劉茂林，劉義明，徐 飛，張道康，黃慧麗，李 浛，李秀波

（1中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所/國(guó)家飼料藥物基準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100081；2北京市獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100107）

硫酸頭孢喹肟乳房注入劑中有關(guān)物質(zhì)的檢測(cè)方法

劉茂林1，劉義明1，徐 飛1，張道康1，黃慧麗1，李 浛2，李秀波1

（1中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所/國(guó)家飼料藥物基準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100081；2北京市獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100107）

【目的】參考硫酸頭孢喹肟注射液獸藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，建立了硫酸頭孢喹肟乳房注入劑有關(guān)物質(zhì)的檢測(cè)方法，建立專屬性強(qiáng)、靈敏度高、快速簡(jiǎn)便的方法，可有效的分析硫酸頭孢喹肟乳房注入劑的有關(guān)物質(zhì)，為制劑的質(zhì)量控制和工藝優(yōu)化提供依據(jù)?！痉椒ā?jī)x器方法按照硫酸頭孢喹肟注射液獸藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)要求，色譜條件：流動(dòng)相為高氯酸鈉緩沖溶液（精密稱取NaClO4·H2O 3.45g于1 000 mL水溶解，加入磷酸12 mL，乙腈115 mL，三乙胺調(diào)pH3.6），流速為1 mL·min-1，檢測(cè)波長(zhǎng)為270 nm，進(jìn)樣量為20 μL。采用高效液相色譜法（HPLC）峰面積歸一化法計(jì)算硫酸頭孢喹肟乳房注入劑（干乳期）中有關(guān)物質(zhì)的檢測(cè)限及其濃度；考察該檢查方法精密度及儀器精密度；考察樣品主成分及有關(guān)物質(zhì)的穩(wěn)定性及線性相關(guān)性；對(duì)樣品以適當(dāng)條件的破壞后對(duì)該方法進(jìn)行專屬性考察，例如使用0.2 mol·L-1HCl溶液、0.2 mol·L-1NaOH溶液對(duì)硫酸頭孢喹肟乳房注入劑進(jìn)行4 h的破壞；使用10% H2O2溶液對(duì)硫酸頭孢喹肟乳房注入劑進(jìn)行30 min的破壞；以及90℃高溫對(duì)硫酸頭孢喹肟乳房注入劑進(jìn)行1 h的破壞。對(duì)比樣品破壞前后主成分峰面積的降解程度，有關(guān)物質(zhì)含量的變化程度，主成分峰與雜峰之間及有關(guān)物質(zhì)峰與雜質(zhì)峰之間的分離度，以及雜質(zhì)峰個(gè)數(shù)的變化等主要參數(shù)。并對(duì)硫酸頭孢喹肟乳房注入劑（干乳期）三批樣品中的有關(guān)物質(zhì)含量進(jìn)行測(cè)定?！窘Y(jié)果】硫酸頭孢喹肟乳房注入劑經(jīng)過一系列的梯度稀釋后，當(dāng)樣品主成分濃度為7.5 μg·mL-1時(shí)，有關(guān)物質(zhì)的信噪比≥3，按HPLC峰面積歸一化法計(jì)算，有關(guān)物質(zhì)濃度為0.05 μg·mL-1；100 μg·mL-1濃度樣品進(jìn)樣精密度RSD達(dá)到0.8%，方法精密度RSD達(dá)到0.6%；主成分在7.5—300 μg·mL-1濃度范圍內(nèi)，按HPLC峰面積歸一化法計(jì)算，有關(guān)物質(zhì)濃度范圍為0.05—2 μg·mL-1，有關(guān)物質(zhì)濃度對(duì)峰面積線性回歸分析方程為y = 45935x-130.03，相關(guān)系數(shù)r=1。硫酸頭孢喹肟乳房注入劑在一定時(shí)間內(nèi)在強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、氧化、高溫破壞條件下均有降解，以破壞前樣品主成分含量為100%計(jì)，使用10% H2O2溶液對(duì)制劑進(jìn)行30 min的氧化破壞后主成分含量降解達(dá)30%左右，在90℃高溫下對(duì)制劑進(jìn)行1 h的高溫破壞后主成分含量降解達(dá)20%左右，使用0.2 mol·L-1HCl溶液和0.2 mol·L-1NaOH溶液對(duì)制劑進(jìn)行4 h的酸、堿破壞后主成分含量降解均在10%左右。破壞前后主成分峰與有關(guān)物質(zhì)峰的保留時(shí)間均未發(fā)生變化，主峰與雜峰以及雜峰與雜峰之間分離度均大于 1.5，雜質(zhì)峰含量發(fā)生變化，雜質(zhì)數(shù)量破壞后均有增加。對(duì)硫酸頭孢喹肟乳房注入劑（干乳期）三批制劑有關(guān)物質(zhì)含量進(jìn)行檢測(cè)后，按HPLC面積歸一化法計(jì)算顯示有關(guān)物質(zhì)峰面積均未超過主峰峰面積的 2%，符合獸藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)定?！窘Y(jié)論】硫酸頭孢喹肟乳房注入劑有關(guān)物質(zhì)檢測(cè)方法簡(jiǎn)便易行，專屬性強(qiáng)，靈敏度好，精密度高，可應(yīng)用于硫酸頭孢喹肟乳房注入劑有關(guān)物質(zhì)的考察。

