周榮匯， 陳躍敏， 汪育敏， 涂玉旺， 黃曉晶

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改良三聯(lián)抗生素糊劑在犬牙髓血管再生術中的應用

周榮匯1， 陳躍敏1， 汪育敏2， 涂玉旺2， 黃曉晶1

目的研究改良三聯(lián)抗生素糊劑在犬牙髓血管再生術中對牙齒變色、根管消毒和牙根繼續(xù)發(fā)育的作用。方法取4只6月齡Beagle犬，隨機抽取20顆牙作為實驗牙建立慢性根尖周炎模型。采用改良的三聯(lián)抗生素糊劑(將其中的米諾環(huán)素替換為頭孢克洛)行根管消毒后刺激根尖形成血凝塊并嚴密封閉冠部。3月后觀察牙體變色情況，對實驗牙拍攝根尖X線片并行蘇木素-伊紅染色。結果3月后有4顆出現(xiàn)不同程度變色；90%實驗牙炎癥得到控制；實驗牙均有不同程度的根尖暗影縮小、根尖孔縮小、牙根長度增長、管壁增厚。結論采用改良的三聯(lián)抗生素糊劑中的進行根管消毒，不僅發(fā)生牙體變色的風險低，且獲得了良好的根管消毒效果，牙根繼續(xù)發(fā)育。

血管/生理學； 牙； 牙髓； 牙根； 根尖周炎； 慢性病； 根管沖洗劑； 根管療法； 消毒

2001年，牙髓血管再生術首先在人年輕恒牙根尖周炎的治療中取得成功[1]，隨后有學者在臨床和動物模型上對該方法的療效及機理進行驗證和深入研究[2-4]。但是人們發(fā)現(xiàn)采用牙髓血管再生術后常常出現(xiàn)牙齒變色[5-7]。已有研究證實，根管消毒使用的三聯(lián)抗生素糊劑(triple antibiotic paste，TAP)中的米諾環(huán)素可增加牙齒變色的風險[6-7]。本研究通過將傳統(tǒng)TAP中的米諾環(huán)素替換為頭孢克洛，評估改良后的TAP對感染根管的牙體變色、消毒效果和根尖區(qū)新生組織構成的影響。同時，通過動物實驗評估牙髓血管再生術對牙根繼續(xù)發(fā)育的影響，為該方法進一步運用于臨床提供實驗依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1動物雄性健康6月齡Beagle犬4只，8～9 kg[成都達碩生物科技有限公司，許可證號：SCXK(川)2013-24]。

1.1.2藥物甲硝唑(批號：H4402412，廣東康美藥業(yè)有限公司)；環(huán)丙沙星(批號：H33020388,浙江京新藥業(yè))；頭孢克洛(批號：H10960083,廣州白云山制藥股份有限公司)；膠原纖維栓(美國Zimmer公司)；礦化三氧化物聚合體(mineral trioxide aggregate，MTA，美國Densply公司)；流體樹脂(日本Kuraray公司)；布洛芬(批號：H20013193，西南藥業(yè)股份有限公司)。

1.1.3儀器便攜式拍片機(BL-X5，華潤口腔材料有限公司)；熒光倒置相差顯微鏡及照相系統(tǒng)(CKX41，日本Olympus公司)；組織攤烤烘片機(KD-PⅢ，浙江省金華市科迪儀器設備有限公司)；組織包埋機(KD-BMIII，浙江省金華市科迪儀器設備有限公司)。

