梁寶東，魏海香，邊清鵬，姜淑喆

青霉菌對(duì)剛毛藻纖維素降解的研究

梁寶東1，魏海香1，邊清鵬1，姜淑喆2

（1.濟(jì)寧學(xué)院 生命科學(xué)與工程系，山東 曲阜 273155；2.山東大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山東 濟(jì)南 250013）

研究了青霉菌對(duì)剛毛藻中纖維素的降解條件。首先通過(guò)單因素試驗(yàn)，研究了氮源種類、硫酸銨含量、料液比、pH、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間對(duì)纖維素降解的影響。選擇了pH值、料液比、硫酸銨含量進(jìn)行L9（33）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，考察各因素對(duì)蛋白、總糖含量、纖維素酶活的影響，得出最佳降解條件：藻粉3 g/L，料液比1∶15（g∶mL），硫酸銨20 g/L，磷酸二氫鉀1 g/L，硫酸鎂0.5 g/L，緩沖液pH 6.0，發(fā)酵溫度為30℃，發(fā)酵時(shí)間為7 d，在此條件下，蛋白含量為12.44 g/100 g，總糖含量0.58 mg/g，纖維素酶酶活4.84 U/g。

剛毛藻；青霉菌；降解；纖維素

海藻作為可再生資源數(shù)量巨大，而且是可開發(fā)利用的重要資源［1］。在地球上通過(guò)藻類的光合作用每年產(chǎn)生的物質(zhì)有40%。大部分海藻的主要成分是多糖等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，約有50%～60%，纖維素、半纖維和少量的木質(zhì)素占40%～50%，還有少量灰分。以藻類作為原料開發(fā)生物活性物質(zhì)，其資源豐富，且具有藻體比較柔軟、本身機(jī)械強(qiáng)度較低，容易破碎和降解，對(duì)設(shè)備要求低等優(yōu)點(diǎn)［2］。提高海藻資源的利用率，以充分實(shí)現(xiàn)海藻的價(jià)值，是海藻資源開發(fā)利用的重要內(nèi)容［3-4］。我國(guó)的海藻養(yǎng)殖技術(shù)居于世界領(lǐng)先地位。據(jù)聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織（food and agriculture organization of the united nations，F(xiàn)AO）的統(tǒng)計(jì)，中國(guó)海帶養(yǎng)殖產(chǎn)量占到世界的70%以上［5］。海洋被認(rèn)為是21世紀(jì)支撐未來(lái)社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展的重要物質(zhì)基礎(chǔ)，海洋資源的開發(fā)利用已成為各國(guó)可持續(xù)發(fā)展的重要戰(zhàn)略［6］。

剛毛藻屬于綠藻門，剛毛藻科，不僅種類繁多，而且分布廣泛，在海水、淡水中都存在。剛毛藻中纖維素含量較高，其纖維素、半纖維素、木質(zhì)素、水分和灰分含量分別為31.2%、17.1%、13.6%、5.83%和26.5%。楊楠楠等［7］研究了剛毛藻纖維素的酶解工藝。剛毛藻生長(zhǎng)控制條件的報(bào)道較多［8］，利用霉菌產(chǎn)生纖維素酶直接降解剛毛藻中纖維素少見報(bào)道，更多的研究集中在里氏木霉、綠色木霉等菌種產(chǎn)纖維素酶能力和酶學(xué)分析上［9-10］。本試驗(yàn)研究青霉菌降解剛毛藻中纖維素，以期為剛毛藻中糖類及蛋白質(zhì)等生物活性物質(zhì)的提取分離提供方法和理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

剛毛藻：采集于濱海海洋刺參養(yǎng)殖池塘，晾干后機(jī)械粉碎，過(guò)40目篩，備用。

青霉菌：自行從雞糞中篩選得到的青霉菌，濟(jì)寧學(xué)院生命科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心保藏。

酵母膏、瓊脂、蛋白胨（生化試劑）：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；葡萄糖、硫酸銨、硫酸鎂、磷酸二氫鉀、硝酸鈉、苯酚、硫酸銅、硫酸鉀、氫氧化鈉（分析純）：天津市大茂化學(xué)試劑廠。