硫酸頭孢喹肟乳房注入劑；有關(guān)物質(zhì)；HPLC法

0 引言

【研究意義】國(guó)家飼料藥物基準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室自主研發(fā)了硫酸頭孢喹肟乳房注入劑（干乳期），主要應(yīng)用于干乳期奶牛乳房炎的預(yù)防和治療，并已獲得國(guó)家新獸藥證書（2015新獸藥證字-62號(hào)）。在硫酸頭孢喹肟注射液獸藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)基礎(chǔ)上，建立了硫酸頭孢喹肟乳房注入劑有關(guān)物質(zhì)的檢查方法，該方法靈敏度高，專屬性強(qiáng)，可用于硫酸頭孢喹肟乳房注入劑中有關(guān)物質(zhì)的檢測(cè)?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】 頭孢喹肟（cefquinome），是20世紀(jì)80年代由德國(guó)赫斯特公司（Hoechst AG）研發(fā)的第一個(gè)動(dòng)物專用第四代頭孢菌素類抗生素，商品名為克百特（Cobactan）［1］，具有廣譜抗菌、生物效價(jià)高、適于非腸道給藥、低毒低殘留、對(duì)β-內(nèi)酰胺酶高度穩(wěn)定等優(yōu)勢(shì)［2-3］，目前已經(jīng)被歐盟獸用藥品委員會(huì)（CVMP）批準(zhǔn)用于預(yù)防和治療由敏感菌引起的家畜呼吸道感染、奶牛乳腺炎和子宮內(nèi)膜炎［4］。頭孢喹肟分子式為C23H24N6O5S2，化學(xué)名為（6R-7R）-7-［ （2-氨基-4一噻唑基）-2-（甲氧亞氨基）乙酰氨基］-3-［（5，6，7，8-四氫喹啉甲基）甲氧］-8-氧代-5-硫雜-1-氮雜雙環(huán)［4.2.0］辛-2-烯-2-甲酸，分子量為528.60。頭孢喹肟的合成路線主要有 3種［5-9］，均由5，6，7，8-四氫喹啉，又名2，3-環(huán)己基吡啶（2， 3 - cyclohexyl pyridine）合成而來(lái)。5，6，7，8-四氫喹啉既是頭孢喹肟的合成前體，也可以在特殊作用力下由頭孢喹肟裂解而來(lái)。藥物中的雜質(zhì)是指存在于藥物中，但化學(xué)結(jié)構(gòu)與藥物不一樣的任何一種成分，其中與藥物結(jié)構(gòu)類似或具淵源的雜質(zhì)又稱為有關(guān)物質(zhì)［10-11］。雜質(zhì)的活性藥物成分可能對(duì)藥物產(chǎn)品的質(zhì)量和靶動(dòng)物的安全性產(chǎn)生較大的影響［12-13］。因此進(jìn)行藥物或制劑中有關(guān)物質(zhì)的測(cè)定，對(duì)于提高化學(xué)的合成過程和優(yōu)化藥物制劑工藝，減少甚至消除此類雜質(zhì)是至關(guān)重要的［14］。硫酸頭孢喹肟注射液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定，5，6，7，8-四氫喹啉為硫酸頭孢喹肟的單個(gè)有關(guān)物質(zhì)。四氫喹啉衍生物如1，2，3，4-四氫喹啉或者其他衍生物均勻良好的抗癌、抗抑郁活性［15-16］，而單體5，6，7，8-四氫喹啉的化學(xué)性質(zhì)和藥理學(xué)性質(zhì)卻沒有相關(guān)研究報(bào)道。近年來(lái)，隨著色譜、光譜技術(shù)的迅速發(fā)展，越來(lái)越多的聯(lián)用技術(shù)被運(yùn)用于藥物質(zhì)量控制，通常藥品中有關(guān)物質(zhì)含量相對(duì)較低［17］，高效液相色譜法（HPLC）具備檢測(cè)限較低、靈敏度較高的優(yōu)勢(shì)，在有關(guān)物質(zhì)結(jié)構(gòu)已知的情況下被廣泛用于開發(fā)高效分離，簡(jiǎn)便可靠的雜質(zhì)測(cè)定方法［18］。MUSTAKHUSEN等［19］在確證 U-高尿酸血癥治療藥的有關(guān)物質(zhì)結(jié)構(gòu)時(shí)，使用了LC-MS/MS、NMR以及IR技術(shù)，推測(cè)了其有關(guān)物質(zhì)的生成路徑。SATYANARAYANA等［20］在鑒別度他雄胺原料中雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)時(shí)，也采用了HPLC、IR、NMR、MS技術(shù)。ALIREZA 等［21］利用X-粉末衍射（PXRD）、差示掃描熱法（DSC）考察了阿莫西林原料藥的純度，并使用HPLC法對(duì)原料藥的有關(guān)物質(zhì)進(jìn)行驗(yàn)證。【本研究切入點(diǎn)】目前硫酸頭孢喹肟上市的產(chǎn)品主要有國(guó)外的英特威國(guó)際有限公司的硫酸頭孢喹肟注射液（（2011）外獸藥證字20號(hào)），國(guó)內(nèi)批準(zhǔn)產(chǎn)品劑型也以注射劑或粉劑為主，而且目前國(guó)內(nèi)外對(duì)硫酸頭孢喹肟乳房注入劑有關(guān)物質(zhì)的研究尚不深入?！緮M解決的關(guān)鍵問題】研究有關(guān)物質(zhì)檢查方法的專屬性，即通過給予研究對(duì)象極端或劇烈的條件，觀察新生成的雜質(zhì)來(lái)考察其降解產(chǎn)物，這也是目前有關(guān)物質(zhì)研究工作的重點(diǎn)［22-24］。本試驗(yàn)著重開展了硫酸頭孢喹肟乳房注入劑有關(guān)物質(zhì)檢查方法的專屬性研究，既在一定破壞條件下，使藥物主成分降解控制在 10%—30%以內(nèi)［10，25］，同時(shí)考察有關(guān)物質(zhì)的含量、分離度、雜質(zhì)數(shù)量變化等重要參數(shù)。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2014年11月1日在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所國(guó)家飼料藥物基準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室開展。

