李飛龍，陳曉華，鄭　鑫，謝永振，譚之磊，賈士儒

耐酸性布拉氏酵母的篩選及高密度培養(yǎng)條件優(yōu)化

李飛龍，陳曉華，鄭鑫，謝永振，譚之磊，賈士儒*

（天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院，工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300457）

布拉氏酵母菌（Saccharomyces boulardii）是臨床上作為益生菌藥物治療腸道疾病使用的唯一一株酵母菌，作為微生態(tài)制劑，要保證其生物效果，必須能夠在胃腸道中保持一定的活菌數(shù)，研究發(fā)現(xiàn)影響布拉氏酵母菌在胃腸道中存活的最主要因素是低pH，為提高布拉氏酵母菌在低pH條件下的存活率，該研究采用常壓室溫等離子體（ARTP）誘變技術(shù)對(duì)S.boulardii進(jìn)行誘變，最終篩選出3株對(duì)低pH值耐受性較好的突變株。對(duì)突變株耐低pH穩(wěn)定性的研究結(jié)果表明，在傳代20次后，突變株YB-3具有較好的遺傳穩(wěn)定性，其存活率為51.79%。在5 L發(fā)酵罐中，對(duì)突變株YB-3高密度培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，最終所得布拉氏酵母菌體干質(zhì)量為58.79 g/L，比原始菌株提高了55.52%。

布拉氏酵母菌；室溫常壓等離子體誘變；高密度培養(yǎng)；耐酸性

布拉氏酵母（Saccharomyces boulardii）是法國科學(xué)家Henri Boulard在20世紀(jì)20年代初期于印尼水果荔枝中分離得到的一株非致病性酵母菌［1-2］。S.boulardii是臨床上作為益生菌藥物治療腸道疾病使用的唯一一株酵母菌［3-5］，目前廣泛用于預(yù)防和治療抗生素相關(guān)性腹瀉、艱難梭菌相關(guān)性腹瀉、胃腸道炎癥的藥物中。在許多國家，S.boulardii凍干制劑常作為用于預(yù)防兒童和成人的腹瀉藥物［2-6］。作為微生態(tài)制劑，S.boulardii常被用于治療由抗生素和微生物感染引起的腹瀉，維持胃腸道微環(huán)境平衡［6-9］。此外，其作為飼料添加劑的應(yīng)用已得到包括中國、歐盟在內(nèi)的世界上許多國家的認(rèn)可，在畜牧業(yè)中也有廣闊的應(yīng)用前景［10-12］。

研究表明，用S.boulardii處理感染艱難梭菌（Clostridium difficile）的限菌鼠一次，預(yù)防小鼠患結(jié)腸炎的有效率為16%，而當(dāng)小鼠連續(xù)攝入S.boulardii時(shí)，有效率可達(dá)56%；進(jìn)一步研究表明，這種保護(hù)作用不僅依賴于攝入S.boulardii的劑量，還和S.boulardii的活體細(xì)胞數(shù)有關(guān)［13］。在鼠腸道細(xì)胞上的研究結(jié)果證實(shí)了S.boulardii對(duì)霍亂弧菌（cholera toxin，CT）具有抑制作用，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中CT誘導(dǎo)環(huán)磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）的量比對(duì)照組下降了50%，經(jīng)確認(rèn)發(fā)揮作用的是一個(gè)120 ku的蛋白，如果將布拉氏酵母菌細(xì)胞加熱殺死時(shí)，酵母對(duì)cAMP的抑制作用也隨之消失［14-15］。

根據(jù)杜曉蒙［16］研究表明，影響攝入細(xì)胞活性的主要因素是膽汁鹽、胃腸道消化酶和pH值的變化，其中對(duì)S.boulardii活性影響最大的是pH。HUDSON L E等［17］使小鼠口服108個(gè)S.boulardii活細(xì)胞，4 h后從小鼠腸道只能回收到10～20個(gè)活細(xì)胞，直接證明了低pH對(duì)于S.boulardii菌存活率的影響。

