木林潔程錦國△姜程曦（.溫州醫(yī)科大學，浙江 溫州 325000；2.浙江中醫(yī)藥大學附屬溫州市中醫(yī)院，浙江 溫州325000）

腎病一號方總皂苷對腎纖維化大鼠的治療作用*

木林潔1，2程錦國1，2△姜程曦1
（1.溫州醫(yī)科大學，浙江 溫州 325000；2.浙江中醫(yī)藥大學附屬溫州市中醫(yī)院，浙江 溫州325000）

目的 觀察腎病一號方及其總皂苷對腎纖維化大鼠的治療作用。方法 雄性SD大鼠30只，隨機分為假手術組、UUO模型組、洛丁新組、腎病一號方組、總皂苷組。采用單側輸尿管結扎制作UUO大鼠模型，造模14 d后收集24 h尿液，采用雙縮脲法測定24 h尿蛋白含量（24 h UP）。處死大鼠取血清檢測尿素氮（BUN）和血肌酐（Scr），取腎組織行HE染色評價腎小管間質(zhì)纖維化損傷程度，免疫組化方法觀察轉化生長因子-β1 （TGF-β1）的表達情況。結果 腎病一號方組和總皂苷組大鼠腎纖維化明顯改善，TGF-β1表達水平降低，與模型組差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。結論 腎病一號方及其總皂苷能明顯改善腎纖維化，其作用機制可能是通過下調(diào)TGF-β1的表達，從而達到腎臟保護的作用。腎病一號方總皂苷可能是腎病一號方防治腎纖維化的藥效學物質(zhì)基礎之一。

腎纖維化 單側輸尿管結扎 轉化生長因子-β1

【Abstract】Objective：To observe the therapeutic effect of Nephropathy 1st decoction and saponin in renal fibrosis rats.Methods：30 male SD rats were randomly divided into the sham operation group，UUO model group，Lotensin group，Nephropathy 1st decoction group and saponin group.A rat model of renal fibrosis was induced by unilateral ureteral ligation.Rats were executed after 14 days.24 h urinary protein（24h UP），serum blood urea nitrogen（BUN）and serum creatitine（Scr）were tested.Renal tubular interstitial fibrosis was evaluated by Hematoxylin and eosin staining（HE）.The expression of transforming growth factor-beta 1（TGF-β1）was observed with immunohistochemical method.Results：The improvement of renal fibrosis in Nephropathy 1st decoction group and saponin group was obvious；the expression level of TGF-β1 decreased and compared with the model group，there were significant differences（P＜0.05）.Conclusion：Nephropathy 1st decoction and saponin may ameliorate renal interstitial fibrosis by down-regulating the expression levels of TGF-β1.Saponin may be one of the pharmacodynamic material bases of Nephropathy 1st decoction.

【Key words】Renal fibrosis；Unilateral ureteral obstruction；Transforming growth factor-beta 1

隨著我國人口老齡化以及糖尿病、高血壓患病人數(shù)的增加，慢性腎臟病的發(fā)病率正在逐年上升［1］，給家庭和社會帶來了巨大壓力。慢性腎臟病在人類死亡的主要原因中仍然居于第5位至9位之間。因此，慢性腎功能衰竭仍然是人類生存的重要威脅之一［2］。研究表明腎纖維化是各種慢性腎臟疾病進展至終末期的共同通路［3］。中醫(yī)藥對防治腎纖維化具有獨特的優(yōu)勢，腎病一號方是溫州市中醫(yī)院腎病科長期臨床經(jīng)驗總結得出的抗腎纖維化的基本方，具有較好的臨床療效［4-5］。為了進一步探討其藥用價值，對其有效部位進行分離，總皂苷是其主要有效部位之一。已有研究表明中草藥皂苷類有效成分具有一定的免疫調(diào)節(jié)和抗腎小球硬化的作用［6-7］。在此筆者將探討腎病一號方總皂苷對UUO大鼠模型腎纖維化及轉化生長因子-β1的影響?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康雄性SD大鼠30只，普通級，體質(zhì)量（185±10）g，由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供［許可證號SCXK（滬）2012-0002］。

