沈如凌， 石嘉豪， 盛哲津， 馮曉龍， 吳文婷， 費 儉（.同濟大學生命科學與技術(shù)學院， 上海 0009； .上海南方模式生物研究中心， 上海 00）

Rag1、Rag2 基因缺陷小鼠的構(gòu)建及在異種腫瘤移植中的應用

沈如凌1，2， 石嘉豪1， 盛哲津1， 馮曉龍2， 吳文婷2， 費 儉1，2
（1.同濟大學生命科學與技術(shù)學院， 上海 200092； 2.上海南方模式生物研究中心， 上海 201210）

目的 建立重組激活基因， Rag1和Rag2基因缺陷小鼠模型，并對其表型和異種腫瘤移植的成瘤性進行分析。方法 通過傳統(tǒng)的胚胎干細胞（ES）細胞打靶、囊胚注射方式，分別構(gòu)建Rag1 和Rag2基因缺陷小鼠模型； 通過流式細胞術(shù)對缺陷小鼠外周血T/B淋巴細胞含量進行檢測； 通過外源異種腫瘤細胞移植實驗，對移植腫瘤細胞的成瘤性進行評價。結(jié)果 建立了Rag1和Rag2基因缺陷小鼠模型， 兩種基因突變純合子小鼠模型外周血中T、B淋巴細胞含量較野生型小鼠顯著降低； 人源腫瘤細胞A549在上述兩種基因突變純合子小鼠中較BALB/c-nu （裸小鼠）或（NOD-SCID）非肥胖糖尿病/重癥聯(lián)合免疫缺陷小鼠表現(xiàn)出更強的成瘤性。結(jié)論 分別成功建立了Rag1和Rag2基因缺陷小鼠模型，兩種小鼠模型均發(fā)生了T、B淋巴細胞生成障礙，導致免疫系統(tǒng)嚴重缺陷，可作為異種外源腫瘤移植的受體，用于小鼠荷瘤模型的建立。

重組激活基因（Rag1基因）； Rag2基因； 基因缺陷； 免疫缺陷

重組激活基因（recombination-activating genes，Rags）在V（D）J重組過程中發(fā)揮重要作用［1］， V（D）J重組過程中發(fā)生的免疫球蛋白（Ig）基因和T細胞受體（TCR）基因的重排和重組是B細胞和T淋巴細胞成熟過程中的必需階段。小鼠的兩個重組激活基因Rag1和Rag2均位于2號染色體，其編碼的Rag1和Rag2蛋白在成熟前T細胞發(fā)育成為成熟T細胞以及成熟前B細胞發(fā)育成為成熟B細胞的過程中，通過識別Ig或TCR基因，并結(jié)合基因片段中的重組信號序列（RSS），啟動V（D）J重組［2-4］。Rag1和Rag2在淋巴細胞V（D）J重排過程中缺一不可［5，6］，任意一個缺失都會導致T、B淋巴細胞發(fā)育中斷，表現(xiàn)為嚴重的T/B細胞早期發(fā)育阻滯，T細胞停滯在CD3-CD4-CD8-CD25+階段［7］，B細胞停滯在B220-CD43+IgM-階段［8，9］，進而不能產(chǎn)生成熟的T、B淋巴細胞。因外周血中沒有成熟T/B淋巴細胞，導致機體產(chǎn)生與人“重癥聯(lián)合免疫缺陷癥”（severe combined immunodeficiency， SCID）類似的癥狀［10］。

Rag1或者Rag2基因缺陷的小鼠外觀發(fā)育正常，具有正常生殖能力，但由于不能產(chǎn)生T、B淋巴細胞［11，12］，無法對異體來源的細胞產(chǎn)生異體排斥， 因而可以作為移植瘤模型的載體［13，14］。目前常用的小鼠荷瘤模型實驗動物主要包括BALB/c裸小鼠和SCID小鼠系列［14］。美國Jackson Lab實驗室已有缺失Rag1或Rag2基因的純合子小鼠提供［14］，但國內(nèi)并沒有構(gòu)建該品系小鼠的報道及相關(guān)產(chǎn)品供應，也沒有對該小鼠的成瘤性進行過評價。本實驗室利用基因工程的方法構(gòu)建了C57BL/6J×129S1背景的Rag1基因突變純合子小鼠（Rag1-/-）和Rag2基因突變純合子小鼠（Rag2-/-），并驗證了兩種小鼠模型的T/B細胞缺失情況以及人源腫瘤細胞在這兩種小鼠上的成瘤效果，從而證明本實驗室構(gòu)建的Rag1和Rag2基因突變純合子小鼠與已報道的其他Rag1和Rag2基因敲除小鼠模型［11，12］具有相同的表型，與其他常用小鼠荷瘤模型一樣，可以作為荷瘤模型受體應用于腫瘤學、免疫學、藥品與生物制品的安全性評價及藥物篩選等領(lǐng)域中，也為國內(nèi)的科研工作者提供了更多的品系選擇。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及細胞

