任世英，　邵　奎，　李　雯，　張　威，　劉　飛

1. 淮陰工學(xué)院生命科學(xué)與食品工程學(xué)院， 江蘇 淮安 223003；2. 淮陰工學(xué)院化學(xué)工程學(xué)院， 江蘇 淮安 223003；3. 江蘇省生物質(zhì)轉(zhuǎn)化與過程集成工程實驗室， 江蘇 淮安 223003

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一株耐高溫纖維素酶產(chǎn)生菌的分離和鑒定

任世英1，3，邵奎1，李雯1，張威1，劉飛2*

1. 淮陰工學(xué)院生命科學(xué)與食品工程學(xué)院， 江蘇 淮安 223003；2. 淮陰工學(xué)院化學(xué)工程學(xué)院， 江蘇 淮安 223003；3. 江蘇省生物質(zhì)轉(zhuǎn)化與過程集成工程實驗室， 江蘇 淮安 223003

為獲得耐高溫的纖維素酶產(chǎn)生菌，從農(nóng)田旁稻草堆底取樣，采用液體濾紙條試管法和纖維素剛果紅平板法，分離到6株能夠在45 ℃生長良好且降解纖維素的耐高溫菌株，分別標(biāo)為A1-A6，其中菌株A1透明圈直徑和菌落直徑比值為4，DNS法測定還原糖濃度較高，確定為實驗菌株。菌體呈短桿狀，G+，易褪色，具有運(yùn)動性，過氧化氫酶、淀粉水解、明膠液化、甲基紅試驗、硫化氫、葡萄糖氧化發(fā)酵、PHB類脂粒、異染粒、纖維素分解、反硝化試驗呈陽性，乙酰甲基甲醇試驗、吲哚試驗、硝酸鹽還原試驗、卵磷脂酶實驗呈陰性，以FPA酶活為主，羧甲基纖維素酶活為輔。根據(jù)細(xì)菌形態(tài)、生理生化特征，參照《伯杰氏細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》初步鑒定為纖維單胞菌屬，即Cellulomonas。

纖維素酶產(chǎn)生菌； 纖維素； 耐高溫； 纖維單胞菌屬

纖維素是地球上最豐富的有機(jī)物質(zhì)，是木材、紙張、棉、麻和農(nóng)副產(chǎn)品的主要成份，是人類最經(jīng)濟(jì)、最廣泛的自然資源[1,2]。纖維素酶(cellulase)又稱纖維素酶系，是一類復(fù)雜的復(fù)合物，是所有參與降解纖維素并將其最終轉(zhuǎn)化為葡萄糖的各種酶的總稱[3]。纖維素酶最初是在蝸牛的消化液中發(fā)現(xiàn)的，除了已知的許多微生物能分泌纖維素酶外，一些高等動植物也能分泌[4]。微生物產(chǎn)纖維素酶研究較多，已發(fā)現(xiàn)許多真菌和細(xì)菌都能分解利用纖維素，目前用于研究生產(chǎn)纖維素酶的微生物大多屬于真菌，其中研究較多的是木霉屬、曲霉屬、青霉屬、根霉屬和漆斑霉屬。細(xì)菌、放線菌由于分泌的纖維素酶活性較低且胞外分泌型較少相對研究不多[5]。

纖維素酶在工業(yè)中有很大的實用價值?？纱呋w維素水解，成為低聚合度纖維素和葡萄糖?？衫盟牙w維素發(fā)酵制糖、酒精和食品。用于飼料添加劑，可破解植物細(xì)胞壁，提高飼料利用率。在紡織工業(yè)中用于牛仔服的生物水洗，代替?zhèn)鹘y(tǒng)的石磨工藝；用于棉布的酶減量處理，使織物手感厚實柔軟；用于棉麻織物可除去織物表面的毛羽，使外觀光潔，減少刺癢感；可增大纖維素?zé)o定形區(qū)，提供良好的染色條件[6,7]。用于中草藥可提高其有效成分的提取?？梢蕴岣呔坪推渌勗飚a(chǎn)品的產(chǎn)率。還可用于蔬菜汁或果汁的生產(chǎn)[8]。開發(fā)新型的耐高溫纖維素酶產(chǎn)生菌，并揭示其所產(chǎn)酶的催化特性和熱穩(wěn)定性機(jī)制等，具有重要的理論意義和潛在的應(yīng)用價值。

