彭　兵，?！∥?，李忠奎，張寶年，程　偉，陳興杰，謝國(guó)排，楊牢記，黃訓(xùn)端，張部昌*

（安徽大學(xué)金種子酒業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院，安徽合肥230601）

窖泥高產(chǎn)己酸菌分離鑒定及培養(yǎng)條件優(yōu)化的研究

彭兵，祝熙，李忠奎，張寶年，程偉，陳興杰，謝國(guó)排，楊牢記，黃訓(xùn)端，張部昌*

（安徽大學(xué)金種子酒業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院，安徽合肥230601）

濃香型白酒的主體香味物質(zhì)是己酸乙酯，己酸菌是重要的功能菌種。該研究從優(yōu)質(zhì)窖泥中分離獲得了高產(chǎn)己酸菌株，命名為JZZ，該菌是革蘭氏陽(yáng)性桿菌，經(jīng)形態(tài)學(xué)和16S rDNA序列鑒定，屬于克氏梭菌（Clostridium kluyveri）。通過(guò)培養(yǎng)條件考察，該己酸菌最適培養(yǎng)條件為接種量5%，裝樣量90%，培養(yǎng)溫度37℃，pH值為6.5。在最適培養(yǎng)條件下，菌株JZZ的己酸產(chǎn)量均可達(dá)到4.36 mg/m L。

窖泥；己酸菌；分離；鑒定；培養(yǎng)條件

白酒釀造在我國(guó)有著悠久的歷史，因原料、酒曲和生產(chǎn)工藝以及自然環(huán)境等因素的差別，形成了各具特色、風(fēng)格迥異的多種香型的白酒，其中濃香型白酒具有芳香濃郁、綿柔甘洌、香味協(xié)調(diào)、入口甜、落口綿、尾凈余長(zhǎng)等特點(diǎn)，成為白酒行業(yè)的主流產(chǎn)品［1］。構(gòu)成濃香型酒典型風(fēng)格的主體成分是己酸乙酯，這種成分含香量較高且香氣突出。在傳統(tǒng)固態(tài)濃香型白酒釀造過(guò)程中，窖泥的作用是至關(guān)重要的，窖泥微生物的種類、數(shù)量、種群間的相互作用以及代謝的多樣性直接影響著白酒的質(zhì)量，其中就包含大量的己酸菌。己酸菌含量的多少以及產(chǎn)己酸能力的高低都直接影響著濃香型大曲酒酒體風(fēng)格的形成［2-3］。己酸菌代謝所產(chǎn)生的己酸在白酒中不僅起到呈香、助香、減少酒體刺激的作用，而且可以與酒曲發(fā)酵產(chǎn)生的酒精發(fā)生酯化反應(yīng)，生成濃香型白酒的所特有的主體香成分己酸乙酯，從而改善濃香型白酒的風(fēng)味及口感，影響濃香型白酒的風(fēng)格和質(zhì)量［4-5］。因此濃香型白酒窖泥微生物群落研究一直是業(yè)界研究熱點(diǎn)，特別是一些主要功能菌的分離純化及窖池微生物的群落特征進(jìn)展迅速［6-8］。趙輝等［9］從濃香型白酒窖泥中分離出3株高產(chǎn)己酸的兼性厭氧細(xì)菌，并用氣相色譜法檢測(cè)其己酸產(chǎn)量分別為2.13 m g/m L、1.70 mg/m L和1.03 mg/m L。熊俐等［10］分離出一株高產(chǎn)己酸菌，通過(guò)誘變，用醋酸銅比色法測(cè)得其己酸產(chǎn)量達(dá)到9.02 mg/m L。

本實(shí)驗(yàn)從曲酒發(fā)酵池的優(yōu)質(zhì)窖泥中分離、純化、篩選出高產(chǎn)己酸的己酸菌，并進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定，考察其高產(chǎn)己酸培養(yǎng)條件，為窖池養(yǎng)護(hù)及人工窖泥培養(yǎng)提供優(yōu)質(zhì)的功能菌株。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1材料