C57BL/6J小鼠由上海南方模式生物科技發(fā)展有限公司提供［SCXK（滬） 2014-0002］； BALB/c裸小鼠和NOD-SCID小鼠購自上海斯萊克實驗動物有限公司［SCXK（滬）2012-0002］。ES細胞來源于C57BL/6J ×129S1小鼠，由上海南方模式生物科技發(fā)展有限公司建系并保存，非小細胞肺癌A549細胞系購自中國科學院上海生命科學研究院細胞庫。

1.2 質(zhì)粒和菌株

含Rag1和Rag2基因的細菌人工染色體（BAC）（129小鼠品系）購于Source Bioscience Ltd.， BAC號分別為： bMQ176c08和bMQ176c08； 質(zhì)粒PL-451、PL-452，菌株EL-350由Liu Pengtao（英國劍橋Wellcome Trust Sanger Institute）惠贈。pSC101-BAD-γβα-A-tet由張友明（德國Gene Bridges GmbH）惠贈。D-H5α為博大泰克產(chǎn)品。pBR322-MK為上海南方模式生物科技發(fā)展有限公司改建。

1.3 主要試劑

胚胎干細胞（ES）細胞培養(yǎng)所需的DMEM培養(yǎng)基（高糖， ES細胞級）、胎牛血清（ES細胞級）、G418、更昔洛韋、LIF、青鏈霉素、胰蛋白酶等分別購自Gibco BRL公司（美國）、Sigma公司（美國）、Chemicon公司（美國）； A549細胞培養(yǎng)所用F12 NUTRIENT MIX-KAIGHNS MOD培養(yǎng)基和胎牛血清購自Invitrogen公司（美國）； PBS和疊氮鈉購自碧云天（中國）， APC標記大鼠抗小鼠CD19和PE標記大鼠抗小鼠CD3e購自BD pharmagen （美國）； 各種限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、T4 DNA polymerase、Taq酶及PCR相關(guān)試劑購自TaKaRa公司（日本）； L-阿拉伯糖、鹽酸、四環(huán)素等常規(guī)化學試劑主要購自Sigma （美國）和上?；瘜W試劑公司（中國）； DNA凝膠回收Kit購自索萊寶科技有限公司（中國）。

1.4 小鼠模型構(gòu)建

運用ET克隆的方法構(gòu)建Rag1和Rag2定點敲入打靶載體。大致過程如下： 以BAC為模板擴增獲得Retrieve， 用小同源臂A、B、C、D臂， 將A臂和B臂克隆至pBR322-2S質(zhì)粒的HindIII & KpnI酶切位點， 獲得Retrieve質(zhì)粒， 利用該質(zhì)粒和BAC克隆，通過細菌內(nèi)同源重組方式，獲得A區(qū)域到B區(qū)域之間包含有5'和3'同源臂的DNA片段的質(zhì)粒； 將loxp-EGFP-PolyA-loxp序列克隆至PL451的EcoRV位點，將C同源臂克隆至loxp-EGFP-PolyA-loxp序列的上游，將D同源臂克隆至FRT-Neo-FRT下游位點，該質(zhì)粒經(jīng)KpnI/NotI雙酶切后，分離獲得含C-loxp-EGFP-PolyA-loxp-FRT-Neo-FRT-loxp-D片斷，然后經(jīng)過細菌內(nèi)同源重組敲入到上述獲得的Retrieve質(zhì)粒中，分別構(gòu)建獲得打靶載體pBR322-MK-Rag1和pBR322-MK-Rag2，并經(jīng)酶切和測序驗證正確。打靶載體經(jīng)線性化后通過電轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)入ES細胞，通過G418和更昔洛韋抗性篩選獲得抗性克隆，抗性克隆經(jīng)過PCR鑒定及測序確認獲得重組陽性ES細胞克隆。Rag1 敲入陽性ES細胞克隆鑒定策略及4條PCR鑒定引物I， II， III， IV位置如圖1箭形標記所示，序列分別為：