1.1儀器

高效液相色譜儀，Waters e2695 （UV2998）；分析天平，Sartorius CPA225D；離心機(jī)，Thermo Fisher；超聲儀，KQ-300DE；酸度計(jì)，Sartorius PB-21。

1.2試劑

頭孢喹肟標(biāo)準(zhǔn)品（中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，批號(hào)：K0312406，含量82.6%）；硫酸頭孢喹肟乳房注入劑（干乳期）（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所，批號(hào)：20141104，20141105，20141106）；高氯酸鈉、磷酸均為分析純；乙腈為色譜純，水為超純水。

1.3色譜條件及樣品處理方法

色譜條件參考硫酸頭孢喹肟注射液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)［26］，流動(dòng)相為高氯酸鈉緩沖液（精密稱取 3.45 g溶于1 000 mL水中，加乙腈115 mL和磷酸12 mL，三乙胺調(diào)pH=3.6）；流速為1 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)為270 nm；柱溫為30℃；進(jìn)樣量為20 μL。本試驗(yàn)采用的色譜柱為Waters Sunfire C18150 mm×4.6 mm 5 μm。

硫酸頭孢喹肟乳房注入劑處理方法：精密稱取硫酸頭孢喹肟乳房注入劑（干乳期）適量（約相當(dāng)于頭孢喹肟12.5 mg）置50 mL離心管中，加流動(dòng)相25 mL溶解，渦旋2 min，水浴超聲20 min，4 000 r/min離心5 min，取下層溶液20 μL，過0.45 μm濾膜，注入液相色譜儀，記錄色譜圖至主成分保留時(shí)間的2倍。

1.4檢測(cè)限考察

稱取一定量的硫酸頭孢喹肟標(biāo)準(zhǔn)品，甲醇溶解，流動(dòng)相稀釋成一系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，按1.3項(xiàng)下的色譜條件采用HPLC峰面積歸一化法計(jì)算硫酸頭孢喹肟乳房注入劑有關(guān)物質(zhì)的檢測(cè)限及其濃度，以s/n ≥3的最小樣品濃度為最低檢測(cè)限。

1.5精密度考察

1.5.1進(jìn)樣精密度 精密稱取批號(hào)為20141104的硫酸頭孢喹肟乳房注入劑（干乳期）適量，用流動(dòng)相溶解成濃度為100 μg·mL-1的溶液，按1.3項(xiàng)下色譜條件和樣品處理后重復(fù)進(jìn)樣5針，以頭孢喹肟峰面積計(jì)算RSD。

1.5.2方法精密度 精密稱取5份批號(hào)為20141104的硫酸頭孢喹肟乳房注入劑（干乳期）適量，用流動(dòng)相溶解成濃度為100 μg·mL-1的溶液，按1.3項(xiàng)下色譜條件和樣品處理后測(cè)定，并以頭孢喹肟峰面積計(jì)算RSD。

1.6穩(wěn)定性考察

精密稱取批號(hào)為 20141104的硫酸頭孢喹肟乳房注入劑（干乳期）適量，用流動(dòng)相溶解成濃度為 100 μg·mL-1的溶液，按1.3項(xiàng)下色譜條件和樣品處理后分別在室溫下于0、0.5、1、2、3 h時(shí)進(jìn)樣，測(cè)定主成分及雜質(zhì)峰面積。

1.7線性考察

精密稱取頭孢喹肟標(biāo)準(zhǔn)品適量，流動(dòng)相溶解并稀釋成300、200、100、30、7.5 μg·mL-1系列濃度的溶液，取20 μL進(jìn)樣，測(cè)定有關(guān)物質(zhì)峰及頭孢喹肟峰面積，以頭孢喹肟及有關(guān)物質(zhì)濃度對(duì)各自峰面積分別進(jìn)行線性回歸分析。

1.8專屬性考察

1.8.1樣品前處理 精密稱取2 g樣品置于50 mL離心管中，加入50 mL流動(dòng)相后渦旋2 min，水浴超聲20 min，4 000 r/min離心5 min。