斜面培養(yǎng)基采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（potato dextrose agar，PDA）：馬鈴薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，瓊脂20g/L，pH自然；種子培養(yǎng)基（PDA培養(yǎng)基）：馬鈴薯200 g/L，葡萄糖20L，pH自然；發(fā)酵培養(yǎng)基：藻粉3g/L，硫酸銨10 g/L，酵母膏1 g/L，磷酸二氫鉀1 g/L，硫酸鎂0.5 g/L，料液比1∶15（g∶mL），pH 5.0。

1.2儀器與設(shè)備

DELTA320pH計(jì)：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；PL203電子精密天平：鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；THZ-100恒溫培養(yǎng)搖床：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；ST16高速離心機(jī)：北京聯(lián)合科力科技有限公司；HYP-1004消化爐、102C定氮儀：上海纖檢儀器有限公司；722可見分光光度計(jì)：上海菁華科學(xué)儀器有限公司。

1.3方法

1.3.1培養(yǎng)方法

將4℃冰箱保存的青霉菌接種于試管斜面培養(yǎng)基30℃培養(yǎng)3 d，每支斜面菌種加無(wú)菌水5 mL，取1 mL轉(zhuǎn)接入100 mL/250 mL三角瓶種子培養(yǎng)基中，180 r/min、30℃搖床培養(yǎng)1 d作為種子，按10%的接種量轉(zhuǎn)接入100 mL/250 mL三角瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中，30℃、150 r/min培養(yǎng)7 d，4 000 r/min離心5 min，離心結(jié)束后取上清液測(cè)定總糖含量和酶活，余下的固體用烘箱干燥，干燥完成后用研缽研粹固體并取一定量測(cè)定蛋白質(zhì)含量。

1.3.2單因素試驗(yàn)

氮源種類：在發(fā)酵培養(yǎng)基中，分別以酵母膏、蛋白胨、硝酸鈉代替培養(yǎng)基中的硫酸銨為氮源，含量為10 g/L，其他成分不變，考察氮源種類對(duì)發(fā)酵的影響。

硫酸銨質(zhì)量濃度：在發(fā)酵培養(yǎng)基中，分別按照5 g/L、10 g/L、15 g/L、20 g/L、25 g/L添加硫酸銨，其他成分不變，考察硫酸銨質(zhì)量濃度對(duì)發(fā)酵的影響。

pH值：將發(fā)酵培養(yǎng)基的pH分別調(diào)整為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0，考察pH值對(duì)發(fā)酵的影響，其他成分不變，考察pH對(duì)發(fā)酵的影響。

料液比：將發(fā)酵培養(yǎng)基的料液比分別調(diào)整為1∶6、1∶9、1∶12、1∶15、1∶18（g∶mL），其他成分不變，考察料液比對(duì)發(fā)酵的影響。

發(fā)酵時(shí)間：將發(fā)酵時(shí)間分別設(shè)定為4 d、5 d、6 d、7 d、8 d，考察發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵的影響。

發(fā)酵溫度：將發(fā)酵溫度分別設(shè)定為15℃、25℃、30℃、35℃、40℃，考察發(fā)酵溫度對(duì)發(fā)酵的影響。

1.3.3正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以發(fā)酵液中的蛋白含量、總糖含量、酶活為評(píng)價(jià)指標(biāo)，以pH值、料液比和硫酸氨質(zhì)量濃度為評(píng)價(jià)因素進(jìn)行3因素3水平L9（33）正交試驗(yàn)，各因素與水平見表1。

表1　霉菌發(fā)酵工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for Penicilliumfermentation technology optimization

1.3.4測(cè)定方法

總糖的測(cè)定：按照參考文獻(xiàn)［11］的方法進(jìn)行；羧甲基纖維素鈉（carboxyl methyl cellulose-Na，CMC-Na）酶活性的測(cè)定：按照參考文獻(xiàn)［12-14］的方法進(jìn)行；酶活定義：在酶催化的最適溫度和最適pH條件下，每分鐘催化纖維素水解生成1 μmol葡萄糖的酶量為1個(gè)酶活單位（U/g）；蛋白質(zhì)的測(cè)定：按照參考文獻(xiàn)［15］的方法進(jìn)行。