P1： 5'-TGCAACTGTGCGTTTCTTTC-3'；

P2： 5'-AAGTCGTGCTGCTTCATGTG-3'；

P3： 5'-TCGCCTTCTTGACGAGTTCT-3'；

P4： 5'-CGAAACGCTGTGAGTTGAAA-3'。

Rag2敲入陽性ES細胞克隆鑒定策略及4條PCR鑒定引物I， II， III， IV位置如圖2箭形標記所示，序列分別為：

P1： 5'-CCATGGGCGTACTTGCTATT-3'；

P2： 5'-GAACTTCAGGGTCAGCTTGC-3'；

P3： 5'-TCGCCTTCTTGACGAGTTCT-3'；

P4： 5'-GGGGTGAACCATTGATTTTG-3'。

將ES細胞擴增后， 經(jīng)囊胚注射到C57BL/6J小鼠囊胚中發(fā)育獲得嵌合鼠， 嵌合鼠與C57BL/6J野生型小鼠交配， 分別獲得穩(wěn)定遺傳的Rag1和Rag2敲入小鼠。Rag1和Rag2小鼠模型構(gòu)建完成后，通過雜合子交配分別獲得Rag1、Rag2基因缺陷純合子小鼠模型。Rag1基因缺陷小鼠基因型鑒定引物序列為：

P1： 5'-GCGATACGCTATTGATACTTT-3'；

P2： 5'-TTGTACTCCAGCTTGTGCC-3'；

P3： 5'-GCTCGTTGAGTCAGAATTGAG-3'。

野生型條帶大小為344 bp，Rag1基因缺陷陽性條帶大小為593 bp。Rag2基因缺陷小鼠基因型鑒定引物序列為：

P1： 5'-TCAAAGCAAAGCCAGTCCG-3'；

P2： 5'-TAGGTCAGGGTGGTCACGAGGG-3'；

P3： 5'-GACCCACTGTTACCATCTGC-3'。野生型條帶大小為267 bp，Rag2基因缺陷陽性條帶大小為485 bp。

1.5 外周血淋巴細胞流式細胞術(shù)（FACS）檢測

小鼠經(jīng)異氟烷麻醉， 眼球取血， 血樣加入等體積質(zhì)量分數(shù)0.9%NaCl稀釋； 血樣平鋪至淋巴細胞分離液面上， 離心取分離液層， 去除紅細胞后， PBS洗滌2次。將細胞重懸于染色緩沖液中（PBS+2%FBS +0.1% NaN3）， 熒光抗體［抗CD3e（PE標記）， 抗CD19 （APC標記）］對小鼠外周血淋巴細胞進行標記， 冰上避光孵育20 min， 染色緩沖液洗滌2次后按常規(guī)方法上流式細胞儀FACS Calibur（BD）檢測， CellQuest軟件分析樣品。每個樣品檢測收集10 000個細胞。

1.6 細胞培養(yǎng)

非小細胞肺癌A549細胞培養(yǎng)于含體積分數(shù)10%胎牛血清（青霉素100 U/mL，鏈霉素100 μg/mL）F12 NUTRIENT MIX- KAIGHNS MOD培養(yǎng)基中，待培養(yǎng)至一定數(shù)量后收集備用。

1.7 荷瘤小鼠模型建立

Rag1-/-小鼠，Rag2-/-小鼠，BALB/c裸小鼠，NOD-SCID小鼠和C57BL/6J小鼠，飼養(yǎng)于SPF級動物設施［SYXK（滬2012-002］， 每組各7只。收集對數(shù)生長期A549細胞， 將細胞濃度調(diào)整為5×107/mL，取100 μL接種于小鼠后腿右側(cè)皮下。接種當日記為第0日，每日觀察接種部位腫瘤生長情況，待觀察到腫瘤生長，每周2次用游標卡尺測量腫瘤長徑（D）和短徑（d），按照腫瘤體積V=（D×d2）/2計算腫瘤體積， 當小鼠腫瘤長至1 000 mm3時停止測量。