1.2 藥物與試劑 腎病一號方由柴胡6 g，黃芩12 g，半夏12 g，白芍30 g，土茯苓30 g，半枝蓮30 g，菝葜30 g，漏蘆30 g等組成，由溫州市中醫(yī)院提供。洛丁新（編號12294563，鹽酸貝那普利片，北京諾華制藥）?？筎GF-β1抗體（abcam，產(chǎn)品編號ab92486）；一抗稀釋液（A1810，北京索萊寶生物科技公司）；濃縮型DAB顯色試劑盒（北京中杉金橋公司）；免疫組化一步法聚合物檢測系統(tǒng)（PV6001，北京中杉金橋公司）；蘇木精-伊紅染色（HE）試劑盒（北京索萊寶生物科技公司）。超低溫冰箱，中國海爾 DW-86L626；光學顯微鏡，日本Olympus BX51；微量加樣槍，德國Eppendorf公司；病理切片機，德國Leica RM2235；組織脫水機，鄭州南北儀器設備有限公司，KD-TS3A；全自動生化分析儀，美國Beckman Coulter AU5800。腎病一號方經(jīng)水提醇沉法得到初提藥液，然后采用乙醚、乙酸乙酯、正丁醇等提取分離，得到含70%總皂苷成分的腎病一號方制劑［8］。

1.3 造模與分組 實驗大鼠適應性喂養(yǎng)1周后隨機分為假手術組、模型組、洛丁新組、腎病一號方組和總皂苷組，各6只。本實驗采用單側輸尿管結扎（UUO）實驗動物模型［9］，10%水合氯醛3.5 mL/kg腹腔注射麻醉下行左側輸尿管結扎，從背部距左側脊肋角1.5 cm處做一斜向切口，逐層切開后暴露左側腎臟，尋找左側輸尿管并游離，于約腎盂處和輸尿管上1/3處雙重結扎，回納腎臟并逐層縫合。假手術組開腹后只游離左側輸尿管不進行結扎［10］。30只大鼠隨機分為假手術組、模型組、洛丁新組、腎病一號方組、總皂苷組各6只。

1.4 給藥方法 根據(jù)動物與人體的每千克體質(zhì)量劑量折算系數(shù)表計算給藥劑量［11］，洛丁新組按1.67 mg/ （kg·d）灌胃，腎病一號方組以相當于生藥18.75 g/（kg·d）灌胃，皂苷組按160 mg/（kg·d）灌胃，假手術組、模型組予等量0.9%氯化鈉注射液灌胃，造模后第2日開始灌胃，每日1次，連續(xù)14 d。給藥14 d后處死大鼠，留取血、尿樣本和腎組織樣本。

1.5 標本采集與檢測 1）血尿生化指標。給藥14 d后將大鼠放在干凈的代謝籠中收集24 h尿液，采用雙縮脲法測定24 h尿蛋白含量。采用10%水合氯醛3.5 mL/kg腹腔注射麻醉大鼠，固定大鼠后心臟取血3～5 mL，離心后取血清保存于-20℃冰箱，通過全自動生化分析儀檢測血肌酐和血尿素氮 （溫州市中醫(yī)院檢驗科提供）。2）腎臟病理學檢查方法。腎臟組織經(jīng)4%多聚甲醛溶液固定24 h，常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋，制成3.0 μm薄片，行HE染色，光學顯微鏡下觀察腎臟組織病理學改變。每張切片隨機選取5個視野連續(xù)不重復視野（×400），依據(jù)每個視野腎小管病變累及的小管數(shù)目評定腎小管間質(zhì)損傷指數(shù)［12］。腎小管間質(zhì)損傷評分：0分為腎小管結構正常，未見病變；l分為小管病變數(shù)目＜3個；2分為腎小管病變累及數(shù)目3～5個；3分為小管病變數(shù)目＞5個或腎小管結構消失。3）免疫組織化學檢查方法。石蠟切片常規(guī)脫蠟水化，pH6.0檸檬酸鹽緩沖液高壓修復抗原，滴加抗TGF-β1抗體 （1∶200），4℃孵育18 h，根據(jù)免疫組化一步法聚合物檢測系統(tǒng)滴加二抗，室溫孵育30 min。DAB處理1 min，顯微鏡下控制著色時間，蘇木素復染2 min后脫水、透明、封片［13］。光學顯微鏡下觀察，400倍視野下，每張切片隨機選取6個非重疊視野，采用Image Pro Plus 6.0軟件測量每個視野下平均積分光密度值 （IOD），以IOD值反映組織切片中陽性物質(zhì)的表達程度。