1.8.2破壞前樣品處理 精密量取下清液1 mL，加流動(dòng)相1 mL，渦旋2 min后過0.2 μm濾膜，取20 μL進(jìn)樣，記錄色譜圖（圖1-a）。

1.8.3酸破壞樣品處理 精密量取下清液5 mL，于10 mL離心管中，加入0.2 mol·L-1HCl 2 mL，振蕩搖勻，置50℃水浴振蕩4 h后，自然冷卻，加入0.2 mol·L-1NaOH 2 mL中和，再加入1 mL流動(dòng)相后渦旋1 min，過0.2 μm濾膜，取20 μL進(jìn)樣，記錄色譜圖（圖1-b）。

1.8.4堿破壞樣品處理 精密量取下清液5 mL，于10 mL離心管中，加入0.2 mol·L-1NaOH 2 mL，振蕩搖勻，室溫下振蕩4 h后，加入0.2 mol·L-1HCl 2 mL中和，再加入1 mL流動(dòng)相后渦旋1 min，過0.2 μm濾膜，取20 μL進(jìn)樣，記錄色譜圖（圖1-c）。

1.8.5高溫破壞樣品處理 精密量取下清液5 mL，于10 mL離心管中，置90℃烘箱內(nèi)1 h后取出，自然冷卻，加入流動(dòng)相5 mL后渦旋1 min，過0.2 μm濾膜，取20 μL進(jìn)樣，記錄色譜圖（圖1-d）。

1.8.6氧化破壞樣品處理 精密量取下清液5 mL，于10 mL離心管中，加入10% H2O22 mL，振蕩搖勻，置50℃水浴振蕩30 min后，自然冷卻，加入流動(dòng)相3 mL后渦旋1 min，過0.2 μm濾膜，取20 μL進(jìn)樣，記錄色譜圖（圖1-e）。

圖1　樣品破壞前后色譜圖Fig. 1 The HPLC chromatograms of samples before and after destruction

2 結(jié)果

2.1檢測(cè)限確定

由數(shù)據(jù)表1可知，樣品經(jīng)一系列稀釋后，當(dāng)主成分濃度為7.5 μg·mL-1時(shí)，有關(guān)物質(zhì)的信噪比為3，經(jīng)過面積歸一化法計(jì)算，有關(guān)物質(zhì)的濃度為 0.05 μg·mL-1，因此本方法中硫酸頭孢喹肟乳房注入劑有關(guān)物質(zhì)的檢測(cè)限約為0.05 μg·mL-1，色譜圖如圖2。

表1　檢測(cè)限試驗(yàn)Table 1 Results of LOD tests

圖2　檢測(cè)限色譜圖Fig. 2 The HPLC chromatograms of LOD

2.2精密度試驗(yàn)

按1.5項(xiàng)下樣品處理方法處理的樣品按1.3項(xiàng)下色譜條件分析，同一樣品重復(fù)進(jìn)樣5次，以主峰峰面積計(jì)算，RSD=0.8%；同一批樣品平行處理 5個(gè)樣品，以主峰峰面積計(jì)算，RSD=0.6%。

2.3穩(wěn)定性試驗(yàn)

由數(shù)據(jù)表2可知，隨著放置時(shí)間的加長(zhǎng)，雜質(zhì)含量明顯增加，放置2 h的樣品測(cè)定其有關(guān)物質(zhì)已經(jīng)超過獸藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范規(guī)定的最高含量（2.0%）［26］，因此樣品配制后應(yīng)該立即檢測(cè)。

2.4線性考察

2.4.1頭孢喹肟濃度對(duì)峰面積進(jìn)行線性回歸分析，回歸方程為y = 45852x - 11520，相關(guān)系數(shù)r=1。表明頭孢喹肟在7.5—300 μg·mL-1濃度范圍內(nèi)，線性相關(guān)性良好（圖3）。

表2　穩(wěn)定性試驗(yàn)Tab 2 Results of stability tests

圖3　頭孢喹肟標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Fig. 3 The standard curve figure of Cef

圖4　有關(guān)物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Fig. 4 The standard curve figure of related-substances

表3　專屬性試驗(yàn)Table 3 Results of specific tests

2.4.2經(jīng)過主成分對(duì)照計(jì)算，有關(guān)物質(zhì)的濃度范圍為0.05—2 μg·mL-1，在此范圍內(nèi)有關(guān)物質(zhì)濃度對(duì)峰面積進(jìn)行線性回歸分析，回歸方程為y = 45935x-130.03，相關(guān)系數(shù)r=1，線性相關(guān)性良好（圖4）。

2.5專屬性考察結(jié)果

頭孢喹肟在強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、氧化、高溫條件下均有降解，以破壞前樣品主成分含量為 100%，氧化破壞主成分降解達(dá)30%，高溫破壞主成分降解達(dá)20%，酸、堿破壞主成分降解在10%左右，破壞前后主成分峰保留時(shí)間一致，各峰之間分離度良好。

