呂　彪，宋志元，儲(chǔ)　君，孫雪峰，張要齊*

（1.河南省新密市動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所，河南新密452370；2.河南惠通天下生物工程有限公司，河南新鄭451162）

20種中草藥提取物對(duì)4種常見(jiàn)病原菌體外抑菌試驗(yàn)

呂彪1，宋志元2，儲(chǔ)君2，孫雪峰2，張要齊*2

（1.河南省新密市動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所，河南新密452370；2.河南惠通天下生物工程有限公司，河南新鄭451162）

∶為了觀察中草藥對(duì)病原菌的體外抑菌效果，本試驗(yàn)采用水煎煮法提取大黃、黃連和黃芩等20種中草藥活性成分，利用試管二倍稀釋法分別測(cè)定中草藥提取物對(duì)4種常見(jiàn)病原菌（豬鏈球菌、金黃色葡萄球菌、巴氏桿菌和大腸桿菌）的最小抑菌濃度（MIC）和最小殺菌濃度（MBC）。結(jié)果顯示，大黃、黃連、黃芩、地錦草、石榴皮和白頭翁等對(duì)大腸桿菌的體外抑菌效果較好，其中大黃和黃連的效果最好；大黃對(duì)巴氏桿菌的體外抑菌效果較好，MIC為62.5mg/ml；黃連、黃柏和白頭翁對(duì)豬鏈球菌的體外抑菌效果較好，其中黃連的MIC＜1.95mg/ml，MBC為31.25mg/ml；黃連、黃柏、大黃和柴胡對(duì)金黃色葡萄球菌的體外抑菌效果較好，其中黃連和黃柏的MIC分別為3.91和15.6mg/ml。

∶體外抑菌；試管二倍稀釋法；最小抑菌濃度；最小殺菌濃度

隨著我國(guó)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和人們生活水平的提高，肉類消費(fèi)品的需求量大幅提高，畜禽養(yǎng)殖朝著規(guī)?；推髽I(yè)化的方向發(fā)展。但由細(xì)菌引起的疾病對(duì)養(yǎng)殖業(yè)沖擊很大，研究表明細(xì)菌是引起畜禽動(dòng)物常見(jiàn)病和多發(fā)病的根源之一［1.2］，如大腸桿菌、豬鏈球菌、巴氏桿菌和金黃色葡萄球菌等。目前，養(yǎng)殖行業(yè)對(duì)細(xì)菌性疾病的防治普遍使用抗生素及化學(xué)合成藥物，導(dǎo)致了致病性細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性，細(xì)菌耐藥性又加重了抗生素及化學(xué)合成藥物的濫用，從而造成肉類食品藥物殘留加大，威脅著人們的健康。

在我國(guó)，中草藥用于治療動(dòng)物疾病有著悠久的歷史，與抗生素及化學(xué)合成藥物相比，中草藥具有不易使細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性，藥物殘留低，增強(qiáng)動(dòng)物免疫力等優(yōu)點(diǎn)［3.4］。隨著人們對(duì)抗生素認(rèn)識(shí)加深，越來(lái)越多的研究者把注意力轉(zhuǎn)向了中草藥。本試驗(yàn)旨在考察20種中草藥提取物對(duì)大腸桿菌、豬鏈球菌、巴氏桿菌和金黃色葡萄球菌的體外抑菌效果，為中草藥及其復(fù)方制劑治療細(xì)菌性疾病方面的研究提供基礎(chǔ)。

1　材料

1.1中草藥板藍(lán)根、柴胡、金銀花、黃芩、黃連、黃柏、石榴皮、穿心蓮、菊花、防風(fēng)、地錦草、馬齒筧、仙鶴草、白頭翁、吳茱萸、龍膽草、大黃、魚(yú)腥草、獨(dú)活、香薷等，均購(gòu)自河南省禹州市中藥材批發(fā)行，所有藥物經(jīng)檢定均符合生藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

1.2菌種豬鏈球菌、金黃色葡萄球菌和巴氏桿菌均購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)檢查所；大腸桿菌由河南科技學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)提供。

1.3培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基∶蛋白胨10g，酵母浸粉5g，NaCl10g，葡萄糖2g，加純水1000ml，pH7.3±0.1。其中培養(yǎng)豬鏈球菌時(shí)，需添加5%胎牛血清。

