原，影響抗原的釋放。上述結(jié)果提示，ABP-50-FOS能提高H1N1疫苗免疫小鼠體液免疫反應(yīng)（圖1B和C）。

Fig.1 Co-administration of fructoolgosaccharide ABP-50-FOS adjuvant from A.bidentata with H1N1 influenza vaccine enhances humoral responses.BALB/c mice were immunized intramuscularly with H1N1 antigen 3 μg，ABP-50-FOS 200 μg or alum 200 μg per mouse.Blood samples were collected at 14 d after first（A）and second（B，C）immunizations and total IgG（A，B）and its isotypes（C）titers were measured by ELISA.，n=6.*P＜0.05，**P＜0.01，compared with saline group；#P＜0.05，##P＜0.01，compared with H1N1 antigen alone group.

2.3ABP-50-FOS對(duì)H1N1免疫小鼠脾淋巴細(xì)胞亞群的影響

H1N1流感疫苗與ABP-50-FOS聯(lián)用免疫小鼠2次后，測(cè)定對(duì)脾T和B細(xì)胞分化及T細(xì)胞亞群的影響。從表1結(jié)果可以看出，與生理鹽水組相比，單獨(dú)H1N1疫苗免疫小鼠2次后，CD19+亞群細(xì)胞百分率降低，CD3+細(xì)胞百分率及CD3+/CD19+的比值均升高（P＜0.01）。與單獨(dú)H1N1疫苗組相比，聯(lián)用ABP-50-FOS能進(jìn)一步升高CD3+細(xì)胞百分率和CD3+/CD19+的比值（P＜0.01），提示H1N1抗原聯(lián)用ABP-50-FOS有利于向T細(xì)胞分化。聯(lián)用鋁佐劑組CD3+細(xì)胞百分率和CD3+/CD19+比值明顯降低（P＜0.01）。表2結(jié)果表明，與生理鹽水組相比，單獨(dú)免疫H1N1抗原能提高CD4+T細(xì)胞的百分率（P＜0.05），但對(duì)CD8+T細(xì)胞的百分率及CD4+/CD8+比值無(wú)明顯影響。與單獨(dú)H1N1抗原組相比，聯(lián)用ABP-50-FOS能明顯升高CD4+和CD8+T細(xì)胞百分率（P＜0.01），降低CD4+/CD8+比值（P＜0.01）。鋁佐劑與ABP-50-FOS相反，降低CD4+T細(xì)胞百分率和CD4+/ CD8+比值（P＜0.05）。2.4 ABP-50-FOS體外對(duì)正常小鼠脾細(xì)胞增殖和分泌IFN- 的影響

Tab.1 Effect of ABP-50-FOS on CD3+and CD19+cell percentage in spleen of H1N1 influenza vaccine immunized mice

BALB/c小鼠脾細(xì)胞分別在Con A（4 mg·L-1）或LPS（15 mg·L-1）刺激下，與不同濃度ABP-50-FOS共孵育48 h。表3結(jié)果表明，在無(wú)絲裂原刺激下，小鼠原代脾細(xì)胞與ABP-50-FOS 2，10和50 mg·L-1共孵育48 h能顯著促進(jìn)脾細(xì)胞增殖反應(yīng)。在Con A刺激下脾細(xì)胞發(fā)生明顯增殖（P＜0.01），ABP-50-FOS 10和50 mg·L-1對(duì)Con A有協(xié)同作用（P＜0.05），而ABP-50-FOS只有在50 mg·L-1濃度下對(duì)LPS有協(xié)同效應(yīng)（P＜0.05）。表4結(jié)果表明，與生理鹽水組相比，ABP-50-FOS 3個(gè)濃度均能明顯促進(jìn)脾細(xì)胞分泌IFN-γ（P＜0.01）。推測(cè)ABP-50-FOS能提高小鼠脾T和B細(xì)胞增殖反應(yīng)，促進(jìn)T細(xì)胞向Th1細(xì)胞分化。

Tab.2 Effect of ABP-50-FOS on CD4+and CD8+T cell percentage in spleen of H1N1 influenza vaccine immunized mice

Tab.3 Splencyte proliferation of BALB/c mice stimulated by ABP-50-FOS in vitro

Tab.4 Effect of ABP-50-FOS on interferonI- （IFN- ）secretion of splencytes in BALB/c mice in vitro