1.6 統(tǒng)計學處理 應用SPSS19.0統(tǒng)計軟件處理。計量資料以（±s）表示，多個樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗，方差不齊時采用Dunnett T3檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 各組大鼠血、尿生化指標比較 見表1。與假手術組相比，模型組和各處理組大鼠血肌酐、血尿素氮明顯上升（P＜0.05）。與模型組對比，洛丁新組、腎病一號方組和總皂苷組大鼠血肌酐、血尿素氮明顯降低 （P＜0.05）。而24 h尿蛋白定量各組間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），

表1 各組大鼠血、尿生化指標比較（±s）

表1 各組大鼠血、尿生化指標比較（±s）

與假手術組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05。下同。

組別 n 24 h UP（mg/L）假手術組 6 415.00±201.78模型組 6 444.50±170.00洛丁新組 6 313.17±108.56 Scr（μmol/L）BUN（μmol/L）19.33±1.97 7.57±0.43 48.83±5.19*14.96±1.24*22.50±2.89*△9.97±0.30*△腎病一號方組 6 373.66±153.90 27.83±3.97*△12.04±0.75*△總皂苷組 6 27.67±3.61*△12.16±0.95*△372.33±95.35

2.2 各組腎臟組織病理改變 見圖1，表2。HE染色結果顯示，假手術組未見明顯的病理改變，腎小球、腎小管結構正常，腎間質(zhì)無明顯炎癥細胞浸潤。模型組腎小管上皮細胞出現(xiàn)大量變性和壞死，管腔擴張，間質(zhì)增寬，大量炎癥細胞浸潤，腎間質(zhì)纖維化程度嚴重；洛丁新組、腎病一號方組和總皂苷組的腎小管損傷程度較模型組明顯減輕，但3組之間腎小管損傷程度對比不明顯。腎小管間質(zhì)損傷指數(shù)比較：與假手術組比較，其他各組腎間質(zhì)損傷指數(shù)顯著增加（P＜0.05）；與模型組比較，洛丁新組、腎病一號方組和總皂苷組的腎間質(zhì)損傷程度下降（P＜0.05），但3個治療組之間差異不明顯（P＞0.05）。

2.3 各組TGF-β1的表達比較 見圖2，表3。免疫組化染色顯示，與假手術對比，假手術組腎臟幾乎不表達或者低表達TGF-β1；其他各組大鼠腎小管中TGF-β1均有不同程度的表達（P＜0.05）；與模型組對比，模型組陽性表達強，腎間質(zhì)中可見大量棕黃色顯色，洛丁新組、腎病一號方組和總皂苷組的陽性表達則相對減弱（P＜0.05）。洛丁新組、腎病一號方組和總皂苷組之間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

圖1 各組大鼠腎組織病理學改變（HE染色，400倍）

表2 各組大鼠腎小管間質(zhì)損傷指數(shù)比較（分，±s）

表2 各組大鼠腎小管間質(zhì)損傷指數(shù)比較（分，±s）

?