瓊脂培養(yǎng)基∶在液體培養(yǎng)基中加入1.5%瓊脂。

1.4試劑和儀器酵母浸粉、蛋白胨和瓊脂粉，葡萄糖和氯化鈉。

蒸汽滅菌鍋、酸度計(jì)、磁力加熱攪拌器、電熱恒溫培養(yǎng)箱和超凈工作臺(tái)。

2　方法

2.1藥液的制備精密稱取每味中藥各60g，加8倍量蒸餾水煎煮沸騰后改用文火煎1h，期間始終保持8倍量水，用4層紗布過(guò)濾∶殘?jiān)?倍量水同法煎煮1h后過(guò)濾，合并兩次濾液，減壓濃縮至60ml，使其濃度為1g/ml。

2.2菌液的制備挑取一環(huán)斜面菌種，接種至普通肉湯培養(yǎng)基，37℃靜置培養(yǎng)24h。用滅菌空白培養(yǎng)基校正菌液濃度，使活菌數(shù)為1～2×106 CFU/ml，備用。

2.3最小抑菌濃度（MIC）的測(cè)定采用試管二倍稀釋法［5］測(cè)定藥液對(duì)各供試菌的MIC。具體操作∶（1）取滅菌有棉塞試管11支，進(jìn)行編號(hào)，編號(hào)后每管先加入與試驗(yàn)菌種對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)基2.0ml，然后于第一管中加入滅菌的受試藥液2.0ml，混勻后取出2.0ml放入第2管中，依次作2-1～2-9的梯度稀釋，直到第9管取出2.0ml棄去；第10管不加藥液，作為陽(yáng)性對(duì)照；第11管加受試藥液2.0ml，混勻后取出2.0ml棄去，不加細(xì)菌，作為陰性對(duì)照，各管平行3份。（2）取細(xì)菌稀釋液0.1ml分別加入上述1～10管中混勻，11號(hào)管加0.1ml滅菌生理鹽水，注意每次移液要更換新的移液管，然后置各管于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24 h，觀察結(jié)果。

2.4最小殺菌濃度（MBC）的測(cè)定挑取一環(huán)MIC終點(diǎn)濃度以上未生長(zhǎng)細(xì)菌的各稀釋管內(nèi)培養(yǎng)物，劃線于與菌種對(duì)應(yīng)的瓊脂培養(yǎng)基上，于37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)18～24h，觀察有無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)，培養(yǎng)基中無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)的最低濃度即為受試藥液的最低殺菌濃度。

表1　20種中草藥對(duì)大腸桿菌的體外抑菌試驗(yàn)結(jié)果（最小抑菌濃度和最小殺菌濃度）（mg/ml）

表2　20種中草藥對(duì)巴氏桿菌的體外抑菌試驗(yàn)結(jié)果（最小抑菌濃度和最小殺菌濃度）（mg/ml）

3　結(jié)果與分析

3.120種中草藥對(duì)大腸桿菌的MIC和MBC

表1顯示了20種中草藥對(duì)大腸桿菌的最小抑菌濃度和最小殺菌濃度，結(jié)合最小抑菌濃度和最小殺菌濃度，結(jié)果表明大黃、黃連、黃芩、地錦草、石榴皮和白頭翁等對(duì)大腸桿菌的抑菌效果較好，但也有差異。其中大黃和黃連對(duì)大腸桿菌的抑菌效果最好，MIC分別為15.63和31.25mg/ml，MBC分別為125和62.5mg/ml；黃芩、地錦草、石榴皮和白頭翁次之。其它中草藥對(duì)大腸桿菌的抑菌效果較差，其MIC和MBC均≥250mg/ml。

3.220種中草藥對(duì)巴氏桿菌的MIC和MBC

表2顯示了20種中草藥對(duì)巴氏桿菌的最小抑菌濃度和最小殺菌濃度，結(jié)果表明大黃對(duì)巴氏桿菌的抑菌效果最好，MIC和MBC分別為62.5 和500mg/ml。黃連次之，MIC和MBC分別125和500mg/ml。其它中草藥對(duì)巴氏桿菌的抑菌效果較差，MIC和MBC均≥250mg/ml，其中石榴皮、魚(yú)腥草、穿心蓮和吳茱萸對(duì)巴氏桿菌沒(méi)有抑菌效果。

