金連豆，李曉艷*，王曉輝，遲乃玉，張慶芳，張旭姣，王　強

（1.大連大學 生命科學與技術(shù)學院，遼寧 大連 116622；2.遼寧省海洋微生物工程技術(shù)研究中心，遼寧 大連 116622）

海洋膠紅酵母菌CD-008產(chǎn)超氧化物歧化酶發(fā)酵條件優(yōu)化及酶分離純化

金連豆1，2，李曉艷1，2*，王曉輝1，2，遲乃玉1，2，張慶芳1，2，張旭姣1，2，王強1，2

（1.大連大學 生命科學與技術(shù)學院，遼寧 大連 116622；2.遼寧省海洋微生物工程技術(shù)研究中心，遼寧 大連 116622）

在單因素試驗基礎上，結(jié)合Plackett-Burman、Box-Behnken設計及響應面分析法進行回歸分析以確定海洋膠紅酵母菌Rhodotorulasp.CD-008產(chǎn)超氧化物歧化酶最佳發(fā)酵條件，并通過鹽析、超濾離心、Sephadex G-100凝膠過濾層析研究了酶的分離純化條件。結(jié)果表明，pH、轉(zhuǎn)速、溫度對酶活力有顯著影響，最優(yōu)發(fā)酵條件為pH 5.34、轉(zhuǎn)速150 r/min、溫度21.40℃，優(yōu)化后發(fā)酵液酶活力達到6 430.52 U/g濕菌體，比優(yōu)化前提高了1.53倍。粗酶液經(jīng)65%飽和度的硫酸銨鹽析、超濾離心、Sephadex G-100凝膠過濾層析后獲得的SOD比酶活達到419.90 U/mg，純化倍數(shù)為9.60倍，蛋白回收率為8.2%。SDS-PAGE凝膠電泳顯示，純化后的SOD的分子質(zhì)量約為37.5 ku。

海洋膠紅酵母菌CD-008；超氧化物歧化酶；發(fā)酵條件；分離純化

超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）是一類廣泛存在于生物體內(nèi)的酸性金屬酶，能夠?qū)Ｒ坏厝コ茐捏w內(nèi)新陳代謝的超氧陰離子，被稱為“人體垃圾的清道夫”［1］。超氧化物歧化酶不僅在體內(nèi)氧化與抗氧化平衡過程中起到重要作用，在腫瘤的檢測研究中也得到應用，如SOD mRNA的表達含量可以作為判定乳腺浸潤性導管癌治愈的指標［2］；在疾病的治療、輻射的防護過程中，SOD還可以清除體內(nèi)多余的超氧陰離子自由基（O2－·），進而保護NO活性，調(diào)節(jié)血管中血壓，從而保持血管血流暢通［3］，以及在提高植物抗逆性等方面研究已經(jīng)達到較高的水平，姚冉等［4］已成功克隆得到可以提高煙草對鹽脅迫耐受性的SOD基因。目前，SOD作為抗氧化劑也成功地進軍到醫(yī)藥、食品、化妝品等各大行業(yè)中，成為學者們爭相研究的熱門酶類之一［5］。

自1997年從牛血中提取到SOD，引起交叉感染后，歐盟法令規(guī)定，禁止從動物中提取SOD，因此，SOD的大部分來源便轉(zhuǎn)移到植物，但植物提取SOD工藝極為復雜，而微生物發(fā)酵法的興起則大大拓展了SOD來源，既方便又快捷。迄今為止，人們已經(jīng)成功從細菌、霉菌、放線菌、酵母菌等微生物體內(nèi)分離得到了SOD，根據(jù)所含金屬輔基的不同，SOD可分為主要存在于真核細胞質(zhì)中的Cu/Zn-SOD；原核及真核細胞基質(zhì)中的Mn-SOD；原核細胞、真核藻類和高等植物中的Fe-SOD以及近來從灰色鏈霉菌（Streptomyces griseus）及天藍色鏈霉菌（Streptomyces coelicolor）中的Ni-SOD［6］、朱秀敏等［7-8］在牛肝中發(fā)現(xiàn)了Co-SOD和一種存在于細胞外體液的SOD（EC-SOD）。張博潤等［9］經(jīng)培養(yǎng)條件優(yōu)化后，成功選育出SOD產(chǎn)量可達2 075 U/g濕菌體的酵母菌ZDF48，遲乃玉等［10］也運用理化條件復合誘變，選育出SOD產(chǎn)量達到9100U/g濕菌體的乳酸菌Sn-898，邢德明等［11］通過優(yōu)化培養(yǎng)基條件，培育出SOD含量高達4 206 U/g的乳酸菌SD06S，鄭洲等［12］也分離出四株產(chǎn)SOD南極嗜冷菌（Marinomonassp.）NJ062、NJ379、NJ522和NJ548。