雜質(zhì)峰與雜質(zhì)峰之間分離度達(dá)到1.2即可，而被測(cè)物與相鄰雜質(zhì)峰的分離度必須大于 1.5［27］。表 3數(shù)據(jù)中顯示，有關(guān)物質(zhì)與其他雜質(zhì)分離良好。本試驗(yàn)中，在一定時(shí)間內(nèi)硫酸頭孢喹肟乳房注入劑在各種破壞條件下樣品雜質(zhì)數(shù)量發(fā)生變化，有關(guān)物質(zhì)含量均有增加，但有關(guān)物質(zhì)相對(duì)保留時(shí)間基本不變。在破壞性試驗(yàn)中，有關(guān)物質(zhì)含量明顯增加且無(wú)其他干擾，表明擬定的色譜條件具有較強(qiáng)的專屬性，可應(yīng)用于頭孢喹肟乳房注入劑有關(guān)物質(zhì)檢查。

2.6制劑中有關(guān)物質(zhì)測(cè)定

按1.3項(xiàng)下的色譜條件及樣品處理后，對(duì)硫酸頭孢喹肟乳房注入劑（干乳期）3批制劑中的有關(guān)物質(zhì)進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如下（表4）。

由表4可知，按面積歸一法計(jì)算，3批制劑中有關(guān)物質(zhì)均未超過主峰面積的2.0%，符合獸藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)定。筆者使用了3根不同品牌的C18色譜柱，均按上述色譜條件進(jìn)行硫酸頭孢喹肟乳房注入劑中有關(guān)物質(zhì)含量的考察。結(jié)果發(fā)現(xiàn)除頭孢喹肟及有關(guān)物質(zhì)保留時(shí)間有一定差異外，雜質(zhì)個(gè)數(shù)及含量均無(wú)變化。經(jīng)過調(diào)整柱溫或者適當(dāng)調(diào)整流動(dòng)相比例以后，保留時(shí)間有所變化，但均未影響含量大小，說明本方法耐用性較好。

表4　有關(guān)物質(zhì)測(cè)定結(jié)果Table 4 Results of the determination of the related substances

3 討論

本試驗(yàn)針對(duì)硫酸頭孢喹肟乳房注入劑有關(guān)物質(zhì)的方法研究，主要參考了鄧晶晶［28］及樊后民等［29］使用高效液相色譜法分別測(cè)定頭孢美唑鈉及頭孢噻吩鈉中的有關(guān)物質(zhì)。鄧晶晶除了考察頭孢美唑鈉的檢測(cè)限、精密度、線性相關(guān)性等之外，同時(shí)進(jìn)行了酸、堿、氧化、高溫以及高濕條件下的破壞，發(fā)現(xiàn)該藥耐酸，在其他條件下破壞主成分后，產(chǎn)生唯一的一種有關(guān)物質(zhì)，即TMT（1-甲基-1H-四唑-5-硫醇）。在各種破壞條件下，TMT保留時(shí)間不變，含量均發(fā)生了變化。樊后民同樣對(duì)頭孢噻吩鈉進(jìn)行了酸、堿、氧化、高溫4種條件的破壞，破壞后發(fā)現(xiàn)該藥在各種破壞條件下主成分均有降解，且各種破壞條件下雜質(zhì)數(shù)量發(fā)生明顯變化，有關(guān)物質(zhì)含量明顯增加。這兩種方法均有較強(qiáng)的專屬性，破壞條件簡(jiǎn)單快速，但均未明確表述在一定時(shí)間內(nèi)主成分峰及有關(guān)物質(zhì)峰含量的具體變化，而本文所選擇的破壞條件及破壞時(shí)間，必須保證藥物主成分峰降解量控制在10%—30%，在此基礎(chǔ)上研究有關(guān)物質(zhì)及其他雜質(zhì)的數(shù)量及含量變化等重要參數(shù)。

在硫酸頭孢喹肟乳房注入劑有關(guān)物質(zhì)專屬性試驗(yàn)的研究過程，筆者對(duì)不同破壞條件進(jìn)行了摸索，對(duì)不同濃度的酸、堿、過氧化物溶液以及不同溫度下制劑的破壞情況進(jìn)行了研究，如制劑在 2、1、0.8和 0.2 mol·L-1鹽酸及氫氧化鈉的濃度進(jìn)行10 min、20 min、30 min、1 h、2 h的破壞，在30%、20%、10%、5% H2O2溶液進(jìn)行10、20、30 min的破壞，在80、90、100、110℃溫度下進(jìn)行30 min、1 h、2 h、3 h的破壞等。研究結(jié)果顯示，硫酸頭孢喹肟乳房注入劑經(jīng)過 30 min 10% H2O2溶液破壞后，主成分降解率為30%；經(jīng)過4 h 0.2 mol·L-1的酸、堿溶液破壞后，主成分降解率為10%左右；經(jīng)過90℃高溫破壞1 h后，主成分的降解率為20%左右，滿足《獸用化學(xué)藥物雜質(zhì)研究技術(shù)指導(dǎo)原則》的要求。由試驗(yàn)結(jié)果可發(fā)現(xiàn)硫酸頭孢喹肟乳房注入劑對(duì)氧化物敏感，而較耐酸堿。破壞后雜質(zhì)數(shù)量及含量均有增加，說明該檢查方法具有較強(qiáng)的專屬性。