窖泥：取自某酒廠13個(gè)優(yōu)質(zhì)濃香型大曲酒發(fā)酵池，分別命名為JKY1-JKY13。

1.1.2試劑

硫酸銨、磷酸氫二鉀、醋酸鈉、碳酸鈣、Fe2（SO4）3、乙醇、牛肉膏、NaCl、細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒：生工生物工程（上海）股份有限公司；酵母粉、蛋白胨：英國(guó)OXOID公司；厭氧袋、耗氧劑：日本MGC公司；己酸（色譜純）、內(nèi)標(biāo)物2-乙基丁酸（色譜純）：成都西亞試劑公司；乙醇、乙醚：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。所有試劑均為分析純。

1.1.3培養(yǎng)基

乙醇醋酸鈉培養(yǎng)基（ethanol acetic acid-Na medium，EAM）：NaAc 5 g、酵母膏1 g、MgSO4·7H2O 0.2 g、K2HPO40.4 g、（NH4）2SO40.5 g、CaCO310 g，蒸餾水1 L，自然pH；121℃滅菌20 m in，乙醇2.0%（滅菌后使用前加入）。

LB培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，酵母粉5 g，NaCl 10 g，蒸餾水1 L，pH 7.4，121℃滅菌20 m in。

1.2儀器與設(shè)備

LRH-250F生化培養(yǎng)箱、DHG-9145A電熱鼓風(fēng)干燥箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；Velocity 18R臺(tái)式冷凍離心機(jī)：澳大利亞Dynamica公司；Spectramax 384plus分光光度計(jì)：美國(guó)MD公司；2010型氣相色譜儀（配氫火焰離子化檢測(cè)器、全自動(dòng)進(jìn)樣器、自動(dòng)進(jìn)樣針）：日本島津公司；DB-FFAP色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）：美國(guó)安捷倫公司。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1高產(chǎn)己酸菌的分離純化

EAM培養(yǎng)基第一次富集：培養(yǎng)基試管裝液量90%，加入1 g窖泥，80℃水浴熱處理10 m in，封口膜封口，37℃培養(yǎng)7 d。分別取第一次富集菌液2 m L，加2 m L 2%CuSO4，1 m L乙醚，搖勻，靜置封層，觀察乙醚層顯色反應(yīng)（硫酸銅顯色法）［9］，將OD值較高的組別進(jìn)行氣相色譜法復(fù)測(cè)，然后將氣相色譜法復(fù)測(cè)己酸產(chǎn)量較高的組別進(jìn)行第二次富集。第二次富集的培養(yǎng)液，吸取1～9 m L的無(wú)菌水中，依次稀釋到10-4稀釋度，選取10-3和10-4的菌液，吸取0.2 m L到已倒好的分離用平板培養(yǎng)基上，每個(gè)梯度重復(fù)3次，涂勻后放置于真空干燥箱中，37℃培養(yǎng)7 d。然后在稀釋涂平板的平皿上挑取單菌落挑至裝有EAM液體培養(yǎng)基的15 m L試管中（裝樣量90%）中37℃厭氧培養(yǎng)7 d。用硫酸銅顯色法測(cè)定波長(zhǎng)680 nm條件下的吸光度值，對(duì)發(fā)酵液初篩后，氣相色譜法進(jìn)行己酸菌己酸產(chǎn)量的測(cè)定。

1.3.2菌株鑒定

單菌落形態(tài)觀察，經(jīng)革蘭氏染色后鏡檢。

提取菌株基因組，PCR擴(kuò)增16S rDNA片段，聚合酶鏈反應(yīng)（polymerasechain reaction，PCR）擴(kuò)增程序：95℃、5min，95℃、30 s，55℃、30 s，72℃、90 s，24個(gè)循環(huán)，72℃、10 min。由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行測(cè)序，提交美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI），通過(guò)基本本地隊(duì)列搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）進(jìn)行同源性比較，用MEGA6軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹［11］。