由于S.boulardii對(duì)低pH耐受性較差，動(dòng)物口服S.boulardii后到達(dá)腸道內(nèi)的活菌數(shù)很少，作為飼料添加劑，要保證其生物效果，必須能夠在胃腸道中保持一定的活菌數(shù)［18-20］。為提高S.boulardii對(duì)低pH的耐受性和在胃腸道中存活效率，本研究通過常壓室溫等離子體（atmospheric and room temperature plasma，ARTP）誘變技術(shù)篩選出耐酸性的S.boulardii，提高S.boulardii對(duì)低pH的耐受性，并對(duì)篩選出的S.boulardii突變菌株高密度發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化，提高S.boulardii的菌體產(chǎn)量，為其工業(yè)化應(yīng)用打下基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

布拉氏酵母菌（S.boulardii）：由天津科技大學(xué)生化工程研究室保藏。

沙氏液體培養(yǎng)基：葡萄糖4%，蛋白胨1%，pH 5.5；

酵母浸出粉蛋白胨葡萄糖（yeast peptone dextrose，YPD）固體培養(yǎng)基：葡萄糖2%，酵母膏1%，蛋白胨2%，瓊脂2%，pH 6.0；

初始發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖1%，酵母膏1.2%，KH2PO40.08%，MgSO40.05%，pH 5.5。

1.2儀器與設(shè)備

ARTP-IIS ARTP育種儀：無錫源清天木生物科技有限公司；BIOTECH-5BG-7000A 5 L全自動(dòng)發(fā)酵罐：上海保興生物設(shè)備工程有限公司；IS-RDS3疊加式恒溫培養(yǎng)振蕩器：美國精騏生物工程有限公司；BioSpectrometer basic生物紫外分光光度計(jì)：德國Eppendorf公司；Bioscreen全自動(dòng)生長曲線分析儀：芬蘭OY Growth Curves公司。

1.3方法

1.3.1S.boulardii的培養(yǎng)

將S.boulardii接種到裝液量為100 mL/500 mL沙氏液體培養(yǎng)基中，30℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)24 h。

S.boulardii種子液的制備：將上述S.boulardii菌液按10%的接種量接種到裝液量為90 mL/500 mL沙氏液體培養(yǎng)基中，30℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)12 h。

1.3.2 ARTP誘變方法

將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的S.boulardii種子液于4℃、4 000 r/min離心5 min，收集菌體，用生理鹽水重懸浮后調(diào)節(jié)OD600nm至0.7，吸取10 μL菌液均勻涂布在載片表面，將載片置于載物臺(tái)上，設(shè)置ARTP育種儀2 mm射距照射，分別照射0、5 s、10 s、15 s、20 s、25 s、30 s、35 s、40 s、45 s、50 s。將經(jīng)過誘變處理后的載片置于裝有1 mL生理鹽水的離心管中，振蕩均勻后稀釋涂布YPD固體培養(yǎng)基上，每個(gè)梯度3個(gè)平行，采用稀釋涂布法測定菌落數(shù)，以菌落數(shù)來反映活菌數(shù)，計(jì)算致死率。致死率計(jì)算公式如下：

1.3.3耐酸性S.boulardii突變株的初篩

將經(jīng)過ARTP誘變處理的S.boulardii稀釋涂布于YPD固體培養(yǎng)基上，30℃靜置培養(yǎng)48 h，挑取單菌落接種至裝液量為50 mL/250 mL pH 2.0的沙氏液體培養(yǎng)基中，30℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)12 h，在波長600 nm處測定其光密度OD600nm值，選擇OD600nm值較高的培養(yǎng)液中的菌株進(jìn)行復(fù)篩。

1.3.4耐酸性S.boulardii突變株的復(fù)篩及耐酸性測定

制備初篩得到單菌落種子液后，以10%的接種量接種至裝液量為50mL/250mLpH2.0的沙氏液體培養(yǎng)基中，30℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)6 h，采用稀釋涂布法測定菌落數(shù)，并按照下列公式計(jì)算存活率。