根據(jù)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，本產(chǎn)品水分含量不得超過0.2%。在實(shí)際檢測(cè)過程中發(fā)現(xiàn)，密封性較差的樣品可能由于受潮而存在有關(guān)物質(zhì)含量較高的情況。而試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)樣品溶液放置超過2 h后，有關(guān)物質(zhì)含量也有上升趨勢(shì)，因此筆者考慮可能由于制劑水分的原因會(huì)直接引起有關(guān)物質(zhì)含量的增加，期望更深入的試驗(yàn)探究水分對(duì)有關(guān)物質(zhì)含量的影響。

本試驗(yàn)建立了HPLC法測(cè)定硫酸頭孢喹肟乳房注入劑的有關(guān)物質(zhì)，該方法快捷，在已知結(jié)構(gòu)的反相色譜有關(guān)物質(zhì)檢測(cè)中，HPCL法是經(jīng)濟(jì)適用、高效分離、準(zhǔn)確定量的研究方法。而TLC（薄層分析法）多適用于正相色譜有關(guān)物質(zhì)的分析，GC（氣相色譜法）多用來(lái)分析可氣化且具備熱穩(wěn)定性的藥物分析，CE（毛細(xì)管電泳法）主要用來(lái)分析離子化藥物且具有分離程度高，簡(jiǎn)單高效等優(yōu)勢(shì)，但其自身穩(wěn)定性較差。綜上分析，在硫酸頭孢喹肟乳房注入劑有關(guān)物質(zhì)分析初期，筆者首選HPLC法對(duì)其進(jìn)行研究分析。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)參考硫酸頭孢喹肟注射液獸藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)以及文獻(xiàn)中針對(duì)有關(guān)物質(zhì)的檢測(cè)方法，建立了硫酸頭孢喹肟乳房注入劑中有關(guān)物質(zhì)的檢測(cè)方法。試驗(yàn)結(jié)果證明本方法靈敏度高，簡(jiǎn)單高效，專屬性強(qiáng)，可用于硫酸頭孢喹肟乳房注入劑有關(guān)物質(zhì)考察。

References

［1］ 高金興. 頭孢喹肟在牛奶中殘留的HPLC檢測(cè)及消除規(guī)律研究［D］.揚(yáng)州： 揚(yáng)州大學(xué)， 2009. GAO J X. Determination of cefquinome residues by HPLC and its residue depletion in milk［D］. Yangzhou： Yangzhou University， 2009. （in Chinese）

［2］ BOTTNER A， SCHMID P， HUMKE R. In vitro efficacy of cefquinome （INN） and other anti-infective drugs against bovine bacterial isolates from Belgium， France， Germany， the Netherlands，and the United Kingdom. ZentralbI Veterinarmed B， 1995， 42（6）：377-383.

［3］ SUHREN G， KNAPPSTEIN K. Detection of cefquinome in milk by liquid chromatography and screening methods. Analytica Chimica Acta， 2003， 483（1）： 363-372.

［4］ 杜向黨， 李新生， 吳寧鵬， 張素梅. 頭孢喹諾的最新研究進(jìn)展. 中國(guó)畜牧獸醫(yī)， 2006， 33（9）： 15-17. DU X D， LI X S， WU N P， ZHANG S M. The new research advance of cefquinome. China Animal Husbandry & Veterinary Medicine，2006， 33（9）： 15-17. （in Chinese）

［5］ 陳道新， 張超， 潘益. 硫酸頭孢喹肟的合成. 中國(guó)醫(yī)藥工程雜質(zhì)，2014， 45（8）： 708-710. CHEN D X， ZHANG C， PAN Y. Synthesis of cefquinome sulfate. Chinese Journal of Pharmaceuticals， 2014， 45（8）： 708-710. （in Chinese）

［6］ 邵意陽(yáng)， 屈一新， 任慧. 硫酸頭孢喹肟的合成. 中國(guó)醫(yī)藥工程雜志，2007， 38（6）： 405-406. SHAO Y Y， QU Y X， REN H. Synthesis of cefquinome sulfate. Chinese Journal of Pharmaceuticals， 2007， 38（6）： 405-406. （in Chinese）

［7］ 李長(zhǎng)青， 閆祥華， 薛俊娟， 馬鳳龍， 喬彥良. 硫酸頭孢喹肟的合成.應(yīng)用化工， 2008， 37（2）： 231-232. LI C Q， YAN X H， XUE J J， MA F L， QIAO Y L. Synthesis of cefquinome sulfate. Applied Chemical Industry， 2008， 37（2）： 231-232. （in Chinese）

［8］ 楊美麗， 鄭國(guó)鈞. 硫酸頭孢喹肟的合成. 化學(xué)試劑， 2008， 30（10）：787-788. YANG M L， ZHENG G J. Synthesis of cefquinome sulfate. Chemical Reagents， 2008， 30（10）： 787-788. （in Chinese）

［9］ 劉美瑞， 趙地順， 劉寶樹， 劉林英， 汪學(xué)良， 李俊盼， 葛京京. 頭孢喹肟研究進(jìn)展. 中國(guó)畜牧獸醫(yī)， 2013， 40（4）： 216-220. LIU M R， ZHAO D S， LIU B S， LIU L Y， WANG X L， LI J P， GE J J. Research advance on cefquinome. China Animal Husbandry & Veterinary Medicine， 2013， 40（4）： 216-220. （in Chinese）