本文從稻草堆肥中篩選出6株耐高溫纖維素酶產(chǎn)生菌，通過酶活力比較，選定其中1株作為實驗菌株，并對其生長特性、生理生化特性進(jìn)行研究，最后進(jìn)行菌種鑒定，為耐高溫纖維素酶產(chǎn)生菌的研究提供新材料，為耐高溫纖維素酶的工業(yè)應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1樣品來源

農(nóng)田旁陳舊性稻草堆底。

1.1.2培養(yǎng)基[6]

剛果紅纖維素培養(yǎng)基(纖維素酶產(chǎn)生菌初篩)：KH2PO40.5 g、MgSO40.25 g、瓊脂粉20 g、纖維素粉1.88 g、剛果紅0.20 g、蒸餾水1 000 mL、pH 7.0。

種子培養(yǎng)基：復(fù)合蛋白胨10 g、葡萄糖10 g、酵母膏10 g、pH 7.0、蒸餾水1 000 mL，121 ℃滅菌20 min。

液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基：稻草4 g、麩皮l g、(NH4)3PO4營養(yǎng)液((NH4)3PO42.06%、MgSO4·7H2O 0.05%、KH2PO40.01%) 200%(V/W))12.5 mL、調(diào)pH至6.0～7.0、蒸餾水1 000 mL，121 ℃滅菌20 min。

保藏培養(yǎng)基：羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)5 g、蛋白胨5 g、KH2PO41 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、酵母粉0.5 g、瓊脂粉20 g、pH自然、蒸餾水1 000 mL，121 ℃滅菌20 min。

濾紙條培養(yǎng)基：于10 mL試管中加入無機(jī)鹽溶液5 mL，加1條定量濾紙條(9 cm×1 cm)，垂直立于試管中，并使一部分露出液面，加棉塞，于121 ℃滅菌20 min備用。

高氏1號培養(yǎng)基：可溶性淀粉20 g、KNO31 g、NaCl 0.5 g、K2HPO40.5 g、MgSO40.5 g、FeSO40.01 g、瓊脂20 g、水1 000 mL、pH 7.2～7.4，于121 ℃滅菌20 min。

1.2方法

1.2.1耐高溫纖維素酶產(chǎn)生菌株的篩選

1.2.1.1菌株的初篩

將采集的含菌樣品放入三角瓶，加入50 mL無菌水和少量無菌玻璃珠，振蕩混勻后靜置，吸取上清液進(jìn)行10-1、10-2、10-3、10-4、10-5和10-6梯度稀釋，取10-5和10-6稀釋液各100 μL涂布于剛果紅纖維素培養(yǎng)基平板，45 ℃恒溫培養(yǎng)2 d，挑取透明圈明顯的菌落，再于平板上劃線分離，重復(fù)3次，挑單菌落接種于濾紙條培養(yǎng)基，45 ℃恒溫培養(yǎng)2 d，選出透明圈直徑與菌落直徑比值大的菌株進(jìn)行復(fù)篩。

1.2.1.2菌株的復(fù)篩

將初篩得到的單菌落接種于種子培養(yǎng)基，測定發(fā)酵液中還原糖含量，將還原糖濃度高的菌株接種于液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基，三個平行，45 ℃，130 r/min，搖床振蕩培養(yǎng)48 h，測定粗酶液的CMC酶活力和濾紙酶活力，選擇CMC酶活力和濾紙酶活力較高的菌株為實驗菌株。

1.2.2酶活測定[8]

1.2.2.1葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

原理：3，5-二硝基水楊酸(DNS)與還原糖共熱后被還原成棕紅色的氨基化合物，在一定范圍內(nèi)還原糖的量和反應(yīng)液的強(qiáng)度成比例關(guān)系，利用分光光度計測出其在540 nm處的吸光度，得出還原糖的量。

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：將葡萄糖置于110 ℃烘箱中烘2 h至恒重，稱取0.108 g，溶解并定容至100 mL。