2　結(jié)果與分析

2.1氮源種類對(duì)發(fā)酵的影響

圖1　氮源種類對(duì)發(fā)酵的影響Fig.1 Effect of nitrogen sources on fermentation

由圖1可知，以酵母膏作為氮源時(shí)，發(fā)酵結(jié)束時(shí)總糖含量最高，為0.28 mg/g，其次是硫酸銨，但總糖含量差距不大，而硫酸銨比酵母膏價(jià)格便宜，經(jīng)濟(jì)實(shí)惠，使用方便，酵母膏是粘稠狀半固體不容易??；發(fā)酵液中以硫酸銨作為氮源時(shí)蛋白質(zhì)含量最高，為13.89 g/100 g，其次是硝酸鈉，彼此蛋白質(zhì)含量差距較大，影響顯著；發(fā)酵液中以蛋白胨為氮源時(shí)，纖維素酶酶活最高，為10.90 U/g，其次是硝酸鈉，可能是由于蛋白胨和硝酸鈉為氮源時(shí)產(chǎn)酶高峰期較晚，因此酶活高、總糖低；而硫酸銨和酵母膏產(chǎn)酶較早，因此酶活低、總糖高。綜合各方面考慮，選擇硫酸銨為最適氮源。

2.2硫酸銨質(zhì)量濃度對(duì)發(fā)酵的影響

由圖2可知，隨著硫酸銨質(zhì)量濃度的增加，發(fā)酵液中粗蛋白含量也增加，在硫酸銨質(zhì)量濃度＞15 g/L后，粗蛋白含量增加不明顯；這是因?yàn)榫谏L(zhǎng)過(guò)程中要利用氮源生長(zhǎng)。由于在霉菌生長(zhǎng)過(guò)程中糖既可被利用，又可生成，因此變化趨勢(shì)不明顯，集中在0.35～0.45 mg/g；纖維素酶酶活在硫酸銨質(zhì)量濃度為15 g/L時(shí)最高，為11.25 U/g，原因可能是菌體生長(zhǎng)到一定時(shí)期，達(dá)到了產(chǎn)酶的高峰。綜合各方面考慮，選擇硫酸銨質(zhì)量濃度為15 g/L。

圖2　硫酸銨含量對(duì)發(fā)酵的影響Fig.2 Effect of ammonium sulfate content on fermentation

2.3 pH對(duì)發(fā)酵的影響

圖3　pH對(duì)發(fā)酵的影響Fig.3 Effect of pH on fermentation

由圖3可知，在pH為5.0時(shí)，粗蛋白含量最高，達(dá)到10.72g/100 g；在pH為3.0時(shí)，總糖含量最高，達(dá)到0.91 mg/g，發(fā)酵初期，發(fā)酵液中存在的單糖抑制了纖維素酶的產(chǎn)生，產(chǎn)生了葡萄糖效應(yīng)，故總糖含量比其他同階段生長(zhǎng)的要高。酶活在pH 5.0時(shí)最高，達(dá)到5.87 U/g。綜合各方面考慮，選擇pH5.0為最適pH值。

2.4料液比對(duì)發(fā)酵的影響

圖4　料液比對(duì)發(fā)酵的影響Fig.4 Effect of solid-liquid ratio on fermentation

由圖4可知，隨料液比的增大，粗蛋白含量由7.05 g/100 g增加至9g/100g；總糖含量變化較??；酶活起初變化不明顯，料液比由1∶9（g∶mL）增加到1∶12（g∶mL），增長(zhǎng)較為明顯，由5.98 U/g增加至6.68 U/g，料液比高于1∶12（g∶mL）以后，增加緩慢，最終達(dá)到6.97 U/g。增大料液比，會(huì)降低降解后各種活性物質(zhì)的提取效果，同時(shí)還會(huì)增加水的用量，增加提取成本，綜合以上情況，料液比選擇1∶12（g∶mL）較為合適。

2.5發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵的影響

圖5　發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵的影響Fig.5 Effect of fermentation time on fermentation