［10］ 農(nóng)業(yè)部獸藥評(píng)審中心. 獸用化學(xué)藥物雜質(zhì)研究技術(shù)指導(dǎo)原則［S］.北京： 化學(xué)工業(yè)出版社， 2012. China Institute of Veterinary Drugs Control. Technology Guiding Principle of The Study on Veterinary Chemical Impurities［S］. Beijing：Chemical Industry Press， 2012. （in Chinese）

［11］ 張玉琥. 仿制藥有關(guān)物質(zhì)研究的特點(diǎn)及研究思路. 中國(guó)執(zhí)業(yè)藥師，2010， 6（8）： 31-34. ZHANG Y H. The Characteristics and thoughts on the study of related substances in generic drugs. China Licensed Pharmacist， 2010， 6（8）：31-34. （in Chinese）

［12 ］ PRASADA RAJU V V N K V， REDDY G M， RAVINDRA V，MATHAD V T， REDDY P. Synthesis and spectral characterization of related substances of lacidipine， an antihypertensive drug. Synthetic Communications， 2009， 39（12）： 2137-2145

［13］ QIU F H， DANIEL L N. Identification of pharmaceutical impurities. Journal of Liquid Chromatography & Related Technologies， 2007，30（5/7）： 877-935.

［14］ YANG M， RICHARD T， YI H， GENE H. Characterization and control of impurities in the synthesis of an amino acid drug candidate. Journal of Liquid Chromatography & Related Technologies， 2007， 29（3）：365-375.

［15］ SMIRNOVA T A， GAVRILOV M Y， VOSEKOVA L P， NAZMETDINOV F Y， KOLLA V E. Synthesis and pharmacological activity of isopropylamides of 2-arylamino-5， 6， 7， 8-tetrahydroquinoline- 4-carboxylic acids. Pharmaceutical Chemistry Journal， 1997， 31（3）：134-136.

［16］ SMIRNOVA T A， GAVRILOV M Y， NAZMETDINOV F Y， KOLLA V E， KON`SHIN M E. Synthesis and antidepressant activity of acylhydrazides of 2-chloroand 2-anilino-5， 6， 7， 8-tetrahydroquinoline-4-carboxylic acids. Pharmaceutical Chemistry Journal， 1999， 33（7）：370-371.

［17］ 金翔飛， 沈衛(wèi)陽(yáng)， 黨柱， 宮旭， 柯夢(mèng)云， 王歡歡. 藥物中有關(guān)物質(zhì)的色譜分析研究近況. 藥學(xué)進(jìn)展， 2009， 33（12）： 542-548. JIN X F， SHEN W Y， DANG Z， GONG X， KE M Y， WANG H H. Recent process in studies on chromatographic method for analysis of the ralated impurities in drugs. Process in Pharmaceutical Sciences，2009， 33（12）： 542-548. （in Chinese）

［18］ RAJU T S， KALYANARAMAN L， REDDY V V， SWAMY Y P. Development and validation of an UPLC method for the rapid separation of positional isomers and potenial impurities of rivastigmine hydrogen tartrate in drug substance and drug product. Journal of Liquid Chromatography & Related Technologies， 2012， 35（7）： 896-911. ［19］ KADIVAR M H， SINHA P K， PIJUSH J， HITESH S， ATUL B. Study of impurity carryover and impurity profile in febuxostat drug substance by LC-MS/MS technique. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis， 2011， 56（4）： 749-757.

［20］ SATYANARAYANA K， SRINIVAS K， HIMABINDU V， REDDY G M. Impurity profile study of dutasteride. Pharmazie Die， 2007， 62（10）：743-746.

［21］ Ghassempour A， Rafati H， Adlnasab L， Bashour Y， Ebrahimzadeh H，Erfan M. Investigation of the solid state properties of amoxicillin trihydrate and the effect of powder PH. Aaps PharmSciTech， 2007，8（4）： 91-96.

［22］ CHEN Y W， LIU Y， NOVAK T， FREY L， CAMPOS K， KLAPARS A，CHEN C Y， PHENIX B. Identification and structural elucidation of process impurities generated in the end-game synthesis of taranabant （MK-0364）via cyanuric chloride. Journal of Pharmaceutical & Biomedical Analysis， 2009， 49（3）： 702-710.

［23］ STOLARCZYK E U， KUTNER A. Use of hyphenated LC-MS/MS technique for characterization of impurity profile of quetiapine during drug development. Acta Poloniae Pharmaceutica， 2010， 67（6）： 599-608.

［24］ RAO R N， RAJU A N， NARSIMHA R. Isolation and characterization of process related impurities and degradation products of bicalutamide and development of RP-HPLC method for impurity profile study. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis， 2008， 46（3）：505-519.