1.8 腫瘤組織病理學觀察

取小鼠皮下腫瘤部分組織固定于質(zhì)量分數(shù)4%中性甲醛溶液中，常規(guī)石蠟包埋、脫水、切片、HE染色后，鏡下觀察。

1.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)結(jié)果用GraphPad Prism6.0軟件進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)以x-± s表示，使用t檢驗方法統(tǒng)計并作圖，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 Rag1和Rag2基因缺陷小鼠構(gòu)建

Rag1基因缺陷小鼠的構(gòu)建策略如圖1A所示，通過ES細胞打靶同源重組的方式將loxp-EGFP-polyA-loxp-FRT-PGK-Neo-polyA-FRT-loxp片段定點插入到Rag1基因蛋白翻譯起始密碼子ATG的AT堿基之后。該片段的插入將破壞內(nèi)源Rag1基因的正常轉(zhuǎn)錄和蛋白翻譯，造成Rag1基因功能性缺失。構(gòu)建的Rag1同源重組載體經(jīng)線性化、ES細胞打靶和藥物壓力篩選后共獲得165個抗性克??； 經(jīng)PCR鑒定，共獲得5個正確同源重組的ES細胞克隆。ES細胞陽性克隆PCR鑒定策略和引物位置如圖1A所示； 5'和3'同源臂正確重組陽性克隆PCR鑒定結(jié)果代表性電泳圖如圖1B和C所示， 5'同源臂重組陽性克隆擴增獲得4.3 kb PCR產(chǎn)物條帶，陰性克隆無PCR產(chǎn)物； 3'同源臂重組陽性克隆擴增獲得3.2 kb PCR產(chǎn)物條帶，陰性克隆無PCR產(chǎn)物。通過ES細胞的囊胚注射和胚胎移植，2個陽性ES細胞克隆共注射40枚胚胎， 制作4只受體，獲得8只高度嵌合雄鼠。嵌合體雄鼠與野生型C57BL/6J小鼠交配，共獲得ES細胞來源的F1代小鼠14只，經(jīng)PCR鑒定其中7只為陽性雜合子小鼠，陽性雜合子小鼠5' 和3'同源臂PCR鑒定策略同ES細胞同源重組陽性克隆鑒定策略， 鑒定代表圖如圖1D和E所示。Rag1基因缺陷雜合子小鼠經(jīng)自交獲得Rag1基因缺陷純合子小鼠（Rag1-/-）， 小鼠基因型PCR鑒定電泳代表圖如圖1F所示（純合子小鼠PCR擴增獲得一條593 bp條帶； 雜合子小鼠PCR擴增獲得593 bp和344 bp兩條帶； 野生型小鼠PCR擴增獲得344 bp一條帶）。

Rag2基因缺陷小鼠的構(gòu)建策略如圖2A所示，通過ES細胞打靶同源重組的方式將loxp-EGFP-polyA-loxp-FRT-PGK-Neo-polyA-FRT-loxp片段定點插入到Rag2基因exon3蛋白翻譯起始密碼子ATG前10個堿基處。該片段的插入將破壞內(nèi)源Rag2基因的正常轉(zhuǎn)錄和蛋白翻譯，造成Rag2基因功能性缺失。構(gòu)建的Rag2同源重組載體經(jīng)線性化、ES細胞打靶和藥物壓力篩選后共獲得165個抗性克?。唤?jīng)PCR鑒定，共獲得10個正確同源重組的ES細胞克隆。ES細胞陽性克隆PCR鑒定策略和引物位置，如圖2A所示；5'和3'同源臂正確重組陽性克隆PCR鑒定結(jié)果代表性電泳圖如圖2B和2C所示，5'同源臂重組陽性克隆擴增獲得4.3 kb PCR產(chǎn)物條帶，陰性克隆無PCR產(chǎn)物； 3'同源臂重組陽性克隆擴增獲得3.4 kb PCR產(chǎn)物條帶，陰性克隆無PCR產(chǎn)物。通過ES細胞的囊胚注射和胚胎移植，2個陽性ES細胞克隆共注射168枚胚胎，制作14只受體， 獲得7只高度嵌合雄鼠。嵌合體雄鼠與野生型C57BL/6J小鼠交配，共獲得ES細胞來源的F1代小鼠33只，經(jīng)PCR鑒定其中13只為陽性雜合子小鼠，陽性雜合子小鼠5'和3'同源臂PCR鑒定策略同ES細胞同源重組陽性克隆鑒定策略，鑒定代表圖如圖2D和2E所示。Rag2基因缺陷雜合子小鼠經(jīng)自交獲得Rag2基因缺陷純合子小鼠（Rag2-/-）， 小鼠基因型PCR鑒定電泳代表圖如圖2F所示（純合子小鼠PCR擴增獲得一條485 bp條帶； 雜合子小鼠PCR擴增獲得485 bp和267 bp兩條帶； 野生型小鼠PCR擴增獲得267 bp一條帶）。