1.2方法

1.2.1慢性根尖周炎(chronic apical periodontitis，CAP)模型的建立選取4只Beagle犬，在每只犬上頜雙側第2，3前磨牙及下頜雙側第2，3，4前磨牙中隨機抽取30顆牙作為實驗用牙，其中10顆牙作為健康對照組，余20顆實驗牙均建立CAP模型。術前拍X線片。在無菌條件下，先用桃形金剛砂車針磨除牙尖，2#快機球鉆開髓，拔髓針拔出牙髓組織。從犬牙刮取的齦上菌斑與生理鹽水混合，用小棉球蘸取后置于髓腔，Cavit暫封[2]。術后X線片監(jiān)視根尖情況，每周1次，根據(jù)根尖周指數(shù)(periapical index，PAI)標準進行評價[8]：當根尖X線影像分級≥2級(根尖孔以外的根周膜不規(guī)則增寬，其上方骨質(zhì)結構輕度紊亂，部分骨小梁粗細不均，根面可有吸收)時即可診斷為根尖周炎(圖1)。

1.2.2根管消毒改良抗生素糊劑的制備：甲硝唑、環(huán)丙沙星、頭孢克洛去除糖衣，研磨成粉末，按重量比1∶1∶1混合均勻，加生理鹽水調(diào)拌至稀糊狀備用，終濃度為0.1 g/mL。犬術前禁食，全身麻醉后拍攝術前根尖X線片，成功建立CAP模型后，去除實驗牙冠方暫封物和棉球，0.5%次氯酸鈉(sodium hypochlorite，NaClO)使用側方開口沖洗針緩慢沖洗(10 mL/根管)，待沖洗液清亮無雜質(zhì)后，無菌紙尖拭干根管。將改良TAP放入注射器后注射于根管中，根據(jù)術前根尖X線片確定牙根長度，注射針頭進入的深度為牙根長度約2/3，以減少對根尖周圍組織的損傷。注射的糊劑止于根管口，濕棉球拭凈髓腔，去除多余糊劑，Cavit暫封。術后隨訪觀察實驗牙的牙體變色情況、暫封物和牙齦情況。若牙齦出現(xiàn)膿腫或瘺管，或根尖暗影繼續(xù)擴大，或3周后去除冠方暫封物后仍有膿血，則提示根管內(nèi)炎癥未控制，需更換TAP至炎癥消除。

1.2.3刺激形成血凝塊取無菌25# K銼刺激根尖出血，液平面位于根管口下方約2～4 mm，用無菌小棉球蘸生理鹽水擠干后置于髓腔中，靜置約15 min。形成血凝塊后去除髓腔中的小棉球，膠原纖維栓覆蓋于血凝塊表面，便于后續(xù)MTA的充填。濕棉球拭凈髓腔。在膠原纖維栓和根管口之間放置MTA，用濕棉球拭凈髓腔中多余的MTA，并在髓腔內(nèi)放置濕棉球，30 min后去除濕棉球，輕吹干，自酸蝕后流體樹脂分層光照固化，嚴密封閉。

術后實驗牙采用平行投照的方法拍攝根尖X線片，動物完全蘇醒后喂服布洛芬，每只0.1 g，進軟食。觀察3月。觀察期間嚴密關注實驗牙是否出現(xiàn)牙體變色、瘺管，牙齒及充填物是否折裂、脫落等。

1.2.4X線片觀察X線片觀察指標：(1)根尖暗影是否有縮小趨勢；(2)根尖孔是否有縮小的趨勢；(3)牙根長度是否增長；(4)根管壁是否增厚。由同一位實驗員作為X線片觀察者。