由圖5可知，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，霉菌生長(zhǎng)蛋白質(zhì)含量、酶活和總糖含量均逐漸增加，在第7天時(shí)均達(dá)到最高，纖維素酶活為5.41 U/g，蛋白質(zhì)含量為8.66 g/100 g，總糖含量達(dá)到0.76 mg/g，第8天時(shí)蛋白質(zhì)含量減少，可能是因?yàn)殡S菌體的生長(zhǎng)蛋白質(zhì)含量增加，在菌體死亡自溶時(shí)蛋白質(zhì)含量減少；酶活增加是因?yàn)榫w生長(zhǎng)到一定時(shí)期會(huì)產(chǎn)纖維素酶，到第8天時(shí)減少可能是纖維素酶被分解了；總糖含量的變化趨勢(shì)與蛋白相似，因?yàn)槊咕a(chǎn)的纖維素酶是胞外酶，分解剛毛藻中的纖維素使得總糖含量一直增加，在第8天的時(shí)候糖減少，可能是因?yàn)樘潜焕昧?。綜合來(lái)看，發(fā)酵時(shí)間選擇7 d較為合適。

2.6發(fā)酵溫度對(duì)發(fā)酵的影響

圖6　發(fā)酵溫度對(duì)發(fā)酵的影響Fig.6 Effects of fermentation temperature on fermentation

由圖6可知，粗蛋白及纖維素酶活均隨發(fā)酵溫度先增加后減少，在30℃的時(shí)候最高，粗蛋白含量為8.78 g/100 g，纖維素酶活為7.54U/g。發(fā)酵溫度過(guò)高，導(dǎo)致纖維素酶酶活失活?？偺呛康淖兓淮螅?0℃最高，為0.34 mg/g。因此選擇30℃為最適發(fā)酵溫度。

2.7霉菌發(fā)酵工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)

以發(fā)酵液中的粗蛋白含量、總糖含量、纖維素酶酶活為測(cè)定指標(biāo)，對(duì)pH值、料液比和硫酸銨質(zhì)量濃度3個(gè)因素進(jìn)行L9（33）正交試驗(yàn)。結(jié)果見表2。

表2　霉菌發(fā)酵工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果及分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiments for mold fermentation technology optimization

由表2的極差分析可知，當(dāng)以蛋白含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)時(shí)，各因素影響的主次順序?yàn)榈促|(zhì)量濃度＞pH＞料液比，最優(yōu)組合為A1B3C3。當(dāng)以總糖含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)時(shí)，因素的主次順序?yàn)榈礉舛取盗弦罕取祊H，最優(yōu)組合為A3B3C3。當(dāng)以纖維素酶活為評(píng)價(jià)指標(biāo)時(shí)，因素的主次順序?yàn)榈礉舛龋緋H＞料液比，最優(yōu)組合為A1B1C3。因3組組合不統(tǒng)一，需進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。

2.8驗(yàn)證試驗(yàn)

由于研究的是青霉菌對(duì)剛毛藻的降解情況，所以糖的含量是一個(gè)重要的指標(biāo)，總糖含量越大代表纖維素被酶降解的程度越高，分別在上述3個(gè)最優(yōu)組合條件下做驗(yàn)證試驗(yàn)，檢測(cè)發(fā)酵液中總糖的含量分別為0.43 mg/g、0.58 mg/g、0.34 mg/g。所以選擇青霉菌的降解最佳條件為C3B3A3，即pH值為6.0，料液比為1∶15（g∶mL），硫酸銨質(zhì)量濃度20 g/L。在該條件下發(fā)酵液中蛋白含量為12.44 g/100 g，總糖含量0.58 mg/g，纖維素酶酶活4.84 U/g。

3　結(jié)論

本試驗(yàn)主要研究利用青霉菌進(jìn)行剛毛藻中纖維素的降解，試驗(yàn)表明降解的最佳條件為藻粉3 g，發(fā)酵溫度30℃，料液比1∶15（g∶mL），硫酸銨質(zhì)量濃度20 g/L，磷酸二氫鉀1.0 g/L，硫酸鎂0.5 g/L，緩沖液pH 6.0，結(jié)果是蛋白含量為12.44g/100 g，總糖含量0.58 mg/g，纖維素酶酶活4.84 U/g。各因素對(duì)纖維素酶活、總糖和粗蛋白的影響不同，因此在討論菌株對(duì)海藻中纖維素降解因素時(shí)，需要定義具體的發(fā)酵條件，本試驗(yàn)利用霉菌對(duì)剛毛藻纖維素降解只是進(jìn)行了初步探討，降解后對(duì)其生物活性物質(zhì)的分離提取的影響有待進(jìn)一步研究，希望在此基礎(chǔ)上，為海藻中生物活性成分的高效提取提供幫助。

［1］王紅育，李穎.海藻產(chǎn)品開發(fā)現(xiàn)狀及應(yīng)用［J］.食品研究與開發(fā)，2008，29（8）：161-164.