1.3.3高產(chǎn)己酸菌培養(yǎng)條件的研究

將研究中挑選到的高產(chǎn)己酸菌分別按照2%、5%、10%、15%的種子液接種量接種到pH值分別為6.0、6.5、7.0、7.5、8.0 EAM液體培養(yǎng)基的15 m L試管，裝樣量分別為60%、70%、80%、90%、100%，分別在36℃、37℃、38℃、39℃、40℃厭氧培養(yǎng)7 d后，考察接種量、pH值、裝液量及培養(yǎng)溫度對(duì)己酸產(chǎn)量的影響，每個(gè)樣品3個(gè)重復(fù)。

1.3.4己酸產(chǎn)量的測(cè)定

采用氣相色譜法檢測(cè)己酸產(chǎn)量，氣相色譜條件為進(jìn)樣口溫度240℃；柱箱起始溫度：100℃（1 min）；升溫速率：10℃/min；柱溫終溫度：220℃（2 min）；檢測(cè)器溫度250℃；氣體流量：氫氣40 m L/m in，空氣400 m L/min，尾吹氣30 m L/min；進(jìn)樣方式：分流進(jìn)樣，分流比20∶1；進(jìn)樣體積：1 μL。

內(nèi)標(biāo)液的配制：準(zhǔn)確稱取內(nèi)標(biāo)物2-乙基丁酸原液0.185 g于100 m L容量瓶中，用體積分?jǐn)?shù)為60%乙醇水溶液定容至100m L，配制成1.85mg/m L 2-乙基丁酸內(nèi)標(biāo)液待用。

2　結(jié)果與分析

2.1高產(chǎn)己酸菌分離

本研究利用硫酸銅比色法檢測(cè)己酸菌的己酸產(chǎn)量，對(duì)菌株進(jìn)行初篩，篩選到一株穩(wěn)定高產(chǎn)的己酸菌，命名為JZZ，然后對(duì)菌株JZZ的己酸產(chǎn)量用氣相色譜法進(jìn)行復(fù)測(cè)，結(jié)果見表1。由表1可知，菌株JZZ的己酸產(chǎn)量的6次檢測(cè)結(jié)果分別為4.33 mg/m L、4.25 mg/m L、4.28 mg/m L、4.55 mg/m L、4.34 mg/m L、4.42 mg/m L，平均值為4.36 mg/m L，菌株JZZ是一株高產(chǎn)己酸菌。

表1　菌株JZZ己酸產(chǎn)量的復(fù)測(cè)Table 1 Retest of caproic acid yield for strain JZZ

2.2菌株JZZ的菌落形態(tài)觀察

經(jīng)過(guò)菌落形態(tài)及革蘭氏染色觀察，結(jié)果見圖1。由圖1可知，菌株JZZ為革蘭氏陽(yáng)性桿菌，頂端有芽孢，菌落呈白色圓形，扁平，表面光滑且周圍有較為明顯的透明圈。

圖1　菌株JZZ的菌落形態(tài)（A）及細(xì)胞形態(tài)（B）Fig．1 Colonial morphology（A）and cell morphology（B）of strain JZZ

2.3篩選菌株JZZ的16S rDNA鑒定結(jié)果

經(jīng)上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司測(cè)序分析，得到菌株JZZ的16S rDNA序列信息如下：