3.320種中草藥對(duì)豬鏈球菌的MIC和MBC

表3顯示了20種中草藥對(duì)豬鏈球菌的最小抑菌濃度和最小殺菌濃度，結(jié)果表明黃連對(duì)豬鏈球菌的抑菌效果較好，MIC＜1.95mg/ml，MBC為31.25mg/ml；黃柏和白頭翁次之，MIC均為62.5 mg/ml，MBC均為500mg/ml；其它中草藥對(duì)豬鏈球菌的抑菌效果較差，其中防風(fēng)、柴胡、吳茱萸、黃芩、龍膽草、穿心蓮、魚(yú)腥草、金銀花和大黃對(duì)豬鏈球菌沒(méi)有抑菌效果。

3.420種中草藥對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC和MBC

表4顯示了20種中草藥對(duì)金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度和最小殺菌濃度，結(jié)果表明黃連和黃柏對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌效果最好，MIC分別為3.91和15.6mg/ml，MBC分別為125和500 mg/ml；大黃和柴胡次之，MIC均為62.5mg/ml，MBC分別為250和500mg/ml；其它中草藥的抑菌效果較差，其中板藍(lán)根、吳茱萸、黃芩和防風(fēng)對(duì)金黃色葡萄球菌沒(méi)有抑菌效果。

表3　20種中草藥對(duì)豬鏈球菌的體外抑菌試驗(yàn)結(jié)果（最小抑菌濃度和最小殺菌濃度）（mg/ml）

表4　20種中草藥對(duì)金黃色葡萄球菌的體外抑菌試驗(yàn)結(jié)果（最小抑菌濃度和最小殺菌濃度）（mg/ml）

4　結(jié)論與討論

4.1本試驗(yàn)結(jié)果∶大黃、黃連、黃芩、地錦草、石榴皮和白頭翁等對(duì)大腸桿菌的體外抑菌效果較好，其中大黃和黃連的效果最好；大黃對(duì)巴氏桿菌的體外抑菌效果較好，MIC為62.5mg/ml；黃連、黃柏和白頭翁對(duì)豬鏈球菌的體外抑菌效果較好，其中黃連的MIC＜1.95mg/ml，MBC為31.25mg/ml；黃連、黃柏、大黃和柴胡對(duì)金黃色葡萄球菌的體外抑菌效果較好，其中黃連和黃柏的MIC分別為3.91和15.6mg/ml。

4.2以上試驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明很多中草藥具有抑菌效果，但不同中草藥對(duì)同一種菌的抑制效果不同，且同種中草藥對(duì)不同菌也有不同的抑制效果。中草藥的成分復(fù)雜，抑菌作用的機(jī)理和功能不同，其抑菌機(jī)制主要有［6］∶中草藥有效成分直接破壞病原菌細(xì)胞膜和細(xì)胞壁，干擾細(xì)菌的代謝作用；中草藥有效成分給機(jī)體提供營(yíng)養(yǎng)，促進(jìn)免疫器官的發(fā)育；中藥可以減輕5-羥色胺、組胺的血管通透性作用，抑制細(xì)胞的溢出，同時(shí)能增強(qiáng)組織和器官的機(jī)能，從側(cè)面達(dá)到抑菌的作用。

4.3本試驗(yàn)為體外抑菌，體外抑菌效果可能跟體內(nèi)抑菌效果不同，需要進(jìn)一步的驗(yàn)證，但有研究表明∶中草藥可通過(guò)消除R質(zhì)粒［7］，抑制β-內(nèi)酰胺［8］，抑制病原菌的耐藥性［9］等方式，避免病原菌產(chǎn)生耐藥性，或?qū)δ退幘心孓D(zhuǎn)作用。在我國(guó)，中草藥用于養(yǎng)殖行業(yè)有著悠久的歷史，利用中草藥防治細(xì)菌性疾病，減少抗生素及化學(xué)合成藥物的使用，將會(huì)降低藥物殘留對(duì)人們的危害，同時(shí)也能促進(jìn)中醫(yī)藥現(xiàn)代化的發(fā)展。

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S853.74

B

1003-8655（2016）04-0004-03

∶2016-03-18

∶新鄭市技術(shù)研究與開(kāi)發(fā)經(jīng)費(fèi)支持項(xiàng)目，項(xiàng)目編號(hào)2014PTG14。

∶呂彪，（1979-），獸醫(yī)師，碩士，E-mail∶lvbiao1979@126.com。

簡(jiǎn)介∶張要齊，研究方向?yàn)檗r(nóng)業(yè)推廣，碩士，E-mail∶httx0371@126.com，