微生物生產(chǎn)工業(yè)上應用的SOD菌株產(chǎn)酶量不高，可以通過優(yōu)化菌株產(chǎn)酶條件來提高產(chǎn)酶量。所以，研究菌株產(chǎn)酶條件就顯得極為重要。本研究采用Plackett-Burman（P-B）法設計試驗，結(jié)合Box-Behnken（B-B）設計和響應面法（response surface methodology，RSM）以及運用軟件Design-Expert對海洋膠紅酵母菌（Rhodotorulasp.）CD-008產(chǎn)超氧化物歧化酶的發(fā)酵條件進行優(yōu)化，以提高產(chǎn)酶量，并通過鹽析、超濾離心、Sephadex G-100凝膠過濾層析對SOD酶進行分離純化，為以后工業(yè)生產(chǎn)酶制劑奠定了科學基礎。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1菌株

海洋膠紅酵母菌（Rhodotorulasp.）CD-008分離自渤海海泥（123°371′E，39°6972′N）于遼寧省海洋微生物工程技術(shù)研究中心保藏。

1.1.2培養(yǎng)基

固體活化培養(yǎng)基：麥芽糖2.0%，酵母膏0.5%，蛋白胨1.0%，瓊脂2.0%，陳海水配制，pH自然。

液體發(fā)酵培養(yǎng)基：麥芽糖2.0%，酵母膏0.5%，CuSO40.08 mmol/L，由陳海水配制，pH自然。

1.1.3試劑

鄰苯三酚：上海展云化工有限公司；硫酸銨：天津市科密歐化學試劑有限公司；葡聚糖凝膠G-100：沈陽市聯(lián)邦試劑廠；十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）：上海雙龍化學品廠；丙烯酰胺：云超化工有限公司。以上試劑均為分析純。

1.2儀器與設備

HZP-250全溫振蕩培養(yǎng)箱：上海精宏實驗設備有限公司；5417 R低溫冷凍離心機：德國Eppendorf公司；SCIENTZ-ⅡD超聲波細胞粉碎機：寧波新芝生物科技有限公司；UV-2102C紫外可見分光光度計：龍尼柯儀器有限公司；DYY-6C電泳儀：北京市六一儀器廠。

1.3方法

1.3.1菌種活化

在無菌條件下，將海洋膠紅酵母保藏菌種轉(zhuǎn)接到固體活化培養(yǎng)基中，22℃恒溫培養(yǎng)1～2 d，活化2次。

1.3.2粗酶液的制備

將活化好的菌株接種到液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，于22℃、150r/min發(fā)酵30h。發(fā)酵菌液于4℃、4000r/min離心30min，得到濕菌體，用超純水將菌體水洗2次，4℃、4 000 r/min離心30 min。將離心得到的濕菌體用磷酸緩沖液（pH7.8）溶解。于480 W超聲波冰浴下破碎30 min（破碎5 s，間隔5 s）。破碎后，4℃、10 000 r/min離心10 min，棄沉淀，留上清，即為粗酶液。

1.3.3SOD酶活力檢測

SOD酶活力的檢測采用鄰苯三酚自氧化法［13-14］。以1mL反應液于25℃，每分鐘抑制鄰苯三酚自氧化速度50%的用酶量定義為一個SOD酶活力單位（U/g濕菌體）。

1.3.4單因素試驗

為確定各種環(huán)境因素對酶活力的影響，分別以轉(zhuǎn)速（100 r/min、120 r/min、140 r/min、160 r/min、180 r/min）、裝液量（70mL/250mL、80mL/250mL、90mL/250mL、100mL/ 250 mL、110 mL/250 mL）、接種量（1%、2%、3%、4%、5%）、溫度（18℃、20℃、22℃、24℃、26℃）、pH（4.5、5.5、6.5、7.5、8.5）作為唯一變量，進行單因素篩選試驗，將最高酶活力設定為100%，其余用相對值表示?？疾炱鋵OD相對酶活的影響。

1.3.5發(fā)酵條件優(yōu)化

（1）Plackett-Burman試驗設計

在前期單因素試驗的基礎上，選擇5個因素進行12次試驗（N=12），用Design-Expert軟件進行試驗設計，根據(jù)結(jié)果對其進行顯著性分析。試驗中每個因素根據(jù)單因素試驗結(jié)果設定2個水平，Plackett-Burman試驗設計因素與水平如表1所示。