1.2.5組織病理學檢測經(jīng)上述拍攝完根尖X線片后，犬在仍處于全身麻醉狀態(tài)下正中切開頸部皮膚，分離肌肉和筋膜，在頸動脈鞘內(nèi)小心分離并暴露頸總動脈、頸內(nèi)靜脈和迷走神經(jīng)。結扎雙側頸總動脈近心端，迅速于遠心端插管并固定后剪斷雙側頸內(nèi)靜脈。雙側同時用1 500 mL PBS液灌注置換至沖洗液清亮，后改用4%中性多聚甲醛約1 500 mL重復上述操作，待犬口腔粘膜顏色發(fā)白、質(zhì)地變硬即完成多聚甲醛的灌注內(nèi)固定。拔出健康對照牙和實驗牙，置于4%中性多聚甲醛中，室溫下固定48 h。流水沖洗30 min，10%中性EDTA溶液浸泡脫鈣6月，每3～4天更換1次，至細針可輕松刺入骨和牙體組織即可完成脫鈣。流水沖洗1 h并去除牙冠，后按照以下步驟進行操作：(1)脫水：70%酒精3 h，80%酒精3 h，90%酒精3 h，95%酒精1.5 h，無水乙醇+正丁醇(1∶1)1.5 h，正丁醇5 h。(2)浸蠟：正丁醇+石蠟(1∶1)1 h，石蠟I(56～58 ℃)1 h，石蠟Ⅱ(60～62 ℃)1 h。(3)石蠟包埋與切片：樣本使用自動石蠟包埋機進行包埋，待冷卻后用半自動石蠟切片機切片，沿通過根尖孔的牙體長軸切4 μm的石蠟切片，60～62 ℃烤片2 h，脫蠟入水，蘇木素-伊紅(H-E)染色，中性樹膠封片，鏡下觀察結果。

2　結　果

2.1改良TAP根管消毒效果及牙體變色情況改良TAP消毒3周后，2組牙的牙冠均未發(fā)生變色。但其中有2顆實驗牙牙齦出現(xiàn)瘺管，X線片示根尖暗影較術前擴大。上述2顆實驗牙去除暫封物后根管內(nèi)仍有膿血，其余實驗牙未出現(xiàn)上述癥狀，即有90%的實驗牙控制了炎癥。對于TAP消毒3周后炎癥仍未控制的，則更換TAP糊劑；至第4周時均未再出現(xiàn)瘺管，去除暫封物后根管內(nèi)無膿血。

進行牙髓血管再生術后3月，實驗牙均未再發(fā)現(xiàn)瘺管，充填物均未脫落。與健康對照牙比較，20顆實驗牙中4顆出現(xiàn)不同程度變色，透過表層的釉質(zhì)和牙本質(zhì)可見髓腔呈暗灰色(圖2)。

2.2X線片術后3月實驗組18顆根尖暗影有縮小趨勢，10顆根尖孔有縮小趨勢，12顆牙根長度增長，11顆管壁增厚。健康對照組中10顆牙根尖無暗影，牙根長度增長，管壁增厚，根尖孔縮小。

2.3H-E染色20顆實驗牙共40個根管內(nèi)均有血管、類牙骨質(zhì)、類骨以及類牙周膜等組織生成。新生組織由根管外側壁向根管內(nèi)側長入。實驗牙根管內(nèi)均未發(fā)現(xiàn)新生牙本質(zhì)的形成。實驗牙根管壁增厚主要來源于類牙骨質(zhì)貼著牙本質(zhì)內(nèi)壁由下向上生長，其內(nèi)部無牙本質(zhì)小管，但含牙骨質(zhì)樣細胞(圖3)。新生的類骨樣組織不直接貼附在牙本質(zhì)壁上，而是以鈣化小島或骨樣小梁形成于根管中(圖4)。健康對照組中根管腔內(nèi)見牙髓組織，內(nèi)含大量成纖維細胞、血管內(nèi)皮細胞等，根管內(nèi)側壁可見成牙本質(zhì)細胞呈柵欄狀附于牙本質(zhì)層上。

3　討　論

既往研究報道中較常使用雜種犬作為實驗動物[4,9-10]，但由于該種犬攻擊性強、個體差異大等因素，本研究中選用Beagle犬。與雜種犬比較，該犬性格溫和，遺傳性疾病少，實驗重復性好，尤其適合藥理、循環(huán)生理、毒理、外科學等研究，是國際醫(yī)學、生物學界公認的較理想的實驗用犬。鐘小奕的研究采用1只犬進行實驗[4]，而本研究選用4只犬，降低了因個體差異對實驗造成的影響。