GTGGGTAACCTGGCTCAAAGAGGGGGATAGCC TCCCGAAAGGGAGATTAATACCGCATAAAAGGTAAATATCGCATGGTAAATACCTTAAAGGAGAAATCCG CTTTGAGATGGGCCCGCGTCGCATTAGCTAGTTGGA GGGATAAAAGCCCCCCAAGGCGACGATGCGTAGCC GACCTGAGAGGGTGAACGGCCACATTGGAACTGAG ATACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGG GAATATTGCACAATGGGGGAAACCCTGATGCAGCA ACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGTTTTCGGATCGTAA AGCTCTGTCATCCGGGACGATAATGACGGTACCGG AAGAGGAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCC GCGGTAATACGTAGGTGGCGAGCGTTGTCCGGAAT TACTGGGCGTAAAGGGTGTGCAGGCGGATATTTAA GTGAGATGTGAAAGACCCGGGCTTAACCCGGGCAG TGCATTTCAAACTGGATATCTAGAGTGCAGGAGAGG AGAACGGAATTCCTAGTGTAGCGGTGAAATGCGTA GAGATTAGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGATTC TCTGGACTGTAACTGACGCTGAGGCACGAAAGCGTG GGTAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACG CCGTAAACGATGAGTACTAGGTGTAGGGGGTATCG ACCCCCCCTGTGCCGCAGTAAACACAATAAGTACTC CGCCTGGGAAGTACGATCGCAAGATTAAAACTCAA AGGAATTGACGGGGACCCGCACAAGCAGCGGAGCA TGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACC TGGACTTGACATCCCCTGAATAACTCGTAATGGAGG AAGCCCTTCGGGGCAGGGAGACAGGTGGTGCATGG TTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTAGGTTAAG TCCTGCAACGAGCGCAACCCCTGTCGTTAGTTGCCA TCACGTAAAGGTGGGCACCCTAACGAGACTGCCGC GGTTAACGTGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAAT CATCATGCCCCTTATGTCCAGGGCAACACACGTGCT ACAATGGGCAGAACAGAGAGAAGCAATACCGCGAG GAGGAGCAAATCTCAAAAACTGCCCCCAGTTCGGA TTGCAGGCTGAAACCCGCCTGCATGAAGTTGGAGTT GCTAGTAATCGCGAATCAGCATGTCGCGGTGAATA CGTTCCCGGGTCTTGTACACACCGCC。

將菌株JZZ的16S rDNA序列在NCBI中進(jìn)行同源性比較，同源性較高的為克氏梭狀桿菌（Clostridium kluyveri），同源性＞99%。采用軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果見圖2。

圖2　菌株JZZ的16S rDNA的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig．2 Phylogenetic tree of 16S rDNA of strain JZZ

一般認(rèn)為，在細(xì)菌分類學(xué)上16S rDNA的同源性＞97%的為屬內(nèi)同種。由圖2結(jié)果綜合菌株JZZ的形態(tài)與分子生物學(xué)特征可知，菌株JZZ鑒定為克氏梭狀桿菌（Clostridium kluyveri）［12-13］。

2.4高產(chǎn)己酸菌培養(yǎng)條件的研究

通過(guò)對(duì)接種量、裝樣量、培養(yǎng)溫度及pH分別設(shè)置變量，對(duì)菌株JZZ的培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，經(jīng)氣相色譜法測(cè)定己酸產(chǎn)量的變化，結(jié)果見圖3。

圖3　不同接種量（A）、裝樣量（B）、培養(yǎng)溫度（C）及pH（D）對(duì)菌株JZZ己酸產(chǎn)量的影響Fig．3 Effect of different inoculum（A），volume of liquid（B），culture tem perature（C）and pH（D）on caproic acid yield of strain JZZ

由圖3A可知，培養(yǎng)7 d后，接種量為5%比2%的己酸產(chǎn)量高，雖然更高的接種濃度己酸產(chǎn)量還在增長(zhǎng)，但增長(zhǎng)幅度較小，所以5%是合適的接種量。由圖3B可知，培養(yǎng)7 d后，乙酸產(chǎn)量裝樣量從60%到100%呈遞增趨勢(shì)，在裝樣量＜90%時(shí)增幅較大，而90%～100%時(shí)增幅較小，綜合考慮實(shí)驗(yàn)的操作方便性等原因認(rèn)為90%是合理的裝樣量。由圖3C可知，培養(yǎng)7 d后，培養(yǎng)溫度為37℃時(shí)己酸產(chǎn)量最高，所以37℃是最合適的培養(yǎng)溫度。由圖3D可知，pH 6.5條件下培養(yǎng)7 d后，產(chǎn)己酸量最高，所以pH 6.5是最佳pH。