表1　Plackett-Burman試驗設計因素與水平Table 1 Factors and levels of Plackett-Burman experiments

（2）最陡爬坡試驗

根據(jù)Plackett-Burman試驗得出的顯著因素效應大小設定其步長，進行最陡爬坡試驗，找出酶活最高響應值的區(qū)域。

（3）Box-Behnken設計及響應面分析

根據(jù)Plackett-Burman試驗確定影響酶活的主要3個因素，最陡爬坡試驗獲得因素響應區(qū)域的中心點，采用Design-Expert軟件進行Box-Behnken設計，3因素3水平響應面的分析試驗因素與水平見表2。

表2　Box-Behnken試驗因素與水平Table 2 Factors and levels of Box-Behnken experiments

1.3.6SOD酶分離純化

將海洋膠紅酵母CD-008SOD粗酶液經(jīng)飽和度65%的硫酸銨4℃鹽析12 h后，用0.05 mol/L的磷酸緩沖液（pH 7.8）溶解沉淀蛋白，測定酶活，計算蛋白回收率；溶解后蛋白經(jīng)過預處理的（截留分子質(zhì)量10 ku）超濾管超濾，4℃，4000r/min離心30min，移液槍小心取出濃縮液，溶于（pH7.8）0.05 mol/L的磷酸緩沖液，測定酶活，計算蛋白回收率；取2 mL超濾后SOD酶液加入預先用pH 7.8 0.05 mol/L的磷酸緩沖液平衡過的Sephadex G-100凝膠過濾層析柱（1.6 cm× 100 cm），調(diào)節(jié)洗脫速度及蛋白自動收集器，每管收集2 mL，收集含SOD酶各管，測定其酶活力，合并含酶活力各管。

1.3.7檢測方法

（1）蛋白質(zhì)含量的測定

采用考馬斯亮藍法［15］，繪制蛋白標準曲線方程為y= 0.009 2x+0.020 4（R2=0.994 6），結(jié)合蛋白標準曲線方程測定蛋白質(zhì)含量。

（2）SOD分子質(zhì)量的測定

按照LAEMMLI U K等［16］的方法采用質(zhì)量分數(shù)為8%的分離膠和5%的濃縮膠進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodiumdodecylsulfatepolyacrylamidegelelectrophoresis，SDS-PAGE），電泳結(jié)束凝膠用考馬斯亮藍染色30 min后脫色，確定收集酶活洗脫液中蛋白條帶，以預染蛋白MarkerThermo26616為對照，考察并計算SOD的分子質(zhì)量。

2　結(jié)果與分析

2.1單因素試驗結(jié)果

考察轉(zhuǎn)速、裝液量、接種量、溫度和pH值對SOD相對酶活的影響，結(jié)果如圖1所示。

圖1　轉(zhuǎn)速（a）、裝液量（b）、接種量（c）、溫度（d）、pH（e）對SOD相對酶活的影響Fig.1 Effects of rotate speed（a），liquid volume（b），inoculum（c），temperature（d），pH（e）on SOD relative enzyme activity

由圖1可知，SOD相對酶活隨著轉(zhuǎn)速、裝液量、接種量、溫度和pH值的增加均呈先升高后降低的趨勢。SOD相對酶活分別在轉(zhuǎn)速140 r/min、裝液量90 mL/250 mL、接種量3%、溫度22℃、pH 5.5時到達最大值，因此以此最適發(fā)酵條件進行下一步研究。

2.2發(fā)酵條件優(yōu)化試驗設計和分析

2.2.1Plackett-Burman試驗設計

根據(jù)單因素試驗選取對菌株SOD相對酶活力具有顯著影響的5個因素，以菌株Rhodotorulasp.CD-008粗酶液的SOD酶活力（Y）作為響應值，選取N=12，進行P-B設計，分別計算各因素的效應，并對其進行顯著性評價，結(jié)果見表3。

由表3的分析結(jié)果可知，A、B、C、D、E各因素的效應值分別為-414.3、263.8、-448.4、-370.1、521.0，由P值的大小可知，各因素對SOD酶活力影響重要性排序為E＞C=A＞D＞B，即pH＞轉(zhuǎn)速=溫度＞裝液量＞接種量，綜合考慮選取pH、轉(zhuǎn)速和溫度作為下一步響應面設計的主要影響因素。其余因素選值根據(jù)各自效應值的正負及大小來確定，正效應取其較大值，負效應取其較小值。