2.5ABP-50-FOS對(duì)胸腺細(xì)胞分泌IL-4的影響

由表5可見(jiàn)，BALB/c小鼠胸腺細(xì)胞在生理鹽水、Con A或不同濃度ABP-50-FOS刺激下培養(yǎng)72 h，與生理鹽水組相比，Con A刺激能顯著促進(jìn)小鼠胸腺細(xì)胞IL-4的分泌（P＜0.01）；ABP-50-FOS 2，10和50 mg·L-1也能顯著刺激小鼠胸腺細(xì)胞分泌IL-4。

Tab.5 Effect of ABP-50-FOS on interleukin-4（IL-4）secretion of thymocytes in BALB/c mice in vitro

2.6ABP-50-FOS對(duì)腹腔巨噬細(xì)胞分泌TNF- 和NO的影響

BALB/c小鼠腹腔巨噬細(xì)胞在生理鹽水、LPS或不同濃度ABP-50-FOS刺激下培養(yǎng)24 h，測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TNF-α和NO的含量。表6結(jié)果表明，LPS能刺激小鼠腹腔巨噬細(xì)胞分泌TNF-α （P＜0.01），但對(duì)NO分泌無(wú)影響。ABP-50-FOS 50 mg·L-1LPS作用相似，也能促進(jìn)TNF-α的分泌（P＜0.01），但對(duì)NO的分泌有一定抑制作用（P＜0.05）。

Tab.6 Effect of ABP-50-FOS on tumor necrosis factor-（TNF- ）and nitrogen monoxide（NO）secretions of peritoneal macrophages in BALB/c mice in vitro

2.7ABP-50-FOS對(duì)小鼠骨髓細(xì)胞和DC2.4樹(shù)突狀細(xì)胞系分泌IL-12p70的影響

BALB/c小鼠的原代骨髓細(xì)胞或DC2.4樹(shù)突細(xì)胞分別在生理鹽水、LPS或不同濃度ABP-50-FOS刺激下培養(yǎng)48 h，測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-12p70的含量。表7結(jié)果表明，LPS能明顯小鼠骨髓細(xì)胞和DC2.4樹(shù)突狀細(xì)胞分泌IL-12p70（P＜0.01）。ABP-50-FOS 50 mg·L-1對(duì)小鼠骨髓細(xì)胞分泌IL-12p70有促進(jìn)作用（P＜0.05），ABP-50-FOS 10 和50 mg·L-1則能顯著刺激DC2.4樹(shù)突狀細(xì)胞分泌IL-12p70（P＜0.01）。提示ABP-50-FOS具有活化樹(shù)突狀細(xì)胞的作用。

Tab.7 Effect of ABP-50-FOS on IL-12p70 secretion of dendritic cells in BALB/c mice in vitro

3　討論

牛膝是我國(guó)傳統(tǒng)的常用中藥材之一，具有補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨、逐瘀通經(jīng)和引血下行等攻補(bǔ)兼具的作用，其中多糖可能是主要活性成分之一。近年來(lái)大量文獻(xiàn)報(bào)道，牛膝粗多糖和果聚糖具有多種藥理活性［14-15］，特別是在免疫調(diào)節(jié)和抗腫瘤方面［3，16］。時(shí)春娟等［17］對(duì)牛膝多糖結(jié)構(gòu)修飾物（硫酸酯化、磷酸酯化、羧甲基化和羥甲基化）的抗腫瘤活性也進(jìn)行了綜述和評(píng)價(jià)，表明經(jīng)過(guò)修飾后抗腫瘤活性進(jìn)一步提高。文獻(xiàn)中研究的牛膝多糖主要分為牛膝粗多糖和牛膝果聚糖（A.bidentata polyfructose，ABPS）。由于果糖是一種酮糖，經(jīng)完全酸水解、硼氫化鈉還原和乙酸酯衍生，最終為葡萄糖和甘露糖的乙?；a(chǎn)物。早期文獻(xiàn)報(bào)道，牛膝中葡甘寡糖（分子質(zhì)量1400 u）具有顯著的免疫調(diào)節(jié)活性［18-19］；之后田庚元等［13］再一次研究確證，該寡糖是由果糖和葡萄糖組成，二者摩爾比為8∶1。