取14支具塞試管，依次編號為0，1，2，3，4，5和6并作平行實驗。由于反應(yīng)體系總體積不同，所以需作不同標(biāo)準(zhǔn)曲線，所加的量也有所不同，現(xiàn)以總體積為9 mL體系為例：

表1　葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

搖勻后置于沸水浴中加熱5 min，冷卻定容至25 mL，搖勻后以0號管為對照，測定OD540值，以葡萄糖含量(μmol/mL)為橫坐標(biāo)，OD540值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[9]。

1.2.2.2粗酶液制備

將菌種由培養(yǎng)斜面接種到50 mL(裝于250 mL錐形瓶)種子培養(yǎng)基，45 ℃，130 r/min搖床振蕩培養(yǎng)24 h，按2%的接種量加入到100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基(裝于500 mL錐形瓶)，45 ℃，130 r/min搖床振蕩培養(yǎng)48 h，5 000 r/min離心10 min，所得上清液即為粗酶液。

1.2.2.3羧甲基纖維素鈉鹽(CMC-Na)酶活性測定

原理：纖維素酶對CMC-Na有降解能力，生成葡萄糖等還原糖，再用DNS法顯色，用標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液作標(biāo)準(zhǔn)液，在540 nm處測其吸光度，以每分鐘生成相當(dāng)于1 μmol的葡萄糖為一個酶活單位(1 U/mL)[10]。

取3支帶有20 mL刻度的試管，1支管作空白對照，2支管作平行樣品管。每支樣品管中加1 mL粗酶液，置于50 ℃水浴鍋中預(yù)熱2 min，然后在3支試管中分別加入4 mL已預(yù)熱至50 ℃的底物溶液，反應(yīng)5 min取出，每管立即分別加入1 mL 2 mol/L氫氧化鈉溶液和2 mL DNS顯色液，搖勻后在對照管中再加入1 mL粗酶液。將3支試管放入沸水浴中，5 min后立即取出，流水冷卻，用蒸餾水定容至20 mL，于540 nm處測OD值。

酶活力計算：從標(biāo)準(zhǔn)曲線中查出葡萄糖μmol數(shù)。

其中：5為酶與底物作用時間(min)；Ew為粗酶液的體積(mL)；U是指在特定條件下，每分鐘催化纖維素水解成1 μmol葡萄糖的酶量[6]。

1.2.2.4濾紙酶活力(FPA)的測定[11]

濾紙是聚合度和結(jié)晶度都居“中等”的纖維性材料，以其為底物經(jīng)纖維素酶水解后生成還原糖的量來表征纖維素酶系總的糖化能力的方法，此方法應(yīng)用廣泛，它反映了三類酶組分的協(xié)同作用，統(tǒng)稱濾紙酶活[10-12]。

取1 mL稀釋10倍的粗酶液，加入l mg濾紙條、1 mL pH 5.0的檸檬酸緩沖溶液于55 ℃保溫60 min，再加入3 mL DNS試劑，于沸水中煮15 min，采用DNS法測定OD540，對查葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，以每分鐘酶液產(chǎn)生1 μmol還原糖所需的酶量為一個酶活單位(1 U/mL)。

其中：B為從標(biāo)準(zhǔn)曲線中查得的凈葡萄糖量(μmol)；n為粗酶液稀釋倍數(shù)；Ew為測定時吸取稀釋粗酶液毫升數(shù)(mL)；t為酶與底物作用時間(min)。

1.2.3生長曲線繪制

發(fā)酵培養(yǎng)過程中，每隔2 h取培養(yǎng)液，測定其OD600，繪制生長曲線。

1.2.4菌種鑒定

對分離純化的菌株進(jìn)行形態(tài)觀察和生理生化測試，參照《伯杰氏細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》第八版及相關(guān)文獻(xiàn)，初步對菌株進(jìn)行鑒定。