表3　Plackett-Burman試驗顯著性分析Table 3 Significance analysis of Plackett-Burman experiments

2.2.2最陡爬坡試驗

根據(jù)Plackett-Burman試驗結(jié)果選取3個重要因子，即pH、轉(zhuǎn)速和溫度來設計顯著因素的最陡爬坡路徑及步長，最陡爬坡試驗設計及結(jié)果見表4。由表4可知，隨著3個顯著因素的變化，菌株發(fā)酵粗酶液的酶活力在pH 5.5、轉(zhuǎn)速140 r/min和溫度22℃出現(xiàn)最高值，故選擇此條件作為響應面的設計中心。

表4　最陡爬坡試驗設計及結(jié)果Table 4 Design and results of the steepest ascent path experiments

2.2.3Box-Behnken設計及結(jié)果

根據(jù)最陡爬坡試驗確定影響菌株Rhodotorulasp. CD-008產(chǎn)酶的顯著因素及各自的取值，進行Box-Behnken試驗設計，Box-Behnken試驗設計與結(jié)果見表5，回歸模型方差分析見表6。

運用Design-Expert8.6.0.1軟件對表5中的數(shù)據(jù)進行回歸分析，得到SOD酶活力（Y）和發(fā)酵條件的二次回歸模型方程如下：

由表6可知，除X1X3項外，X1X3和對SOD酶活力具有顯著影響（P＜0.05），其他項對SOD酶活力均具有極其顯著影響（P＜0.001），說明轉(zhuǎn)速與pH和溫度交互項對酶活有顯著性影響，而pH與溫度交互項對酶活沒有顯著性影響。回歸模型的決定系數(shù)R2=0.9974，校正決定系數(shù)說明該模型只有0.72%的變異不能由該模型解釋，因此，該模型的擬合性較好。模型P值（＜0.000 1）遠遠＜0.001，說明該模型是極其顯著的，失擬項數(shù)值為0.097 3＞0.05說明失擬不顯著，模型穩(wěn)定，設計可靠，可用于菌株Rhodotorula sp.CD-008酶活的分析與預測。通過回歸模型方程構(gòu)建pH、轉(zhuǎn)速和溫度對菌株Rhodotorulasp.CD-008產(chǎn)SOD酶活力影響的響應曲面和等高線結(jié)果見圖2。

表5　Box-Behnken試驗設計與結(jié)果Table 5 Design and results of the Box-Behnken experiments

表6　回歸方程的方差分析Tabble 6 Variance analysis of regression equation

由圖2可以較直觀地看出曲面圖為橢圓形或馬鞍形，說明3因素兩兩之間的交互作用對酶活的影響情況［17-18］，根據(jù)Design-Expert軟件進行分析，可得其最佳發(fā)酵條件為pH 5.34、轉(zhuǎn)速150 r/min、溫度21.37℃。初始發(fā)酵條件下粗酶液的酶活力為4 189.58 U/g濕菌體，在此條件下，粗酶液的酶活力為6 430.52 U/g濕菌體，是優(yōu)化前酶活的1.53倍。并且優(yōu)化后粗酶液酶活力的測定值與預測值6 348.66 U/g濕菌體非常接近，說明模型的設計是合理有效的。

圖2　pH、轉(zhuǎn)速與溫度交互作用對SOD酶活力影響的響應曲面和等高線Fig.2 Response surface plots and contour line of effects of interaction between pH，rotate speed and temperature on SOD enzyme activity

2.3SOD分離純化結(jié)果

2.3.1SOD分離純化結(jié)果

經(jīng)65%硫酸銨鹽析、超濾離心和SephadexG-100凝膠過濾層析后，SOD的純化結(jié)果見表7。由表7可知，Rhodotorulasp. CD-008 SOD酶發(fā)酵粗酶液經(jīng)鹽析、超濾離心和層析后，SOD的比酶活達到419.90 U/mg，蛋白回收率為8.2%，純化倍數(shù)為9.60。

表7　Rhodotorulasp.CD-008 SOD的純化結(jié)果Table 7 Purification results ofRhodotorulasp.CD-008 SOD