巨噬細(xì)胞在體液免疫中不僅直接吞噬和殺傷病原體，還能介導(dǎo)炎癥反應(yīng)、加工和遞呈抗原，分泌多種細(xì)胞因子啟動(dòng)免疫應(yīng)答。TNF-α是巨噬細(xì)胞分泌的主要細(xì)胞因子之一，對(duì)B細(xì)胞和T細(xì)胞的激活有重要意義。樹(shù)突狀細(xì)胞同樣在免疫應(yīng)答中也至關(guān)重要，不僅向B細(xì)胞和T細(xì)胞遞呈抗原，同時(shí)還參與固有免疫和T細(xì)胞亞群的分化。樹(shù)突狀細(xì)胞活化后分泌IL-12和NO，IL-12與NO結(jié)合，能刺激NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性，促使釋放IFN-γ，繼而促進(jìn)Th1淋巴細(xì)胞的分化［20］。Chen等［21］將ABPS分別按1000和1500 mg·kg-1劑量灌胃給予斷奶乳豬14和28 d，能明顯提高血清中IgG，IgM，IgA，IL-2和IFN-γ含量，呈時(shí)-效和量-效關(guān)系。Jin等［3］將ABPS按200 mg·kg-1劑量腹腔注射Lewis肺癌小鼠，在抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的同時(shí)能上調(diào)脾細(xì)胞IL-6和TNF-α mRNA的表達(dá)。Zhu等［6］先給小鼠每天腹腔注射ABPS 50 mg·kg-1，連續(xù)15 d，然后感染約氏瘧原蟲(chóng)（P.y）17XL株，發(fā)現(xiàn)ABPS能顯著增強(qiáng)Th1反應(yīng)，增加表達(dá)F4/80+CD36+的巨噬細(xì)胞數(shù)量以及IFN-γ，TNF-α和NO含量。更重要是ABPS能增加骨髓CD11c+CD11b+樹(shù)突狀細(xì)胞和漿細(xì)胞樣CD11c+CD45R+/B220+樹(shù)突狀細(xì)胞的數(shù)量，促進(jìn)CD11c+樹(shù)突狀細(xì)胞表達(dá)MHC-Ⅱ和CD86及TLR-9。Zou等［22］研究發(fā)現(xiàn)ABPS通過(guò)提高CD86，CD40和MHC-Ⅱ的表達(dá)而促進(jìn)小鼠樹(shù)突狀細(xì)胞成熟，增強(qiáng)其抗原遞呈能力和IL-12的分泌。呂建新等［23］研究了ABPS對(duì)人胸腔巨噬細(xì)胞的激活作用。結(jié)果表明，其能上調(diào)胸腔巨噬細(xì)胞內(nèi)乳酸脫氫酶和酸性磷酸酶活性，并能顯著誘導(dǎo)胸腔巨噬細(xì)胞表達(dá)TNF-α和IL-6。以上文獻(xiàn)提示，ABPS能明顯激活巨噬細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞，促進(jìn)成熟和抗原遞呈相關(guān)分子和細(xì)胞因子的表達(dá)（但均未提及果聚糖的理化性質(zhì)）。有文獻(xiàn)報(bào)道，從其他植物中提取的果寡糖具有良好的免疫調(diào)節(jié)和抗腫瘤活性，如Kardo?ová等［24］從牛蒡根中分離一種分子質(zhì)量為2950 u的果寡糖，連接方式為 1）-Fruf-（2 ，具有鎮(zhèn)咳作用。Chandrashekar等［25］從大蒜（Allium sativum）中分離出2個(gè)分子質(zhì)量分別＞3.5 ku和＜3.0 u的果聚糖（命名HF和LF），結(jié)構(gòu)均為 1）-β-Fruf-（2 。HF和LF能促進(jìn)小鼠淋巴細(xì)胞增殖，增強(qiáng)腹腔巨噬細(xì)胞吞噬能力。Chen等［26］從川牛膝（Cyathula officinalis）中分離一個(gè)分子質(zhì)量1.4 ku的果寡糖CoPS3，結(jié)構(gòu)為β-D-果寡糖骨架，同時(shí)還有1，2和1，6-果糖支鏈及葡萄糖末端。CoPS3具有良好的抗腫瘤活性，能抑制小鼠Lewis肺癌生長(zhǎng)。Wu等［27］從沿階草（Ophiopogon japonicus）根中分離一個(gè)分子質(zhì)量為14 ku的果聚糖Opaw-2，骨架結(jié)構(gòu)為β-（1 2）-Fruf和β-（2 6）-Fruf，還有β-（1 2）-Fruf支鏈，能在10～100 mg·L-1范圍內(nèi)濃度依賴(lài)性促進(jìn)小鼠淋巴細(xì)胞的增殖。