1.3.5S.boulardii突變菌株高密度培養(yǎng)條件優(yōu)化

杜曉蒙［16］對(duì)搖瓶培養(yǎng)S.boulardii的培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化，本文在此基礎(chǔ)上對(duì)S.boulardii突變菌株YB-3高密度培養(yǎng)條件經(jīng)行了優(yōu)化。將制備的種子液按一定比例接種至裝有3 L發(fā)酵培養(yǎng)基的5 L自動(dòng)發(fā)酵罐中，30℃發(fā)酵36 h，分別考察接種量（5.0%、7.5%、10.0%、12.5%和15.0%）、pH（4.0、4.5、5.0、5.5和6.0）、溶氧水平（dissolved oxygen，DO）（15%、20%、25%、30%和40%）和發(fā)酵過程中葡萄糖質(zhì)量濃度（0.5 g/L、2.5 g/L、5 g/L、7.5 g/L和10 g/L）對(duì)S.boulardii干質(zhì)量的影響，確定高密度培養(yǎng)S.boulardii的最適條件。

1.3.6分析檢測方法

菌體干質(zhì)量（dry cell mass，DCM）的測定：取8 mL發(fā)酵液，4 000 r/min離心5 min，用去離子水清洗菌體2～3次，離心后棄上清液，于95℃條件下烘干至恒質(zhì)量，計(jì)算菌體干質(zhì)量。

發(fā)酵液葡萄糖質(zhì)量濃度的測定：取8 mL發(fā)酵液，4 000 r/min離心5min，取上清液適當(dāng)稀釋，用SBA-40E生物傳感分析儀測定其中葡萄糖的質(zhì)量濃度。

2　結(jié)果與分析

2.1 ARTP誘變致死曲線的測定

根據(jù)1.3.2所述方法對(duì)S.boulardii進(jìn)行ARTP誘變，得到致死率曲線，結(jié)果如圖1所示。

由圖1可知，等離子體對(duì)S.boulardii的殺傷有一個(gè)突變的過程，當(dāng)ARTP處理時(shí)間＜15 s時(shí)，S.boulardii的致死率不足20%；當(dāng)ARTP處理時(shí)間為35 s，S.boulardii的致死率約為97.38%；40 s以后檢測不到有活性的S.boulardii，此時(shí)致死率達(dá)到100%。為保持有一個(gè)較高的突變率，因此設(shè)定ARTP誘變時(shí)間為35 s，這與金麗華等［21-22］選擇的誘變致死率基本一致。

圖1　布拉氏酵母菌的ARTP致死率曲線Fig.1 Lethal rate curve ofS.boulardiiby ARTP

2.2耐酸性S.boulardii突變株篩選

經(jīng)ARTP誘變處理后，從酸性平板上共挑取1 025株S.boulardii進(jìn)行二次初篩，共篩選出118株長勢明顯優(yōu)于出發(fā)菌的突變株；經(jīng)過復(fù)篩后得到11株S.boulardii突變株，其在pH 2.0條件下的存活率如表1所示。

表1　S.boulardii突變株在pH 2.0條件下培養(yǎng)6 h的存活率Table 1 Survival rate ofS.boulardiimutant strains under the conditions of pH 2.0 for 6 h

由表1可知，突變株YB-1、YB-2和YB-3在pH 2.0條件下培養(yǎng)6 h的存活率為分別29.63%、23.77%和50.83%，比出發(fā)菌株（存活率為11%）分別提高了169.36%、116.09%和462.09%。這三株菌對(duì)低pH的耐受性明顯優(yōu)于出發(fā)株與其他誘變株，因此選定這三株菌作為突變菌進(jìn)行下一步研究。2.3S.boulardii突變株耐低pH穩(wěn)定性的測定

圖2　突變株在pH 2.0條件下的傳代培養(yǎng)Fig.2 Generation culture of mutant strains under the conditions of pH 2.0

為確定誘變菌株的遺傳穩(wěn)定性，對(duì)篩選出的突變株YB-1、YB-2和YB-3進(jìn)行20代的傳代培養(yǎng)，每周傳代一次，測定其存活率，結(jié)果如圖2所示。