2.3.2SOD分子質(zhì)量的測定結(jié)果

圖3　SOD的SDS-PAGE電泳圖Fig.3 SDS-PAGE electrophoretogram of SOD

提純后的SOD SDS-PAGE凝膠電泳圖譜見圖3。由圖3可知，SDS-PAGE凝膠電泳顯示純化后的SOD酶為單一條帶，分子質(zhì)量約為37.5 ku，據(jù)何獻君等［19］研究報道，Cu/Zn SOD的分子質(zhì)量在32～65 ku之間，推斷該SOD類型可能為Cu/Zn SOD。

3　結(jié)論

本研究采用Box-Behnken試驗設計，對Rhodotorulasp. CD-008產(chǎn)超氧化物歧化酶的發(fā)酵條件進行了優(yōu)化，經(jīng)軟件Design-Expert分析，結(jié)果表明，最優(yōu)發(fā)酵條件為pH 5.34、轉(zhuǎn)速150 r/min、溫度21.40℃，在此最優(yōu)條件下，SOD酶活力為6 430.52 U/g濕菌體比優(yōu)化前提高了1.53倍。孫怡等［20］篩選出兩株產(chǎn)SOD乳酸菌菌株L-7、L-9，經(jīng)優(yōu)化后SOD酶活分別達到3 361.2U/g和3 389.7 U/g；丁琳等［21-22］分別選育出高產(chǎn)SOD的枯草芽孢桿菌，酶活達2 186 U/g濕菌體、3 439.3 U/g濕菌體，據(jù)文獻報道，真核生物中的SOD含量遠遠高于原核生物的SOD含量［23-24］，而本研究優(yōu)化膠紅酵母CD-008產(chǎn)SOD發(fā)酵條件后，酶活達6 430.52 U/g濕菌體，也驗證了這一說法。

Rhodotorulasp.CD-008發(fā)酵粗酶液經(jīng)過飽和度65%硫酸銨鹽析、超濾離心、SephadexG-100凝膠過濾層析等純化步驟，得到的SOD比酶活達到419.90 U/mg，純化倍數(shù)為9.60倍，蛋白回收率為8.2%。SDS-PAGE凝膠電泳顯示純化后的SOD為單一條帶，分子質(zhì)量約為37.5 ku，推斷可能為Cu/Zn SOD。本研究中，對膠紅酵母Rhodotorulasp. CD-008進行發(fā)酵條件優(yōu)化，為SOD的生產(chǎn)增添了新的途徑，對于抗癌、抗炎藥物的合成，食品添加，化妝品添加等各行業(yè)的應用，均具有廣泛而深遠的意義。同時也為該菌超氧化物歧化酶的酶學性質(zhì)，分子水平誘變以及工業(yè)深層發(fā)酵、基因序列、氨基酸序列等進一步深入研究奠定基礎。

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Optimization of fermentation conditions of SOD-producingRhodotorulasp. CD-008 and separation and purification of the SOD

JIN Liandou1，2，LI Xiaoyan1，2*，WANG Xiaohui1，2，CHI Naiyu1，2，ZHANG Qingfang1，2，ZHANG Xujiao1，2，WANG Qiang1，2
（1.School of Life Science and Biotechnology，Dalian University，Dalian 116622，China；2.Liaoning Marine Microbial Engineering and Technology Center，Dalian 116622，China）

On the basis of single factor experiments，the optimum fermentation conditions of SOD-producingRhodotorulasp.CD-008 were determined by Plackett-Burman，Box-Behnken design and response surface analysis，and the separation and purification conditions of SOD were research by salting out，ultrafiltration centrifugation and Sephadex G-100 gel filtration chromatography.Results indicated that pH，rotate speed and temperature had a significant effect on enzyme activity.The optimum fermentation conditions was pH 5.34，rotate speed 150 r/min and temperature 21.40℃. Under the conditions，the enzyme activity in fermentation liquor was 6 430.52 U/g fresh cells，which was 1.53 times higher than that before optimization.The crude enzyme liquid was purified by ammonium sulfate with degree of saturation 65%，ultrafiltration centrifugation and Sephadex G-100 gel filtration chromatography，specific enzyme activity of SOD obtained was 419.90 U/mg，purification fold was 9.60 and protein recovery rate was 8.2%.SDS-PAGE electrophoresis showed that molecular weight of SOD purified was about 37.5 ku.

Rhodotorulasp.CD-008；superoxide dismutase；fermentation conditions；separation and purification

Q936

0254-5071（2016）03-0017-06

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.03.005

2015-12-27

國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃（863計劃）項目（2014AA093512）

金連豆（1991-），女，碩士研究生，研究方向為微生物與酶工程。

李曉艷（1972-），女，講師，碩士，研究方向為微生物工程應用技術(shù)開發(fā)。