傳統(tǒng)的TAP除了因含抗生素導致部分患者可能出現(xiàn)過敏癥狀外，還存在使牙齒變色的風險。已證實牙齒變色來源于TAP中的米諾環(huán)素[6-7]。Thibodeau和Trope在臨床上用頭孢克洛代替米諾環(huán)素，不僅取得良好的消毒效果，而且牙齒未出現(xiàn)變色[7]。本研究將傳統(tǒng)TAP中的米諾環(huán)素更改為頭孢克洛，經(jīng)改良TAP消毒3周后，20顆實驗牙牙冠均未發(fā)生變色。但觀察3月后，20顆實驗牙中4顆出現(xiàn)不同程度變色，透過表層的釉質(zhì)和牙本質(zhì)可見髓腔呈暗灰色。文獻證實，在臨床上使用甲硝唑、環(huán)丙沙星、頭孢克洛的TAP進行根管消毒后并不會引起牙齒變色[7]，故本研究出現(xiàn)牙冠變色更可能是由于以下因素引起：(1)根管內(nèi)殘留的血液。年輕恒牙根尖區(qū)血運功能旺盛，刺激出血液后溢至髓腔中而未拭凈，或是MTA充填完成后仍有血液滲出，這些紅細胞殘留于髓腔中，其分解產(chǎn)生的色素滲入牙本質(zhì)小管中使牙本質(zhì)變色，透過釉質(zhì)而使牙齒呈現(xiàn)暗灰色。(2)MTA。MTA有良好的生物學活性，可刺激根尖區(qū)組織再生[11-12]。MTA還是優(yōu)良的封閉劑，在根管口起到嚴格封閉冠方的作用。但MTA有造成牙齒變色的風險[5,13-14]，且變色的部位主要是MTA本身，因此建議將TAP置于釉牙骨質(zhì)界以下[15]。

傳統(tǒng)的TAP(甲硝唑、環(huán)丙沙星、米諾環(huán)素)對于壞死感染根管內(nèi)常見的細菌有很好的效果[16]。Windley等在患有慢性根尖周炎犬牙根管內(nèi)使用濃度為20 mg/ mL的TAP消毒，具有很好的根管消毒效果[17]。本研究將傳統(tǒng)三聯(lián)抗生素中的米諾環(huán)素更改為頭孢克洛。頭孢克洛是廣譜半合成頭孢菌素類抗生素，對多種革蘭氏陽性和陰性菌均具有較強的殺滅作用。本研究中經(jīng)改良TAP消毒3周后，90%的實驗牙控制了炎癥，說明本研究雖改變了TAP的組成，將米諾環(huán)素更改為頭孢克洛，但仍取得了良好的根管消毒效果。同時影像學觀察顯示，共有10顆牙根尖孔有縮小趨勢，12顆牙根長度增長，11顆管壁增厚，因此改良的TAP根管消毒效果值得肯定。

對于部分消毒不夠完善的實驗牙，推測主要是由于操作因素引起的：(1)建立CAP模型時根管內(nèi)感染程度較嚴重，僅1次的TAP消毒不足以消滅細菌；(2)根管內(nèi)注射TAP時未達到根管長度的2/3，或在根尖區(qū)形成氣泡，對根尖區(qū)的消毒不夠完善；(3)由于犬牙牙冠形態(tài)呈尖圓形，且磨除牙尖后臨床牙冠短，較難使用橡皮障對牙齒進行隔離，為避免5.25% NaClO流入口腔刺激黏膜，故選用低濃度0.5% NaClO進行根管沖洗，從而降低了與TAP協(xié)同抗菌的效果。

針對以上問題，后期研究將進行以下改進：(1)當根尖X線影像分級達2級時即認為CAP建模成功，及時進行根管消毒；(2)根管消毒時采用注射器注射和螺旋輸送器相結合的方式導入TAP，盡量減少產(chǎn)生氣泡；(3)根管消毒時采用復合樹脂暫時固定橡皮障的方法對犬牙進行隔離，并使用5.25% NaClO進行根管沖洗，增加與TAP協(xié)同抗菌的作用。