［2］高越，戎會(huì)軍，董慶文.剛毛藻對(duì)除草劑敏感性的研究［J］.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，43（1）：84-85.

［3］杜琨，何建鵬.海藻醬油的研究［J］.中國(guó)釀造，2007，26（7）：69-71.

［4］楊梅玉，趙偉，陳文娜，等.大腸桿菌產(chǎn)海藻糖合成酶發(fā)酵條件的優(yōu)化［J］.中國(guó)釀造，2015，34（10）：78-81.

［5］吳超元.海帶養(yǎng)殖［M］.北京：科學(xué)出版社，2008：946-983.

［6］唐正康.基于偏離份額模型的海洋產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)分析——以江蘇為例［J］.技術(shù)經(jīng)濟(jì)與管理研究，2011，20（12）：97-100.

［7］楊楠楠，鐘響，劉娟.剛毛藻纖維素的酶解工藝［C］//黃山：第六屆生物產(chǎn)業(yè)技術(shù)研討會(huì)，2009.

［8］葉碧碧，曹德菊，張良昆，等.剛毛藻對(duì)水中N、P的控制及其環(huán)境條件研究［J］.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，38（4）：575-578.

［9］王芳，陳介南，張林，等.產(chǎn)維生素酶里氏木霉的研究進(jìn)展［J］.中國(guó)釀造，2014，33（6）：1-5.

［10］薛橋麗，排玲玲，胡永金，等.纖維素酶高產(chǎn)菌株產(chǎn)酶條件的優(yōu)化［J］.中國(guó)釀造，2013，32（3）：110-113.

［11］李亮亮，牛森.纖維素酶活力測(cè)定方法的比較研究［J］.遼寧農(nóng)業(yè)科學(xué)，2002（4）：16-18.

［12］劉穎，張偉偉，王馥.綠色木霉產(chǎn)纖維素酶發(fā)酵條件的研究［J］.食品工業(yè)科技，2008，29（3）：128-130

［13］趙玉萍，楊娟.四種纖維素酶酶活測(cè)定方法的比較［J］.食品研究與開發(fā)，2006，27（3）：116-118.

［14］林志偉，孫冬梅，張紅梅，等.黃綠木霉菌產(chǎn)纖維素酶條件的優(yōu)化［J］.微生物學(xué)通報(bào)，2008，53（1）：59-62.

［15］LI Y F，CHEN H.Study on degradation of cellulose and analysis of the influence factor on the degradation［J］.Renew Energ Resour，2009，15（6）：556-579.

Degradation of cellulose inCladophorabyPenicillium

LIANG Baodong1，WEI Haixiang1，BIAN Qingpeng1，JIANG Shuzhe2
（1.Department of Life Science and Engineering，Jining University，Qufu 273155，China；2.College of Life Science，Shandong University，Jinan 250013，China）

The degradation conditions of cellulose inCladophorabyPenicilliumwere researched.The effects of the nitrogen sources，ammonium sulfate content，solid-liquid ratio，pH，fermentation temperature and time on cellulose degradation were researched by single factor experiments.The effects of pH，solid-liquid ratio and ammonium sulfate content on protein content，total sugar content and cellulase activity were investigated by L9（33）orthogonal experiments.The optimum degradation conditions were algae powder 3 g/L，solid-liquid ratio 1∶15（g∶ml），ammonium sulfate 20 g/L，potassium dihydrogen phosphate 1 g/L，magnesium sulfate 0.5 g/L，buffer solution pH 6.0，fermentation temperature 30℃and time 7 d.Under the conditions，protein content，total sugar content and cellulase activity were 12.44 g/100 g，0.58 mg/g and 4.84 U/g，respectively.

Cladophora；Penicillium；degradation；cellulose

TS254.2

0254-5071（2016）07-0131-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.07.028

2016-03-09

濟(jì)寧市產(chǎn)學(xué)研合作計(jì)劃項(xiàng)目（2014jnkj02）

梁寶東（1979-），男，講師，碩士，研究方向?yàn)槲⑸锇l(fā)酵及生物活性物質(zhì)。