表3 各組大鼠腎間質(zhì)TGF-β1表達比較（±s）

表3 各組大鼠腎間質(zhì)TGF-β1表達比較（±s）

組別 n假手術組 6模型組 6洛丁新組 6 IOD值1.63±0.18 22.55±5.89*11.37±1.85*△腎病一號方組 6 11.56±1.15*△總皂苷組 6 10.98±0.68*△

圖2 各組大鼠腎間質(zhì)中TGF-β1的表達（HE染色，400倍）

3 討 論

大量研究表明各種慢性腎臟疾病進展至終末期的共同通路都是腎間質(zhì)纖維化［1］。目前認為腎臟纖維化形成的分子機制主要分4個階段：第1階段是細胞的活化和受損。第2階段是促纖維化因子的釋放。第3階段是纖維化的形成。第4階段是腎臟結構和功能受損［14］。在生理狀態(tài)下，TGF-β1在腎小管上皮細胞微表達。病理狀態(tài)下，活化的腎間質(zhì)細胞大量分泌TGF-β1促進腎間質(zhì)纖維化的進展。TGF-β1被認為是促進腎間質(zhì)纖維化的最重要作用因子［15］。因此TGF-β1的表達對于腎間質(zhì)纖維化進展及預后具有重要意義。

中醫(yī)學認為各種腎臟疾病的根本病機是本虛標實，虛實夾雜。本虛為脾腎兩虛，而標實則以濕濁、濕熱、瘀血、毒邪、風邪為主，各方面相互交織，最終導致腎纖維化。腎病一號方是溫州市中醫(yī)院腎病科在臨床長期應用的經(jīng)驗方。本方根據(jù)病機特點，將小柴胡湯作為君藥，主入三焦，使三焦樞機調(diào)暢，加上土茯苓、半枝蓮清熱除濕解毒，菝葜解毒化瘀，從而調(diào)暢三焦氣機，祛除三焦?jié)嵝?。課題組前期研究已經(jīng)證實腎病一號方可能通過減少GMC（系膜細胞）和FN（纖維連接蛋白）的分泌，下調(diào)IL-6 mRNA表達，抑制大鼠腎小球系膜細胞增殖，從而發(fā)揮抗腎臟纖維化的作用［3］。然而，以上研究沒有揭示腎病一號方抗腎纖維化的藥效學物質(zhì)基礎，因此，我們對其有效部位進行分離，得到純化的腎病一號方總皂苷成分，通過動物實驗檢測大鼠腎臟TGF-β1的表達，進一步探討腎病一號方及其總皂苷防治腎纖維化的可能機制和腎病一號方抗腎纖維化的藥效學物質(zhì)基礎。

該研究結果顯示，腎病一號方及其總皂苷能夠有效降低腎纖維化大鼠腎臟血肌酐和血尿素氮，同時能下調(diào)UUO大鼠腎間質(zhì)TGF-β1蛋白表達水平。綜上，第一，腎病一號方及其總皂苷具有延緩腎纖維化發(fā)生發(fā)展的作用，其作用機制可能是下調(diào)腎間質(zhì)TGF-β1蛋白表達水平，從而抑制細胞外基質(zhì)沉積，達到抗腎纖維化的作用。第二，腎病一號方總皂苷成分可能是其發(fā)揮抗纖維化作用的藥效學物質(zhì)基礎之一。中醫(yī)藥在防治腎纖維化中具有獨特優(yōu)勢，然而其藥效學物質(zhì)基礎十分復雜，無論是腎病一號方還是其他中藥復方，其發(fā)揮作用的藥效學機制都有待進一步探索。

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The Therapeutic Effect of Nephropathy 1st Decoction and Saponin in Renal Fibrosis Rats

MU Linjie，CHENG Jinguo，JIANG Chengxi.Wenzhou Medical University，Zhejiang，Wenzhou 325000，China.

·研究報告·

R285.5 文獻標志碼：A

1004-745X（2016）08-1493-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2016.08.011

浙江省藥學重中之重一級學科開放基金（YKFJ005）；2015年溫州市中醫(yī)藥建設資助項目

（電子郵箱：wsjcjg@126.com）

2016-04-10）