2.2 Rag1、Rag2基因缺失導致小鼠成熟T、B淋巴細胞缺失

通過流式細胞術(shù)對野生型C57BL/6J小鼠、NOD-SCID小鼠、Rag1-/-小鼠和Rag2-/-小鼠外周血中B細胞和T細胞的檢測結(jié)果表明： Rag1-/-小鼠和Rag2-/-小鼠中的T細胞和B細胞含量較野生型小鼠有顯著性降低（P＜0.0001， 圖3B）， T細胞和B細胞含量分別約為野生型的5%和25%； 較NOD-SCID小鼠雖然均值略有增高， 但無顯著性差異（P＞0.05， 圖3B）。

2.3 Rag1、Rag2基因缺失小鼠可作為異源移植腫瘤受體

圖1 Rag1基因缺陷小鼠構(gòu)建策略及鑒定結(jié)果

圖2 Rag2基因缺陷小鼠構(gòu)建策略及鑒定結(jié)果

圖3 4種小鼠外周血功能T、B淋巴細胞含量流式細胞術(shù)檢測結(jié)果

將異源腫瘤細胞分別移植到Rag1-/-小鼠、Rag2-/-小鼠、NOD-SCID小鼠、BALB/c裸小鼠和野生型C57BL/6J小鼠上， 觀察和比較腫瘤細胞移植后的生長。結(jié)果顯示， 在Rag1-/-和Rag2-/-背景小鼠上，移植腫瘤生長速度最快，且兩者之間無顯著性差異； 在NOD-SCID背景小鼠上的腫瘤生長速度次之； 然后是在BALB/c裸小鼠背景； 而在C57BL/6J小鼠上則無腫瘤生成（圖4A）。Rag1-/-和Rag2-/-小鼠上的腫瘤， 自腫瘤移植22 d后，顯著大于BALB/c裸小鼠和NOD-SCID小鼠上的腫瘤體積（圖4A）。

腫瘤組織切片的HE染色結(jié)果顯示， 來自Rag1-/-和Rag2-/-小鼠上的移植腫瘤組織和其他品系小鼠上的移植腫瘤組織切片沒有顯著差異，各組小鼠腫瘤細胞均生長旺盛，腫瘤細胞大小不一，胞核形態(tài)比較類似，可見瘤組織均呈巢狀或片狀生長，細胞間微血管較豐富（圖4B）。

這些結(jié)果表明，Rag1-/-和Rag2-/-小鼠相較于傳統(tǒng)的異源腫瘤移植受體小鼠品系BALB/c Nu裸小鼠和NOD-SCID小鼠，腫瘤生長速度更快。

圖4 不同背景小鼠接種A549腫瘤細胞成瘤性結(jié)果

3 討論

本實驗室通過基因工程改造的方法，分別獲得了C57BL/6J×129S1背景的Rag1基因缺失和Rag2基因缺失小鼠； 后續(xù)的表型分析結(jié)果顯示，Rag1或Rag2基因缺失純合子小鼠外周血中T細胞和B細胞顯著降低， 與已有文獻［11，12］報道一致； 外周血中T細胞和B細胞的含量與市場上銷售的NOD-SCID小鼠相類似（圖3）， 這也從另一方面驗證了Rag1和Rag2基因缺失小鼠確實發(fā)生了Rag1和Rag2的功能缺失。