20顆實驗牙共40個根管內(nèi)均有的血管、類牙骨質(zhì)、類骨以及類牙周膜等組織生成，與Zhu等的結果相似[18]。根管內(nèi)新生組織可能來源于牙周膜、根尖區(qū)殘留的上皮根鞘、牙囊細胞等。本研究是在構建了CAP模型的基礎上進行牙髓血管再生術，上皮根鞘、牙囊細胞等可能都遭受不同程度的破壞。而牙周膜來源的細胞較廣泛地分布于根管壁外側區(qū)，數(shù)量大，且結構和功能都保存較為完整。且本研究中觀察到類牙周組織(如類牙骨質(zhì)、類骨、類牙周膜)由根管的外側壁及根尖區(qū)向根管內(nèi)部生長的趨勢，因此推測根管內(nèi)的新生物主要來源于牙周膜。

本研究將傳統(tǒng)TAP中的米諾環(huán)素替換為頭孢克洛進行根管消毒，不僅發(fā)生牙體變色的風險低，而且獲得了良好的根管消毒效果，牙根繼續(xù)發(fā)育。但結果仍需進一步的臨床觀察和驗證。組織學發(fā)現(xiàn)根尖區(qū)新生的組織包含了類牙骨質(zhì)、類骨以及類牙周膜等組織，而無牙本質(zhì)的形成，與Wang等的結果相同[2,19-20]。是否能通過在刺激根尖出血形成血凝塊的基礎上添加生長因子或生物支架從而促進牙本質(zhì)的形成，尚需進一步的研究和探討。

[1]Iwaya S I,Ikawa M,Kubota M. Revascularization of an immature permanent tooth with apical periodontitis and sinus tract[J].DentTraumatol,2001,17(4):185-187.

[2]Wang X,Thibodeau B,Trope M,etal. Histologic characterization of regenerated tissues in canal space after the revitalization/revascularization procedure of immature dog teeth with apical periodontitis[J].JEndod,2010,36(1):56-63.

[3]陳敏,劉雪梅,包志凡,等. 犬年輕恒牙根尖周炎和再生性牙髓治療后組織學觀察[J]. 中國實用口腔科雜志,2015,8(9): 532-535.

[4]鐘小奕. 年輕恒前牙感染根管內(nèi)血管再生的動物實驗研究[J]. 華西口腔醫(yī)學雜志,2010,28(6):672-674.

[5]Belobrov I,Parashos P. Treatment of tooth discoloration after the use of white mineral trioxide aggregate[J].JEndod,2011,37(7): 1017-1020.

[6]Huang G T. A paradigm shift in endodontic management of immature teeth: conservation of stem cells for regeneration [J].JDent,2008,36(6): 379-386.

[7]Thibodeau B, Trope M. Pulp revascularization of a necrotic infected immature permanent tooth: case report and review of the literature[J].PediatrDent,2007,29(1): 47-50.

[8]S Huumonen D. Radiological aspects of apical periodontitis[J].EndodonticTopics,2002,1(1):3-25.

[9]文春媚,黃楊,陳文霞,等. 犬年輕恒牙血管再生法動物模型建立的影響因素[J]. 臨床口腔醫(yī)學雜志,2011,27(6):340-342.

[10]王雪梅,何臨海,孟松,等. 常用根管消毒藥物對犬牙根管內(nèi)優(yōu)勢致病菌消毒作用研究[J]. 牙體牙髓牙周病學雜志,2012,22(4):238-240.

[11]Kettering J D,Torabinejad M. Investigation of mutagenicity of mineral trioxide aggregate and other commonly used root-end filling materials[J].JEndod,1995,21(11):537-542.

[12]Saad A Y. Calcium hydroxide and apexogenesis[J].OralSurgOralMedOralPathol,1988,66(4):499-501.