3　結(jié)論

本研究通過(guò)對(duì)某濃香型窖池窖泥分別進(jìn)行富集、篩選、梯度稀釋等工作得到一株高產(chǎn)己酸菌，并命名為JZZ。通過(guò)菌落形態(tài)、革蘭氏染色及16S rDNA分子測(cè)序?qū)闖ZZ進(jìn)行鑒定，得到的結(jié)果為該菌為革蘭氏陽(yáng)性桿菌，屬于克氏梭狀桿菌（Clostridium kluyveri）。通過(guò)對(duì)其產(chǎn)己酸條件的優(yōu)化，得到該菌的最適培養(yǎng)條件為pH值為6.5，接種量為5%，裝樣量為90%，培養(yǎng)溫度為37℃。通過(guò)氣相色譜法對(duì)其己酸產(chǎn)量進(jìn)行檢測(cè)，在最適培養(yǎng)條件下，菌株JZZ的己酸產(chǎn)量均可達(dá)到4.36 mg/m L。

在傳統(tǒng)的濃香型白酒生產(chǎn)過(guò)程中，窖泥經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間的使用會(huì)出現(xiàn)不同程度的板結(jié)和老化，窖泥中的己酸菌等功能菌會(huì)出現(xiàn)產(chǎn)己酸功能的衰退及數(shù)量的減少，需要定期通過(guò)加入含有高產(chǎn)己酸菌養(yǎng)護(hù)液對(duì)老化的窖泥進(jìn)行養(yǎng)護(hù)，在人工窖泥快速培養(yǎng)中高產(chǎn)己酸菌將起到關(guān)鍵作用［14-16］。本實(shí)驗(yàn)篩選得到的高產(chǎn)己酸菌JZZ用于窖泥的日常養(yǎng)護(hù)和人工窖泥的快速培養(yǎng)，可改善窖泥的養(yǎng)護(hù)效果，縮短人工窖泥老熟的周期，降低生產(chǎn)成本。由于己酸菌的主要產(chǎn)物己酸，是濃香型白酒中關(guān)鍵的風(fēng)味產(chǎn)物己酸乙酯的前體，所以本研究對(duì)于提高和改善濃香型白酒的質(zhì)量有重要應(yīng)用價(jià)值。

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Isolation and identification of the strains with high caproic acid yield from pit mud and optim ization of cultural conditions

PENG Bing，ZHU Xi，LI Zhongkui，ZHANG Baonian，CHENG Wei，CHEN Xingjie，XIE Guopai，YANG Laoji，HUANG Xunduan，ZHANG Buchang*
（Institute of Industry and Techno logy of Anhui University-Golden Seed W inery，Hefei 230601，China）

Ethyl caproate is primary flavor component of Luzhou-flavor liquor（China Baijiu），and caproic acid bacteria are the important functional strains.The strains w ith high caproic acid yield were isolated from the fine pit mud and named JZZ.The strains were gram-positive bacilli and were identified as Clostridium kluyveri by identification of morphology and 16S rDNA sequence.By researching culture conditions，the optimum culture conditions of caproic acid bacteria were inoculum 5%，liquid volume 90%，culture temperature 37℃and pH 6.5.Under the optimum conditions，the caproic acid yield of strain JZZ could be up to 4.36 mg/m l.

pit mud；caproic acid bacteria；isolation；identification；culture conditions

TS261

0254-5071（2016）05-0043-04

10．11882/j．issn．0254-5071．2016．05．009

2016-02-04

金種子人工窖泥快速培養(yǎng)技術(shù)研究（Y 06099204）；安徽大學(xué)2015年百門精品素質(zhì)課程建設(shè)項(xiàng)目（ZLTS2015233）

彭兵（1970-），男，高級(jí)工程師，本科，主要從事釀造技術(shù)研究工作。

張部昌（1965-），男，教授，博士，主要從事生物工程研究工作。