在本研究中，通過接種人源腫瘤細胞株A549細胞，表明A549細胞可以在作者構(gòu)建的Rag1和Rag2基因缺失小鼠皮下成瘤，且生長速度快于對照的NOD-SCID和BALB/c裸小鼠（圖4）。這說明，與文獻報道一致［14］，作者構(gòu)建的Rag1和Rag2基因缺失小鼠可以作為外源腫瘤移植的受體，而且對于A549細胞而言， 兩種基因缺陷小鼠比較NOD-SCID和BALB/c裸小鼠具有更好的成瘤效果。此外，作者也在Rag1-/-和Rag2-/-小鼠中嘗試移植了病人來源的肝癌腫瘤組織塊，結(jié)果顯示移植腫瘤組織塊也可以在Rag1-/-小鼠和Rag2-/-小鼠上生長成瘤（數(shù)據(jù)未顯示），這均表明了這兩種品系小鼠作為外源腫瘤移植受體具有良好的成瘤性。

在設計策略上， Rag1基因缺陷小鼠是將loxp-EGFP-PolyA-loxp序列定點插入到了翻譯起始密碼子ATG的AT堿基之后，AT-loxp-EGFP形成了一個完整的EGFP融合蛋白表達框； Rag2基因缺陷小鼠是將loxp-EGFP-PolyA-loxp序列定點插入到了翻譯起始密碼子ATG上游10 bp位置。兩個小鼠的設計策略，EGFP的表達均受內(nèi)源性Rag1和Rag2基因啟動子的驅(qū)動，因此可通過EGFP的熒光表達，用于對Rag1和Rag2基因的表達部位和表達強度進行示蹤。同時，EGFP-polyA元件兩端loxp位點的添加，使得Cre作用后還可以恢復原來缺失的Rag1和Rag2基因的表達，因此這兩種小鼠模型和淋巴細胞特異性Cre或者Cre/ERT2小鼠配合使用， 可用于時空特異性觀察Rag1和Rag2缺失后恢復對淋巴細胞發(fā)育以及功能的影響。值得關(guān)注的是， Rag1、Rag2基因缺陷小鼠因免疫系統(tǒng)缺陷， 近年來也被用于構(gòu)建人源化肝臟小鼠模型［15］， 制備病毒感染小鼠模型［16］和研究腸道菌群［17］等方面。作者的后續(xù)研究，將對該模型小鼠在這些方面的應用作進一步探討。

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Generation of Rag1 and Rag2 Deficient Mice and Their Application in Tumor Xenograft

SHEN Ru-ling1，2， SHI Jia-hao1， SHENG Zhe-jin1， FENG Xiao-long2， WU Wen-ting2， FEI Jian1，2
（1.School of Life Science and Technology， Tongji University， Shanghai 200092， China；
2.Shanghai Research Center for Model Organisms， Shanghai 201210， China）

Objective To establish recombination-activating genes， Rag1， Rag2 deficiency mouse models and study the possibility as tumor xenograft recipients.Methods The traditional embryonic stem （ES） cell targeting and blastocyst microinjection were performed to develop the Rag1 and Rag2 deficiency mouse models.The flow cytometry assay was conducted to analyze the T/B lymphocyte contents in peripheral blood.The tumorigenicity on different immunodeficiency mouse strains was assessed by exogenous tumor cell transplantation experiment.Results Rag1 and Rag2 deficiency mouse models were established.The T/B lymphocytes of peripheral blood in two strains of homozygous mutant mouse models were significantly reduced compared with those of wild type mice.A549 tumor cells had stronger tumorigenicity in Rag1， Rag2 mutant mice than that in BALB/c nude mice and NODSCID mice.Conclusion Rag1， Rag2 deficiency mouse models were successfully developed.Two mouse models display serious immune system defects， which could be used as exogenous tumor transplant recipients to establish tumor model.

Recombination-activating genes （Rag1 gene）； Rag2 gene； Gene defect； Immunodeficiency

Q95-33

A

1674-5817（2016）04-0263-07

10.3969/j.issn.1674-5817.2016.04.004

2016-03-10

上海市科委科研計劃項目（14431904600，13DZ2280600）

沈如凌（1981-）， 女， 助理研究員， 研究方向： 腫瘤學。E-mail： alieen_shen@163.com

費儉， 男， 教授， 研究方向： 基因功能的模式生物研究。E-mail： jfei124@126.com