[13]Petrino J A,Boda K K,Shambarger S,etal. Challenges in regenerative endodontics: a case series[J].JEndod,2010,36(3):536-541.

[14]Boutsioukis C, Noula G, Lambrianidis T.Exvivostudy of the efficiency of two techniques for the removal of mineral trioxide aggregate used as a root canal filling material[J].JEndod,2008,34(10):1239-1242.

[15]Law A S. Considerations for regeneration procedures [J].JEndod,2013,39(3):44-56.

[16]Hoshino E,Kurihara-Ando N,Sato I,etal.In-vitroantibacterial susceptibility of bacteria taken from infected root dentine to a mixture of ciprofloxacin, metronidazole and minocycline[J].IntEndodJ,1996,29(2):125-130.

[17]Windley W,Teixeira F,Levin L,etal. Disinfection of immature teeth with a triple antibiotic paste [J].JEndod,2005,31(6):439-443.

[18]Zhu X,Zhang C,Huang G T,etal. Transplantation of dental pulp stem cells and platelet-rich plasma for pulp regeneration[J].JEndod,2012,38(12):1604-1609.

[19]Chanda P M,Hegde K S,Bhat S S,etal. Tissue engineering in endodontics: root canal revascularization[J].JClinPediatrDent,2014,38(4):291-297.

[20]Silva L A,Nelson-Filho P,Silva R A,etal. Revascularization and periapical repair after endodontic treatment using apical negative pressure irrigation versus conventional irrigation plus triantibiotic intracanal dressing in dogs’ teeth with apical periodontitis[J].OralSurgOralMedOralPatholOralRadiolEndod,2010,109(5):779-787.

(編輯:張慧茹)

Pulp Revascularization of Dog Tooth Using Modified Triple Antibiotic Paste

ZHOU Ronghui1, CHEN Yuemin1, WANG Yumin2, TU Yuwang2, HUANG Xiaojing1

1.Department of Endodontics, The Affiliated Stomatological Hospital, Fujian Medical University, Fuzhou 350002, China；2.College of Stomatological, Fujian Medical University, Fuzhou 350004, China

ObjectiveTo investigate the effects of modified triple antibiotic paste to pulp revascularization of dog tooth on tooth discoloration,root canal disinfection, and root continued development.MethodsFour 6-month-old Beagles were used and 30 premolar teeth were randomly selected from each dog premolar teeth as experiment teeth.20 teeth were used in the experimental group and to establish model of chronic periapical.Disinfecting the root canal with modified triple antibiotic paste, bleeding into canals was evoked by over-instrumentation into apical tissues with K-file allowing the formation of a blood clot and the coronal portions were sealed.Radiographs and H-E staining were performed to observe periapical radiolucent areas after 3 months.ResultsAfter 3 months, there were 4 teeth discoloration in 20 teeth.90% teeth had inflammation controlled.There were improvements of different degree in root canals periapical lesion healing, apical closure, and increases in length and thickness.ConclusionThe modified triple antibiotic has a lower risk on tooth discoloration, a good root canal disinfection and continued root development.

blood vessels/physiology； tooth； dental pulp； tooth root； periapical periodontitis； chronic disease； root canal irrigants； root canal therapy； disinfection

2015-12-23

福建省自然科學基金重點項目(2012Y0029)；福建省衛(wèi)生系統(tǒng)中青年骨干人才培養(yǎng)重點項目(2014-ZQN-ZD-21)

1.福建醫(yī)科大學 附屬口腔醫(yī)院牙體牙髓科，福州350002;

2.福建醫(yī)科大學 口腔醫(yī)學院，福州350004

周榮匯(1987-)，男，住院醫(yī)師，醫(yī)學碩士

黃曉晶. Email: hxiaoj@163.com

R322.41； R331.32； R781.05； R781.2； R781.3； R944.9； R978.1

A

1672-4194(2016)02-0121-05