由圖2可知，傳代20次之后的突變株YB-1、YB-2和YB-3分別在pH 2.0條件下培養(yǎng)6 h后的存活率，分別是10.93%，23.77%和51.79%。突變株YB-1對(duì)低pH的耐受性變差，而突變株YB-2、YB-3對(duì)低pH的耐受性保持較好的遺傳穩(wěn)定性，說明ARTP誘變技術(shù)選育耐低pHS.boulardii突變株是可行的。突變株YB-3的在低pH條件下存活率較高且穩(wěn)定性較好，因此，選用突變株YB-3進(jìn)行后續(xù)發(fā)酵優(yōu)化試驗(yàn)。

2.4 5 L發(fā)酵罐高密度培養(yǎng)S.boulardii條件的優(yōu)化

2.4.1接種量的選擇

接種量對(duì)高密度培養(yǎng)S.boulardii菌體干質(zhì)量的影響，結(jié)果見圖3。

圖3　接種量對(duì)布拉氏酵母菌菌體干質(zhì)量的影響Fig.3 Effect of inoculum on dry cell mass ofS.boulardii

由圖3可知，當(dāng)接種量為5.0%～10.0%時(shí)，菌體干質(zhì)量隨接種量的增而增加；當(dāng)接種量為10%時(shí)，所得到菌體干質(zhì)量達(dá)到最大值，為53.41 g/L，繼續(xù)增加接種量，菌體干質(zhì)量稍有下降因此，選擇接種量10%為宜。

2.4.2 pH的確定

pH對(duì)高密度培養(yǎng)S.boulardii菌體干質(zhì)量的影響，結(jié)果見圖4。

圖4　pH對(duì)布拉氏酵母菌菌體干質(zhì)量的影響Fig.4 Effect of pH on dry cell mass ofS.boulardii

由圖4可知，S.boulardii的干質(zhì)量隨著pH的增高呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢，其中在pH 5.5時(shí)，菌體干質(zhì)量達(dá)到最高，為53.95 g/L。同時(shí)為了防止發(fā)酵初期pH過高發(fā)酵液染菌，在高密度培養(yǎng)初期采用pH 5.0，當(dāng)培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期時(shí)pH再改為5.5。

2.4.3溶氧水平的確定

溶氧水平對(duì)高密度培養(yǎng)S.boulardii菌體干質(zhì)量的影響，結(jié)果見圖5。

圖5　溶氧水平對(duì)布拉氏酵母菌菌體干質(zhì)量影響Fig.5 Effect of dissolved oxygen level on dry cell mass ofS.boulardii

由圖5可知，S.boulardii干質(zhì)量在一定范圍內(nèi)隨著發(fā)酵液中溶氧水平的增加變化不顯著，發(fā)酵結(jié)束之后，不同組別之間S.boulardii干質(zhì)量差別不大，其中在溶解氧水平為30%時(shí)，菌體干質(zhì)量達(dá)到最高，為54.33 g/L。因此溶氧水平選擇30%為宜。

2.4.4發(fā)酵過程中葡萄糖質(zhì)量濃度的測定

發(fā)酵過程中葡萄糖質(zhì)量濃度對(duì)高密度培養(yǎng)S.boulardii菌體干質(zhì)量的影響，結(jié)果見圖6。

圖6　發(fā)酵過程中葡萄糖質(zhì)量濃度對(duì)布拉氏酵母菌菌體干質(zhì)量影響Fig.6 Effect of glucose content during the fermentation on dry cell mass ofS.boulardii

由圖6可知，研究發(fā)酵過程中葡萄糖的質(zhì)量濃度對(duì)S.boulardii菌體干質(zhì)量的影響發(fā)現(xiàn)，隨著發(fā)酵液中葡萄糖含量的提高，S.boulardii菌體干質(zhì)量逐漸減低，當(dāng)葡萄糖濃度分別維持在0.5 g/L時(shí)，發(fā)酵結(jié)束時(shí)S.boulardii的干質(zhì)量最高可達(dá)58.79 g/L。因而發(fā)酵過程中選擇將葡萄糖的質(zhì)量濃度維持在0.5 g/L左右。

2.4.6高密度培養(yǎng)S.boulardii的耐酸性測定

為了驗(yàn)證高密度培養(yǎng)對(duì)是否對(duì)S.boulardii突變株YB-3的耐酸性有影響，取上述優(yōu)化高密度培養(yǎng)條件結(jié)束后的S.boulardii突變株YB-3于pH 2.0的沙氏液體培養(yǎng)基中，30℃、180 r/min振蕩處理6 h后，計(jì)算其存活率。