2　結(jié)果與討論

2.1耐高溫纖維素酶產(chǎn)生菌株的篩選

通過初篩，挑出6株能在纖維素-剛果紅瓊脂培養(yǎng)基上產(chǎn)生明顯透明圈的菌株，標(biāo)記為A1-A6，透明圈直徑、菌落直徑和其比值見表2，由表2可知A1菌株的透明圈直徑和菌落直徑比最大，一般認(rèn)為具有較高纖維素酶活性的菌株在平板上能較快地產(chǎn)生較大的透明圈。6株耐高溫纖維素酶產(chǎn)生菌，其菌落特征、細(xì)胞形態(tài)和革蘭氏染色結(jié)果見表3，菌落多為白色、不透明，桿狀居多，全部為革蘭氏陽性菌。通過測定發(fā)酵液中還原糖含量(表4)進(jìn)行復(fù)篩，得知菌株A1的酶活力最高，達(dá)到0.0914 U/mL。結(jié)合其他特征最終確定菌株A1為實驗菌株[13,14]。

表2　6株耐高溫纖維素酶產(chǎn)生菌透明圈直徑和菌落直徑比

表3　6株耐高溫纖維素酶產(chǎn)生菌的菌落和個體形態(tài)特征

表4　還原糖濃度測定

2.2菌株A1生長曲線

由菌株A1的生長曲線(圖1)可見，0 h ～12 h處于停滯期，12 h ～20 h處于對數(shù)生長期，22 h菌株達(dá)到最大生長量，OD600約為1.2，隨后進(jìn)入穩(wěn)定期，維持較長穩(wěn)定期，對于纖維素酶的產(chǎn)生有利。

圖1　菌株A1的生長曲線

2.3菌株A1產(chǎn)酶活性測定

2.3.1葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

通過配置一系列不同濃度的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，利用DNS法對其在540 nm下的吸光度進(jìn)行測量，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到方程為：y=0.123 4x+0.005 6，R2=0.995，表明OD540和葡萄糖濃度之間呈很好的線性關(guān)系，通過該方程可計算出溶液中葡萄糖的濃度。

2.3.2菌株A1產(chǎn)酶活性特點(diǎn)

通過CMC-Na和FPA兩種方法測定菌株A1所產(chǎn)纖維素酶活性(圖2)。在CMC-Na方法中，4 h有酶產(chǎn)生，可測到酶活，24 h酶活達(dá)到最高，隨后酶活緩慢下降；FPA方法中，4 h可測到酶活，16 h達(dá)到最高，隨后下降，到20 h后幾乎保持不變。FPA法測得酶活比CMC法測得酶活高，因為纖維素酶是由多種酶組成的混合酶系，不同組分的酶相互協(xié)同有利于提高纖維素酶的活力，推測A1產(chǎn)生的纖維素酶一般以FPA酶活為主，CMC酶活為輔[15]。

圖2　菌株A1產(chǎn)酶特性

2.4菌種鑒定

2.4.1形態(tài)觀察

在高氏1號培養(yǎng)基中插片取樣，經(jīng)顯微鏡觀察，菌絲呈綠色絲狀分枝。菌株A1在剛果紅纖維素培養(yǎng)基表面氣生菌絲呈白色蔓延，菌落呈灰白色同心圓形、邊緣不整齊、齒狀、表面光滑濕潤、不透明。在高氏1號培養(yǎng)基表面菌株周圍呈黃綠色，菌落背面呈黃褐色。在顯微鏡下菌體呈短桿狀，革蘭氏染色呈陽性，但易褪色。

2.4.2生理生化鑒定

菌株A1的生理生化特性如表5所示。

表5　菌株A1的生理生化特征

注：“+”表示為陽性，“-”表示為陰性

根據(jù)菌落及菌體形態(tài)，結(jié)合生理生化鑒定結(jié)果，查閱《伯杰氏細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》(第八版)將菌株A1初步鑒定為纖維單胞菌屬，即Cellulomonas。

3　結(jié)論

細(xì)菌纖維素酶產(chǎn)量較低，而且其所產(chǎn)纖維素酶主要為葡聚糖內(nèi)切酶，大多數(shù)對結(jié)晶纖維素沒有降解活性，且所產(chǎn)生的酶是胞內(nèi)酶或吸附在細(xì)胞壁上，不分泌到培養(yǎng)液中，增加了提取純化的難度，所以工業(yè)上很少采用細(xì)菌作為生產(chǎn)菌種[16,17]。但是細(xì)菌產(chǎn)生的纖維素酶除了傳統(tǒng)的內(nèi)切、外切纖維素酶外，還會分泌一種纖維小體到胞外，這種纖維小體由多種纖維素酶和半纖維素酶組成，具有較高的水解纖維素的能力，在纖維素廢棄物的處理上具有很大的應(yīng)用潛力。