［25］ FDA. Quality by design （QbD） for a modified release dosage form ［EB/OL］. （2011-12） ［2015-11］. http：//www.fda.gov/downloads/Drugs/ DevelopmentApprovalProcess/HowDrugsareDevelopedandApproved/ ApprovalApplications/AbbreviatedNewDrugApplicationANDAGeneric s/UCM286595. pdf

［26］ 農(nóng)業(yè)部獸藥評(píng)審中心. 獸藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)匯編［S］. 北京： 中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社， 2012. China Institute of Veterinary Drugs Control. Veterinary Drug Quality Standard Assembly［S］. Beijing： China Agriculture Press， 2012. （in Chinese）

［27］ 謝沐風(fēng). 仿制藥研發(fā)中有關(guān)物質(zhì)研究思路之我見. 中國(guó)醫(yī)藥工程雜質(zhì)， 2013， 44（11）： 1174-1183. XIE M F. Some opinions on the studies of related substances in generic drugs. Chinese Journal of Pharmaceuticals， 2013， 44（11）：1174-1183. （in Chinese）

［28］ 鄧晶晶， 張春然， 唐克慧， 徐明琴， 王宇馳， 邱建軍. 反相高效液相色譜法測(cè)定頭孢美唑鈉中的有關(guān)物質(zhì). 中國(guó)新藥雜志， 2011，20（9）： 828-832. DENG J J， ZHANG C R， TANG K H， XU M Q， WANG Y C， QIU J J. Determination of the related substances in cefmetazole solium by RP-HPCL. Chinese Journal of New Drugs， 2011， 20（9）： 828-832. （in Chinese）

［29］ 樊后民， 王剛林. 高效液相色譜法測(cè)定頭孢噻吩鈉中的有關(guān)物質(zhì).中國(guó)藥房， 2005， 16（11）： 860-861. FAN H M， WANG G L. Determination of the related substances in Cefalotin by HPCL. China Pharmacy， 2005， 16（11）： 860-861. （in Chinese）

（責(zé)任編輯 林鑒非）

The Detection Methods of the Related Substances in Cefquinome Sulfate Intramammary Infusion

LIU Mao-lin1， LIU Yi-ming1， XU Fei1， ZHANG Dao-kang1， HUANG Hui-li1， LI Han2， LI Xiu-bo1
（1Feed Research Institute，Chinese Academy of Agricultural Sciences/National Reference Laboratory of Drug in Feeds， Beijing 100081；2Beijing Institute of Veterinary Drugs Control， Beijing 100107）

【Objective】 The detection methods of the related substances in cefquinome sulfate intramammary infusion were optimized by referencing the cefquinome sulfate injection in Veterinary Drug Quality Standard Assembly. A specific， sensitive，simple and rapid method was developed， which could be used to analyze the related substance in cefquinome sulfate intramammary infusion， effectively. And it will be useful for its quality control and process optimization. 【Method】 The instrument method was made by the pharmacopoeia requirements. The separation was performed on sodium perchlorate buffer （3.45 g NaClO4·H2O was dissolved in 1 000 mL water， mixed in 12 mL phosphoric acid and 115 mL acetonitrile， and adjusted pH to 3.6 with triethylamine） as the mobile phase at flow rate of 1.0 mL·min-1. The detection wave length was 270 nm and the injection amount of sample solution was 20 μL. The LOD and concentration of the related substance in cefquinome sulfate were estimated by HPLC area normalization method. The linearity， the RSD of injection precision and method precision were tested. For the specificity test， by using 0.2 mol·L-1HCL， 0.2 mol·L-1NaOH to destroy the drug for 4 h，using 10% H2O2to destroy the drug for 30 min and 90℃high temperature to destroy the drug for 1 h. The before and after destroyed samples were detected by HPLC after preparation. And the main-substances’ area， related-substances’ concentration， and their resolutions were contrasted with each other， and the number of the peak values of the impurities was also contrasted. 【Result】 After a series of dilutions of the cefquinome sulfate intramammary infusion， when the concerntration of the main component was at 7.5 μg·mL-1， the S/N of the related-substance was no less than 3， and through calculation of the LOD of the related substance was 0.05 μg·mL-1， and the RSD of injection precision and method precision of 100 μg·mL-1were 0.8% and 0.6%， respectively. The calibration curve of the related substances was a liner equation as y = 45935x-130.03 with a correlation coefficient of 1. The infusions were degraded by almost 10%， 10%， 30%，and 20% under the conditions of acid， alkali， an oxidizing agent， and high temperature， respectively. The retention time and resolution of cefquinome and related-substances were good， and the concentration and numbers of the impurities were added. After detecting the concentration of related substances of the 3 batches of cefquinome sulfate intramammary infusion， and calculated by HPLC method， it was found that the area of related substances were less than 2% of Cef， which met the the Quality Standards of Veterinary Drugs Provisions. 【Conclusion】 The method is simple and easy， selective and sensitive， which can be used to analyze the related substances in agents efficiently.

cefquinome sulfate intramammary infusion； related substance； HPLC method

2016-03-01；接受日期：2016-05-14

國(guó)家奶牛產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系北京市創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目、國(guó)家公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項(xiàng)（201303038）、中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金項(xiàng)目（2015YWF-ZD-25）

聯(lián)系方式：劉茂林，E-mail：lmlcaas@foxmail.com。劉義明，E-mail：liuyiming@caas.cn。劉茂林和劉義明為同等貢獻(xiàn)作者。通信作者李秀波，E-mail：lixiubo@caas.cn