本研究從懷牛膝中分離得到果寡糖ABP-50-FOS，研究其疫苗佐劑活性。該果寡糖能明顯提高H1N1流感疫苗免疫小鼠血清中抗原特異性IgG，IgG1和IgM抗體水平，同時(shí)還能促進(jìn)免疫小鼠脾T細(xì)胞及Th1和Th2細(xì)胞分化。體外實(shí)驗(yàn)表明，ABP-50-FOS能促進(jìn)小鼠脾T和B細(xì)胞增殖及IFN-γ分泌，刺激腹腔巨噬細(xì)胞分泌TNF-α，促進(jìn)樹(shù)突狀細(xì)胞活化和分泌IL-12p70。以上結(jié)果提示，牛膝果寡糖ABP-50-FOS能提高疫苗免疫小鼠的體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答能力，激活與抗原遞呈密切相關(guān)的巨噬細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞，對(duì)H1N1流感疫苗具有良好的疫苗佐劑活性。。其可能的作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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Adjuvant effect of fructooligosaccharide from Achyranthes bidentata on H1N1 influenza vaccine and immunocyte function

WANG Yan-yan1，2，LI Hai-xia2，WU Ya-jun2，ZHAO Xiu-nan2，MA Hao2，LIU Kun-lu2，WU Jun-hua2，
SHAN Jun-jie2*，WANG Yu-xia2*，WANG Hai-nan1，3*
（1.College of Pharmacy，Guizhou University，Guiyang 550025，China；2.Institute of Pharmacology and Toxicology，Academy of Military Medical Sciences，Beijing 100850，
China；3.China Food and Drug Administration，Beijing 100053，China）

OBJECTIVE To investigate chemical properties of a fructooligosaccharide（ABP-50-FOS）separated from Achyranthes bidentata and immune response in mice immunized H1N1 influenza vaccine.METHODS The methods of GPC，CE，IR and NMR were used to study chemical properties of ABP-50-FOS.BALB/c mice were immunized intramuscularly twice with H1N1 influenza vaccine （3 μg）plus ABP-50-FOS（200 μg）each mouse.The serum total antibody titer and its isotypes titers were analyzed by ELISA.The populations of CD4+，CD8+，CD3+and CD19+lymphocytes were determined by flow cytometry.The proliferation activities of spleen T and B lymphocytes were determined with MTT method.The levels of cytokines interferon-γ（IFN-γ），tumor necrosis factor-α（TNF-α），interleukin-4（IL-4），IL-12 and NO were measured by ELISA kits.RESULTS ABP-50-FOS was a fructooligosaccharide with moleculer mass 1885 u.Its bone linkages contained 1，2-and 1，6-fructose residues. ABP-50-FOS could induce high specific-IgG，IgG1，IgG2a，IgG2b and IgM titers after immunization with H1N1 influenza antigen twice（P＜0.01）.ABP-50-FOS significantly elevated the percentage of CD3+，CD4+and CD8+spleen lymphocytes and IFN-γ secretions（P＜0.01）in vitro.It also stimulated peritoneal macrophage of mice and DC2.4 dendritic cells to produce TNF-α and IL-12p70 respectively （P＜0.01）.However，ABP-50-FOS inhibited secretions of NO in macrophage.CONCLUSION The fructooligosaccharide ABP-50-FOS separated from A.bidentata can exhibit strong adjuvant activity for H1N1 influenza vaccine.

Achyranthes bidentata；polysaccharide；fructooligosaccharide；vaccine；adjuvant

The project supported by National Key Technology R&D Program（2011BAD26B02-3）

SHAN Jun-jie，E-mail：shanjunjie0012@126.com；WANG Yu-xia，E-mail：wangyuxia1962@ hotmail.com，Tel：（010）66931645；WANG Hai-nan，E-mail：md_wanghainan@126.com，Tel：（010）88330710

R285.5

A

1000-3002（2016）02-0113-09

10.3867/j.issn.1000-3002.2016.02.005

2015-08-31接受日期：2015-12-28）

（本文編輯：齊春會(huì)）

國(guó)家科技支撐計(jì)劃課題（2011BAD26B02-3）

汪艷艷，女，碩士研究生，主要從事多糖化學(xué)及生物活性的研究。

單俊杰，E-mail：shanjunjie0012@126.com，王玉霞，E-mail：wangyuxia1962@hotmail.com，Tel：（010）66931645；王海南，E-mail：md_wanghainan@126.com，Tel：（010）88330710