本研究同時采用液體濾紙條試管法和纖維素剛果紅平板法，從稻草堆底篩選到耐高溫纖維素酶產(chǎn)生菌株A1，通過其產(chǎn)酶特點(diǎn)、細(xì)菌形態(tài)、生理生化特征初步鑒定為纖維單胞菌屬，即Cellulomonas。該屬中的菌為革蘭氏陽性，易褪色。常以一根或少數(shù)鞭毛運(yùn)動。不生孢子，不抗酸。兼性厭氧，有的菌株在厭氧條件下可生長但很差。在蛋白胨-酵母膏瓊脂上的菌落通常凸起，淡黃色?；墚愷B(yǎng)菌，可呼吸代謝也可發(fā)酵代謝。從葡萄糖和其他碳水化合物在好氧和厭氧條件下都產(chǎn)酸。接觸酶陽性。能分解纖維素。還原硝酸鹽到亞硝酸鹽。最適生長溫度30 ℃。廣泛分布于土壤和腐敗的蔬菜[18,19]。模式菌株為產(chǎn)黃纖維單胞菌(Cellulomonasflavigena)。菌株A1的透明圈直徑與菌落直徑比為4，對纖維素有很好的降解能力，能夠在45 ℃環(huán)境以上生長，推測它在堆肥的高溫階段分解纖維素等復(fù)雜化合物，對堆肥的最終成熟起關(guān)鍵作用[20,21]。菌株A1能夠在45 ℃的高溫下生長，同時產(chǎn)生纖維素酶，為其在高溫條件下進(jìn)行應(yīng)用提供了可能?？梢酝ㄟ^分子生物學(xué)手段對其進(jìn)行鑒定，應(yīng)用基因工程技術(shù)來改造菌種，克隆表達(dá)高活性、高穩(wěn)定性、高產(chǎn)量的纖維素酶也是一個研究的熱點(diǎn)趨勢。

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Isolation and identification of high temperature resistant bacterium for producing cellulase

REN Shi-ying1, 3, SHAO Kui1, LI Wen1, ZHANG Wei1, LIU Fei2

1. School of Life Science and Food Engineering, Huaiyin Institute of Technology, Huaian 223003, Jiangsu, China; 2. Faculty of Chemical Engineering, Huaiyin Institute of Technology, Huaian 223003, Jiangsu, China; 3. Jiangsu Provincial Engineering Laboratory for Biomass Conversion and Process Integration, Huaiyin Institute of Technology, Huaian 223007, Jiangsu, China

In order to obtain high temperature resistant strains producing cellulase for the application in the high-temperature industrial cellulose degrading field, filter paper disintegration and CMC-Congo red staining were used to initially screen the cellulose-degrading strains at 45 ℃. 6 target strains were isolated from piles of rice straw in farmland and temporarily marked as A1～A6. A1 was chosen as experimental strain owning to its higher ratio with 4 of clear circle diameter to colony diameter and higher reducing sugar concentration, which was short rod, G+and easily fade, motile. Test results such as catalase, amylolysis, gelatin liquefaction, methyl red test, hydrogen sulfide production, glucose fermentation, PHB, metachromatic granule staining, cellulose degradation, denitrification test were positive. Test results such as Voges-Proskauer test, indole test, nitrate reduction test, lecithinase were negative. The enzyme property produced by strain A1 showed its major enzymatic activity was CMC and secondary FPA. According to its enzymatic activity, cell and colony morphology, physiological and biochemical properties, strain A1 was preliminarily classified as genusCellulomonas.

cellulase-producing bacterium; cellulose; high temperature resistant;Cellulomonas

10.3969/j.issn.1001-6678.2016.04.004

國家自然科學(xué)基金項目(51308245)；江蘇省淮安市科技計劃項目(HAN2015026)；江蘇省生物質(zhì)轉(zhuǎn)化與過程集成工程實驗室開放課題(JPELBCPL2013004和JPELBCPL2014006)。

任世英(1980～)，女，博士。E-mail:rsy1314@163.com。

劉飛，男，博士。E-mail:hyitliu@163.com。