結(jié)果表明，突變株YB-3的存活率為40.19%，相比于誘變結(jié)束時(shí)的存活率（50.83%），降低了26.47%。分析其原因可能是高密度發(fā)酵結(jié)束時(shí)，S.boulardii處于穩(wěn)定期末開始進(jìn)入衰亡期，此狀態(tài)下的S.boulardii對(duì)外界環(huán)境的適應(yīng)性較差，因而在低pH條件下的存活率有了明顯的降低。后續(xù)研究表明，將此狀態(tài)下的S.boulardii接種至新鮮沙氏液體培養(yǎng)基培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，測定其耐酸性，發(fā)現(xiàn)其在低pH條件下的存活率能恢復(fù)至50%的水平，說明突變株YB-3的耐酸性具有良好的穩(wěn)定性。

3　結(jié)論

通過ARTP誘變的方法對(duì)S.boulardii進(jìn)行了篩選，共獲得了3株對(duì)低pH耐受性較好的菌株，其中突變株YB-3在pH 2.0條件下培養(yǎng)6 h的存活率為50.83%，相比于原始菌株的11%提高了462.1%，有效地提高了對(duì)低pH的耐受性，達(dá)到了本次試驗(yàn)的目的。

同時(shí)以誘變株YB-3為出發(fā)菌株優(yōu)化了高密度培養(yǎng)S.boulardii的條件，最終確定液態(tài)高密度培養(yǎng)S.boulardii的條件為：接種量為10%，溶氧水平30%，發(fā)酵過程中葡萄糖質(zhì)量濃度維持在0.5 g/L左右，發(fā)酵初期pH 5.0，當(dāng)培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期時(shí)pH改為5.5，30℃培養(yǎng)36 h。發(fā)酵結(jié)束時(shí)所得S.boulardii菌體干質(zhì)量為58.79 g/L，比原始菌株提高了55.52%。

本研究篩選出了對(duì)低pH的耐受性較好的S.boulardii突變菌株，有助于提高S.boulardii在胃腸道中的存活率，對(duì)于其在養(yǎng)殖業(yè)上的應(yīng)用具有深遠(yuǎn)的意義。

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Screening of an acid-resistantSaccharomyces boulardiiand optimization of its high density cultivation conditions

LI Feilong，CHEN Xiaohua，ZHENG Xin，XIE Yongzhen，TAN Zhilei，JIA Shiru*
（Key Laboratory of Industrial Fermentation Microbiology，Ministry of Education，College of Biotechnology，Tianjin University of Science&Technology，Tianjin 300457，China）

Saccharomyces boulardiiis the only strain of yeast as clinical probiotic drugs for the treatment of intestinal diseases.As a microecology preparation，in order to ensure its biological effect，it must be able to maintain a certain number of viable bacteria in the gastrointestinal tract.Research showed that low pH was the most important factor affectingS.boulardiisurvival rate in the gastrointestinal tract.To improve the survival rate ofS.boulardiiin low pH condition，atmospheric and room temperature plasma（ARTP）was used forS.boulardiimutagenesis.Finally，three mutant stains with thelow pH-resistant were selected.The results of stability of the mutant strains resistant to low pH showed that after 20 times generation，mutant YB-3 had good genetic stability and its survival rate was 51.79%.In 5 L fermentor，the high density cultivation conditions of mutant YB-3 were optimized.The dry cell weight ofS.boulardiiobtained was 58.79 g/L，which was increased by 55.52%than that of the original strain.

Saccharomyces boulardii；atmospheric and room temperature plasma；high density cultivation；acid resistant

Q815

0254-5071（2016）07-0015-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.07.004

2016-03-10

長江學(xué)者和創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)發(fā)展計(jì)劃資助（IRT1166）

李飛龍（1988-）男，碩士研究生，主要從事飼料添加劑方面的研究工作。

賈士儒（1954-）男，教授，博士，主要從事生物防腐劑、發(fā)菜、細(xì)菌纖維素等的研究工作。